Yöntem makalesi

Bir Şok Grid Kullanımı olmadan Kemirgen Egzersiz Endurance Değerlendirilmesi: Zorla Egzersiz Alternatif Bir

19.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/51846

⸱

14 Ağustos 2014

 ,  , 
1Research Service, VA Puget Sound Health Care System, 2Seattle Institute for Biomedical and Clinical Research, 3Division of Gerontology and Geriatric Medicine, Department of Medicine, University of Washington, 4Geriatric Research, Education, and Clinical Center, VA Puget Sound Health Care System

Bu makalede

Özet

Laboratuvar farelerinde şok ızgarası kullanılmadan egzersiz dayanıklılığını değerlendirmek için bir yöntem gösterilmiştir. Bu yöntem, stresin deneysel parametreler üzerindeki kafa karıştırıcı etkilerini azaltabilen insancıl bir iyileştirmedir.

Özet

Laboratuvar fare modelleri kullanarak, dayanıklılık egzersiz metabolik yararları sorumlu moleküler yollar tanımlanabilir başlıyor. Farelerde egzersiz dayanıklılık değerlendirmek için en yaygın yöntem bir şok ızgara ile donatılmış motorlu bir koşu bandı üzerinde çalışan zorla kullanmaktadır. Çalışan çıkın Hayvanlar bir elektrikli ayak şoku bir ızgara üzerine hareketli koşu bandı kemer tarafından itilir; Negatif uyaran kaçmak için, fareler, kayış üzerinde çalışan döner. Ancak, şok cihazının kullanımı kaçınma ve psikolojik stres çalışan dayanıklılık nicelendirilmesi, hem de egzersiz sonrası serum hormon ve sitokin seviyeleri ölçümleri etkilemesi engelleyebilir. Burada, göstermek ve bir şok ızgara kullanan olmadan bir motorlu koşu bandı üzerinde naif C57BL / 6 laboratuvar fareleri çalışan dayanıklılığı ölçmek için zarif bir yöntem doğrulamak. Farenin koşu bandı için preacclimated, bunlar yürüyüşü ile gönüllü çalışacak her mous özgü hızlarıör. Şok ızgara kullanımı fare bölümünde çalıştırmak için gönüllü istekli hassasiyet ile birleştiğinde bir dil basacağı, kullanan bir operatör tarafından nazik teşviki ile değiştirilir. Zaman-to-tüketilmesi, her fare için çalışan ölçülmesi için net uç noktaları tanımlanır ve bu yayvan duruş ve zor nefes alma gibi yorgunluktan davranışsal belirtileri yansıtılır. Bu yöntem aynı zamanda deneysel parametrelerin stres karıştırıcı etkilerini azaltır insani bir arıtma olduğunu.

Giriş

Obezite, insülin direnci ve tip 2 diyabet ABD ve dünya çapında nüfus 1-4 hem sağlığı üzerinde derin etkilere neden birbiriyle metabolik bozukluklar vardır. Dayanıklılık önleyebilir idman, yanı sıra tedavi, bu şartlar, 5,6. Ayrıca, yürüme hızı ve dayanıklılık değerlendirilmesi insan denekler 7 klinik olarak tanı Düşkünlük, sarkopeni testleri ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi diğer hastalıkların sonuçlarını kullanılmaktadır.

Vücut kompozisyonu ve insülin duyarlılığına dayanıklılık egzersiz yararlı etkileri altında yatan biyokimyasal yollar gelişmiş veya egzersiz kapasitesi 8-11 azaltılabilir görüntüleyebilen genetik veya farmakolojik değiştirilmiş fareleri kullanarak, aydınlatılamamıştır başlıyor. Ancak, birçok tür çalışmalar 8-11 çalıştırmak için fareler zorlamak için şok ızgara ile donatılmıştır motorlu koşu bandı kullanmıştır. Çalışan çıkın Hayvanlar itilirBir elektrik ayak şoku, bir ızgara üzerinde hareket eden kayış bandı; Negatif uyaran kaçmak için, fareler, kayış üzerinde çalışan döner. Bu tür prosedürler deneysel parametreleri 12 etkileyen faktörler olarak psikolojik stres ve kaçınma davranışlarını tanıtmak olabilir. In kafes tekerlek çalışan bir ışın kırılma cihazı veya kantitatif kullanılarak bu ayaktan etkinliğinin miktarının belirlenmesi ve ölçüm dayanıklılık için diğer yöntemler, sirkadyen sikluslarda, anksiyete, istenmeyen eğitim veya yiyecek davranış 12-16 arayan modülasyonu ile şaşırtıcı olabilmektedir. Ayrıca, bu işlemler tek konut, fareler için psikolojik stres başka bir kaynak gerektirir. Bu nedenle, stres tarafından eleştirilmiştir, egzersiz dayanıklılık doğrudan ölçüm gereklidir.

Bu endişeleri gidermek için, bizim laboratuvar geliştirdik ve maksimal koşu kapasitesini değerlendirmek için bir yöntem valide ve equi bir motorlu koşu bandı kullanarak eğitimsiz, naif farelerde hız çalışan korumuşturBir şok ızgara ile pped. Şok ızgara olarak ikamet çalışan kayış, sonunda alanı, daha sonra geri kalan fareler için bir platform olur ve aparat uzaklaştırılana kadar oturmak çalıştırmak için çöp fareler için bir yer sağlar. Fareler nazik vurma kullanarak veya fare bölümünde çalıştırmak için gönüllü istekli hassasiyet ile birleştiğinde bir dil basacağı, dokunmanın insan bir gözlemci tarafından çalıştırmak için teşvik edilmektedir. Bu yöntem, kas kaynaklı sitokin interlökin-15 (IL-15) 16,17 ekspresyonu açısından farklılık genetik olarak modifiye edilmiş ve kontrol C57BL / 6 fareleri arasındaki egzersiz dayanıklılık farkları değerlendirmek için kullanılmıştır. Bu yöntem bir şok ızgara kullanımından kaynaklanan negatif takviye karıştırıcı etkilerini azaltan bir insani arıtma olduğunu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Burada açıklanan prosedür VA Puget Sound Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış, ve Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı ILAR Kılavuzu ile uyumludur edildi.

1. Deneysel Hazırlık

  1. Kan ya da eğer öyleyse egzersiz gerekli ve kısa bir süre sonra doku toplama, bu prosedürlerin iletimi için egzersiz sonrası aralığını belirlemek önceden karar verin. Örnekler dolaşım (kan toplama gerektiren) içine egzersiz kaynaklı hormon ya da sitokin salınımının belirlenmesi bulunur, ilgi (gerektiren doku toplama ardından ötenazi) mRNA türlerinin egzersiz kaynaklı ifade belirlenmesi. Hemen sonrasında egzersiz kan veya doku toplama belirtiliyorsa, prosedür odasında taraftan bu işlemler için malzeme var. Kurumsal inceleme kurulu onayı alma ve düzenleyici kurallara göre gerçekleştirmek. Tüm deneyler egzersiz sonrası kan ya da doku Collecti gerektirmezile; çalışan dayanıklılık basit bir karşılaştırma gerekli tüm olabilir.
  2. Fareler için deney grupları ve egzersiz sonrası prosedürleri hakkında önceden karar (yukarıdaki açıklamaya bakınız).
  3. Bu prosedüre çalışan denemeler sırasında adanmış bir sessiz bir odada sağlam bir masanın üzerine koşu bandı yerleştirin.
  4. Fare ölçekli şeritleri ve protokole uygun bir eğimle koşu bandını ayarlayın. 5 o eğimi yokuş aşağı çalışma esnasında meydana gelir (daralma olarak, aynı zamanda, kas uzatma) eksantrik egzersize bağlı kas hasarı engellemek için kullanılmaktadır.
  5. Dışkı yakalamak için koşu bandı kemer altına emici bir yastık yerleştirin.

Koşu Bandı ile Fareler 2. Acclimation

Farelerin bir "sedanter" (hayır egzersiz) grubu gerekli olup olmadığına karar ve adımları 2.1 belirtildiği gibi çalışan olmadan koşu bandı sedanter fareler maruz - 2.5. 2 veya 4 deney grupları gerekli olup olmadığını belirlemek,. örneğin, Sedanter / Egzersiz (2 grup); Tedavi Tutardaki icra Kontrolleri / (2 grup, hiçbir sedanter hayvanlar); ya da, sedanter / Tutardaki x Kumanda / Arıtma (4 grup). "Tedavi" bir transgenik veya nakavt genotip, bir farmakolojik rejimi, özel bir diyet veya diğer deneysel müdahale olabilir.

  1. 2 saat - fare 1, kafes arkadaşları ile onun taşınan evde kafes içinde prosedür odasına gelmesini bekleyin.
  2. Tek bir fare ve rekor etiket numarasını seçin; fare ve kayıt ağırlığını tartın.
  3. Motorsuz koşu bandı yerleştirin fare, iklimlendirme için yaklaşık 5 dakika döndü. Koşu bandı kemer çalışmazken, Açma ve fare başka bir 5 dakika boyunca makine gürültüsü gelmesini sağlar.
  4. (Bkz Not 2) bu noktada koşu bandı ve kafes onları geri dönmek veya deneysel tasarım başına egzersiz sonrası işlemleri yürütmek; (Not 1 kullandıysanız) "sedanter" gruplarında fareler kaldırmak.

3. Run-to-Tükenme testi Başlangıç

  1. Alışmadan sonra, platform üzerinde düşük bir hızda (10 m / dak) hayvan kemerini keşfetmek zaman ve değil kemerini açın.
  2. Yavaşça dokunun veya koşu bandı ve kaçak kalmak için isteksiz hayvanları teşvik etmek için bir dil basacağı, bir-üç kez, birlikte fare kıç kaldırın.
    NOT: Çoğu farenin kolayca çalışacaktır, ama bazen kısa sürelerle durdurmak. Bu durumda, yumuşak dokunun veya akan yeniden başlamasını teşvik etmek için hayvanın arka kaldırma basacağı dil kullan. Genellikle, farenin dil basacağı ile dokundu olmak gerekmez; dil ile eli fark basacağı kendilerine doğru gelen farenin biraz daha çalışmasına neden olur.
  3. Fare 10 m / dak hızında çalışan ilk kez laboratuar zaman ölçeri başlat.
  4. Fare bandın üst (yokuş yukarı ucunda) olduğu zaman, 1 m / dakika, yaklaşık her 2 dakika artışlarla, yavaş yavaş hız çevirin.
  5. Için hızını kısınÖnceki ayar fare defalarca öbekler halinde değil, sabit bir hızda çalışıyorsa.
  6. Maksimal belirleyin, her fare hızından sürekli (genellikle 14 - 17 m / dak C57BL / 6 fareler için) hızını ayarlayarak ve fareyi izleyerek. Bu hızı kaydedin.
    NOT: koşu bandı üzerinde hayvanın konumu daha yüksek bir hızda çalıştırmak için hayvanın istekli olarak araştırmacı işaret eder. Fare kadar (yokuş yukarı) sonunda ve duvar çalıştırmak üzere ise, daha yüksek bir hızda çalıştırmak için hazırdır. Fare bandı ortasında sabit bir hızda çalışıyorsa maksimal hızda olabilir veya kaçak kalitesine bağlı olarak, daha fazla ayarlanması gerekebilir.

4. Uç noktalar ve Fareler Durdur

  1. Dilini kullanmak basacağı hafifçe dokunun veya çalışan yeniden başlamasını teşvik etmek, durdurmak hayvanların kıç kaldırmaya (bkz 3.2 Not). Çalışan geçici kesintiler için zamanlayıcı bitmiyor.
  2. Belirleyin ve removçalıştırmak reddediyorum e farenin. Veri tablosunda bu unutmayın. Sizin deneysel tasarım bağlı, çöp farenin farklı bir gün yeniden test edilebilir
    NOT: Bazı farenin tamamen çalışma reddeder. Bu tür farenin sonra damat ya da "pedal", yani, platform üzerinde oturmak ve bant üzerinde ön ayaklarını kullanmayı durdurun, öbekler halinde çalışacaktır. Hayvanın altında dikilmiş dört ayak dil basacağı ile koşu bandı üzerine geri itilmesini engellemek için bu farelerin duruş, kambur olduğunu. Bazen bir fare dil ısırma basacağı bir kaçış yolu olarak tırmanırken, basacağı çalıştırmak için isteksiz dil karşı saldırgan olur. Bu fare ya da olmaz, aday olup davanın ilk 5 dakika içinde açıktır. Analizinden çalıştırmak reddediyorum, ama "sedanter" fareler gibi onları sayılmaz fareler kaldırmak.
  3. Bitkin fareler belirlenmesi ve Sayacı durdurmak.
    NOT: Yorgunluk, birbirini izleyen üç durak ve yeniden ret ile tanımlanırSume nazik teşviki, artı, zor nefes alma ve yayvan duruş olarak tüketilmesi fiziksel belirtilerine karşın çalışıyor. Fareler 30 dakika 60 içinde yorgunluğunu.
  4. Zaman toplam miktarını kaydedin tüm hızlarda çalışan geçirdi.
  5. Deneysel tasarım bağlı olarak, ya fare kafesine için dönmek, ya da kurumsal kurallarına göre kan veya doku toplama gibi acil egzersiz sonrası işlemleri yürütmek.
  6. Önceki fare kokusu test sonraki farelerin davranışını etkilemez böylece her fare test ettikten sonra bir antiseptik mendil temiz kemer silin.
  7. Bir sonraki fare sınayın. Taze bir dil kullanın basacağı her fare için. Aynı kafes içinde bulunan fareler prosedür odasının ilave ortama alıştırma olmadan aynı günde ardışık olarak test edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Egzersiz dayanıklılığını ölçmek için olan bu işlem tam olarak sitokin IL-15 16,17 ekspresyonunda farklı C57BL / 6 farelerinin farklı ırklarının moleküler ve metabolik profil yansıtır. IL-15 (IL-15 Tg fareleri) bileşimleri belirgin yavru kontroller ile karşılaştırıldığında çalışma için tüketilmemiş kat arttı ifade eden transjenik farenin, IL-15 (IL-15 KO fareleri) sergi yoksun farenin büyük çapta ulaşmak için çalışma süresi azalırken tükenme (Şekil 1A). Yayımlanan çalışmalar, IL-15 kaslar Tg f...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada tarif edilen bir şok ızgara kullanılmadan motorlu bir koşu bandı kullanılarak deney farelerinde gönüllü çalışan dayanıklılığı değerlendirmek için bir yöntemdir. Bu yöntem da egzersiz dayanıklılık 16,17 altında yatan faktörler ifade farka neden olur ve sitokin IL-15 ekspresyonunda farklı C57BL / 6 farelerinin alt hatları arasındaki farklılıkları ortaya çıkarabilir. Ilkelerine uygun olarak "Üç R '" laboratuar hayvanları bilim, bu yöntem bir şok ızgara 8-11 kullanmak zorunda egzer...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek Çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Yaşlanma Temel Biyoloji VA Puget Sound Sağlık Sisteminin, Mükemmeliyet Washington Nathan Şok Merkezi Üniversitesi Transgenik Kaynak Çekirdeği Liyakat İnceleme # Gazi İşleri Bakanlığı (EKK) den BX001026 ve kaynakların ve tesislerin kullanımı ile desteklenen (NIA # 5P30AG-013280) ve Washington Diyabet Endokrinoloji Araştırma Merkezi'nin Üniversitesi (NIH # P30 DK-17047). Biz Cynthia Pekow DVM ve Kari L. Koszdin DVM, VA Puget Sound, yazının yararlı yorum sağlanan teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Açık Kemirgen Koşu Bandı Exer-3/6Columbus Instruments, Columbus OH1050RMBu katalog numarası, şok ızgarası olmayan modeller içindir. Şok ızgaraları eski modellerden manuel olarak çıkarılabilir (Eco 3/6)
Sani Bez Antiseptik TowlettesPDI- Professional Disposables, Inc., Orangeburg, NYgenellikle yerel tesisten sipariş edilir% 10 izopropil alkol içerir; herhangi bir eşdeğer ürün kullanılabilir.
Dil bastırıcılarHerhangi bir yerel tedarikçi
Laboratuvar zamanlayıcısıHerhangi bir tedarikçi
IL-15 TG fareleri*JAX, Bar Harbor, ME011002Murine IL-15 transgeni, sekresyonunu kolaylaştırmak için değiştirilmiş sinyal dizisi ile modifiye edilmiş insan alfa-iskelet aktin promotorundan eksprese edilir.
C57BL/6J fareler (vahşi tip)*JAX, Bar Harbor, ME000664IL-15 TG
IL-15 KO farelerifareleri*Taconic Farms, Germantown, NY4269-MHomozigot IL-15 "nakavt" fareler
C57BL/6NTac (vahşi tip)*Taconic Farms, Germantown, NYIL-15 KO içinB6-M
*İsteğe bağlı; fare çizgileri ve tedavileri deneye özgü olabilir protokol.
için kontrol C57BL/6 arka plan üzerinde Kontrol fareleri

Kaynaklar

  1. Hill, J. A., Wyatt, H. R., Reed, G. W., Peters, J. C. Obesity and the environment: where do we go from here? Science. 299 (5608), 853-855 (2003).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (7121), 875-880 (2006).
  4. Pischon, T., Nothlings, U., Boeing, H. Obesity and cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 67 (2), 128-145 (2008).
  5. Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1α-mediated regulation of gene expression and metabolism: Implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).
  6. Handschin, C., Spiegelman, B. M. The role of exercise and PGC1alpha in inflammation and chronic disease. Nature. 454 (7203), 463-469 (2008).
  7. Vasunilashorn, S., et al. Use of the Short Physical Performance Battery score to predict loss of ability to walk 400 meters: analysis from the InCHIANTI study. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (2), 223-229 (2009).
  8. Wang, Y. X., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARδ. PLoS Bio. 2 (10), e294(2004).
  9. LeBrasseur, N. K., et al. Myostatin inhibition enhances the effects of exercise on performance and metabolic outcomes in aged mice. J. Gerontol. A Biol. Med. Sci. 64 (9), 940-948 (2009).
  10. Burch, N., et al. Electric pulse stimulation of cultured murine muscle cells reproduces gene expression changes of trained mouse muscle. PLoS ONE. 5 (6), e10970(2010).
  11. Li, L., et al. Mitochondrial biogenesis and peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α (PGC-1α) deacetylation by physical activity. Diabetes. 60 (1), 157-167 (2011).
  12. Knab, A. M., et al. Repeatability of exercise behaviors in mice. Physiol. & Behavior. 98 (4), 433-440 (2009).
  13. He, Y., et al. IL-15 Receptor deletion results in circadian changes of locomotor and metabolic behavior. J. Mol. Neurosci. 41 (2), 315-321 (2010).
  14. Wu, X., Hsuchou, H., Kastin, A. J., Rood, J. C., Pan, W. Essential role of interleukin-15 receptor in normal anxiety behavior. Brain Behav. Immun. 24 (8), 1340-1346 (2010).
  15. Pistilli, E. E., et al. Loss of IL-15 receptor α alters the endurance, fatigability, and metabolic characteristics of mouse fast skeletal muscles. J. Clin. Invest. 121 (8), 3120-3132 (2011).
  16. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T. W. IL-15 overexpression promotes endurance, oxidative energy metabolism, and muscle PPARδ, SIRT1, PGC-1α, and PGC-1β expression in male mice. Endocrinology. 154 (1), 232-245 (2013).
  17. Quinn, L. S., Anderson, B. G., Conner, J. D., Wolden-Hanson, T., Marcell, T. J. IL-15 is required for post-exercise induction of the pro-oxidative mediators PPARdelta and SIRT1. Endocrinology. , (2013).
  18. Ward, J. M., Anver, M. R., Mahler, J. F., Devor-Henneman, D. E. Chapter 13, Pathology of mice commonly used in genetic engineering (C57BL/6; 129; B6,129; and FVB/N). The Pathology of Genetically Engineered Mice. Ward, J. M., Mahler, J. F., Maronpot, R. R., Sundberg, J. P. , Iowa State University Press. Ames, IA, Chapter. 161-179 (2000).
  19. Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debate, K. A., Kleeberger, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med. Sci. Sports Exerc. 33 (12), 2053-2057 (2001).
  20. Turner, M. J., Kleeberger, S. R., Lightfoot, J. T. Influence of genetic background on daily running-wheel activity differs with aging. Physiol. Genomics. 22 (1), 76-85 (2005).
  21. Haight, T. J., van der Laan, M. J., Manini, T., Tager, I. B. Direct effects of leisure-time physical activity on walking speed. J. Nutr. Health Aging. 17 (8), 666-673 (2013).
  22. Studenski, S. Gait speed and survival in older adults. JAMA. 305 (1), 50-58 (2011).
  23. Jacobsen, K. R., Kalliokoski, O., Teilmann, A. C., Hau, J., Abelson, K. S. The effect of isoflurane anaesthesia and vasectomy on circulating corticosterone and ACTH in BALB/c mice. Gen. Comp. Endocrinol. 179 (3), 406-413 (2012).
  24. Sellers, T. L., Jaussi, A. W., Yang, H. T., Heninger, R. W., Winder, W. W. Effect of the exercise-induced increase in glucocorticoids on endurance in the rat. J. Appl. Physiol. 65 (1), 173-178 (1988).
  25. Cook, M. D., et al. Forced treadmill exercise training exacerbates inflammation and causes mortality while voluntary wheel training is protective in a mouse model of colitis. Brain Behav. Immun. 33, 46-56 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Ko u BandG n ll Ko uok Izgaras AlternatifiKo u Band na Al t rmaBitkinlik Son NoktalarIL 15 TransgenikMaksimum S rd r lebilir H zNazik Te vikBitkinli e Kadar Ge en S re

İlgili makaleler