Telomeraz yenidoğan beyninde ve ayrıca yetişkin beyninin farklı bölgelerinde ifade edilir. Fare beyninin çeşitli bölgelerindeki telomeraz aktivitesinin analizi ve erkek ve dişi fare beyinleri arasındaki telomeraz aktivitesindeki farklılıkların tespiti için toksik olmayan, zaman kazandıran bir TRAP testi sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi
Bu makalede
Özet
Özet
Telomeraz, bir ribonükleoprotein, telomer uzunluğu muhafaza ve dolayısıyla genomik bütünlüğü, çoğalmasını ve ömrünü teşvik sorumludur. Nöronlar gibi mitotik olmayan, son derece aktif hücreler için hayatta kalan olası önemini göstermektedir, ilave olarak, telomeraz gibi oksidatif stresten mitokondri korur ve apoptoza direnç kazandırmaktadır. Daha önce çeşitli fare beyin bölgelerinde telomeraz aktivitesi ve ekspresyonunu artırmak ve oksidatif stres motor nöronlar hücreleri korumak için yeni telomeraz aktivatörlerinin yeteneğini gösterdi. Bu sonuçlar telomeraz çeşitli lezyonlar gelen nöronların korunması dahil olduğu görüşünü güçlendirmektedir. Beyinde telomeraz rolünü vurgulamak amacıyla, burada erkek ve dişi fare beyninde telomeraz aktivitesini ve yaş olan bağımlılığını karşılaştırın. TRAP yönteminin çeşitli dokular veya hücre hatlarında telomeraz aktivitesini tespit etmek için standart bir yöntemdir. Burada analı göstermekCHAPS kullanılarak protein çıkarımı ile denatüre edici olmayan fare beyninin üç bölgede telomeraz aktivitesi sis, standart TRAP modifikasyonu ile, ardından tampon lisis.
Bu 2-aşamalı bir deneyde, endojen telomeraz TTAGGG 6 bp'lik bir tekrar (telomeraz reaksiyonu) ekleyerek belirli bir alt-tabaka, telomeraz (TH primer) ilerlemektedir. Telomeraz reaksiyonu ürünleri 6 bp'lik fazlalıklarının bir DNA merdiveni oluşturarak bir PCR tepkimesi ile yükseltilir. DNA merdiveni analizi son derece hassas bir nükleik asit boyası ile boyandı, ardından% 4.5 yüksek çözünürlüklü agaroz jel elektroforezi ile yapılır.
32P DNA tespiti ve DNA merdiveni çözülmesi için poliakrilamid jel elektroforez için radyoaktif dCTP etiketlenmiş kullanabilecektir geleneksel TRAP ile karşılaştırıldığında, bu protokol, fare beyninin telomeraz aktivitesini değerlendirmek yeteneğini göstermek için TRAP tasarruf toksik olmayan bir zaman sunar telomeras farklılıkları tespitÇeşitli dişi ve erkek fare beyin bölgesinde aktiviteye sahiptir.
Giriş
Telomeraz telomeraz bir ribonükleoprotein oluşan ters transkriptaz (TERT), telomeraz katalitik alt birimi, ve bir RNA bileşen (TERC) 'dir. Telomeraz kanonik rolü, bu nedenle genomik bütünlüğü ve hücre proliferasyonunu 1 teşvik telomerik uçlarına tekrar dizileri (TTAGGG) eklenerek telomerlerin uygun uzunluğunun korumaktır. Bu çeşitli zarar verici madde 2 ile uyarılan apoptoza karşı direnç kazandıran, yani başka roller de, hücrelerde TERT atfedilmiştir oksidatif stres 3 insan mezenkimal kök hücrelerini koruyan ve pozitif RNA TIA1 ile olan ilişkisi ile tam olarak farklılaşmış nöronların hayatta kalma yanlısı bir rol oynar granüller 4.
Enzim ekspresyonu ve aktivitesi düzeyleri sıkı Bölünmeyen hücreler 5,6 olarak düzenlenmiş olsa da, TERT, ifade edilen ve daha çok somatik bölünen hücreleri ve kanser tiplerinin çoğunda aktif bir biçimde gösterilmiştir. Çalışmalar r göstermiştirTERT mRNA, erişkin 7 içine daha düşük düzeyde muhafaza edilirken Odent beyin, telomeraz aktivitesi, doğum sonrası 10. günde fark edilemez hale gelecektir. Diğer çalışmalar yetişkin alt-ventriküler bölge, koku ampul, hipokampus içinde telomeraz aktivitesini gösterdi ve yetişkin beyincik ve kortekste 8. , Enjekte edilen fareler SOD1 transjenik amiyotrofik lateral skleroz hastalığının başlamasını ve ilerlemesini yavaşlattığı - Yakın zamanda beyin ve omurilik telomeraz ekspresyonunu ve aktivitesini de artırır yeni bileşikler, N-metil-D-aspartat (NMDA) nöro-koruyucu etkiler üretmiştir göstermiştir fare ve bu farelerin 9 omurilikteki motor nöronların hayatta kalma artmıştır. Tam nöronlarda ve beyinde telomeraz pro survival rolünü anlamak için, beynin farklı bölgelerinde telomeraz aktivitesinin tespit edilmesi için basit, hızlı ve nispeten hassas bir analiz geliştirmek için gereklidir.
Telomerik rEPEAT amplifıkasyon protokolü (TRAP) sıraları düzenlenmiştir telomeraz aktivitesi kanonik ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) birleştiren bir iyi bilinen hassas bir deneydir. Bu deneyde, telomeraz TTAGGG telomeraz substrata TH ters primeri kullanılarak 6 baz çifti (bp) DNA merdiveni oluşturur PCR amplifikasyonu takiben (TH astar) oligonükleotid, tekrar ekler -. ACX 32P dCTP etiketli en tespit etmek için kullanılır PCR ürünlerinin, düşük miktarda. DNA merdiveni dizileme poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözümlenir. Her iki DNA bantların yoğunluğu ve DNA merdiven uzunluğu, aktif enzim moleküllerinin miktarını ve işlem kapasitesi, sırasıyla 10 yansıtmaktadır.
Bu geleneksel tahlil bazı önemli zorluklar tutar: (gecede her iki durumda) sıralama PAGE ve jel çalışan zaman tüketimi ve radyoaktif ürünün filmi pozlama işlemek için büyük ve sert radyoaktif maddelere maruz kalma tehlikesi.
Bu protokol, gelişmiş bir radyoaktif olmayan bir agaroz mini jel bazlı bir deney sağlar. DNA, 6 bp'lik bir basamağı% 4.5 yüksek çözünürlüklü agaroz jel kullanılarak çözümlenir ve algılama son derece hassas bir nükleik asit leke kullanılarak başarılabilir. Agaroz mini yüksek çözünürlük jel ve duyarlı nükleik asit leke kullanılarak kombinasyonu, analizi kullanımı kolay sunar radyoaktiviteye maruz tehlikesini bertaraf eder ve önemli bir kaç saate kadar 3 gün genel deney süresini kısaltır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan deneyleri Ben-Gurion Üniversitesi'nde (IL-39-08-2010) hayvan deneyleri için etik kurul tarafından onaylandı.
1. Fare Beyin Protein Ekstraksiyonu
- Her bir buz üzerinde 5 mi Ringer çözeltisi ve yeri içeren tüplerde 15 ml 3 tüpleri hazırlayın.
- (DİKKAT - kimyasal kaput kullanmak) İsofloran anestezi kullanarak fare Kurban servikal dislokasyon ve hemen dekapitasyon 10-20 sn.
- Kafatası beyin çıkarın ve beyin dokusunda hasar görmesini önlemek için buz gibi soğuk Ringer solüsyonu ile bir kaç saniye için durulayın.
- Cerrahi bıçak kullanılarak, frontal korteks beyincik (CR) ve sapı (BS) ayırır. Sonra, beyin sapından beyincik ayırmak ve frontal korteks, frontal lobu (FL) kesilmiş; frontal lob koku ampulü çıkarın. Belirlenen, 15 ml tüpler içinde 3 beyin bölgelerinin yerleştirin.
- Her bir tüp içinde doku homojenize edilir. Fr EkleESH, buz soğukluğundaki Ringer solüsyonu, her bir tüp, 800 xg da 7 dakika için aynı hacim ve santrifüj içerir.
- Süpernatantı ve her tüp CHAPS lizis tamponu 100 ul ekleyin. , Bir 21 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile çözelti, birkaç kez (~ 10) geçirilerek, iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- 13,000 x g'de 30 dakika boyunca yeni bir mikro santrifüj tüpüne ve santrifüj tüpünün her aktarın. Yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve süpernatan, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. -80 ° C'de 10 ul alikolar içinde protein muhafaza edilir.
Araçların, Reaksiyon Çözümleri ve Protein Sulandırma Hesaplamaları 2. TUZAK Testi Hazırlık
- Protein ekstresi seyreltilerde ve telomeraz reaksiyon tamponu için etiketli mikro-santrifüj tüplerine uygun sayıda hazırlayın. Kontaminasyonu önlemek için filtre ipuçlarını kullanarak protokoldeki tüm pipetlenmesini gerçekleştirin.
- TRAP Reaksiyon karışımı 10x TS astar, dNTP'ler, Ultra saf su ve protein ekstreleri (reaktif ve reaktif konsantrasyonları için malzeme tabloya bakınız): buz aşağıdaki çözümleri çözülme.
- Ultra saf su (Ultra saf su) ile 1 mg / ml nihai konsantrasyona kadar bir protein ekstresi çözeltisi ile seyreltilir.
3. Reaksiyon Telomeraz
- Bir mikro santrifüj tüpüne aşağıdakiler eklenerek telomeraz reaksiyonu karışımı hazırlayın: 2 ul TRAP karışımı (10x), 1 ul TS primer (0.1 ug), 1 ul dNTPs (10 mM) ve 15 ul UPW. Çoklu örnekler için, numuneler, artı 1 sayısına göre yukarıda sözü edilen birimler çarpın.
- Her reaksiyon tüpüne, reaksiyon karışımı 19 ul ve 20 ul son hacim için, her bir tüpe seyreltilmiş protein ekstresi (1 ug protein) 1 ul.
- 45 dakika süre ile, 30 ° C'de önceden ısıtılmış bir su banyosu içinde, reaksiyon tüpleri yerleştirin.
4. PCR Reaksiyonu:
- Onbeş milACX astar, Titanyum Taq Buffer, UPW: n telomeraz reaksiyon sonundan önce, aşağıdaki çözümleri eritin.
- 2.5 ul Titanyum Taq Buffer (10x), 1 ul ACX astar (0.1 ug), 2 ul (IC kullanıldığında 1 ul) UPW ve 0.5 ul Titanyum Taq Polimeraz: mikro-santrifüj tüpüne aşağıdaki ekleyerek PCR reaksiyon karışımı hazırlayın (50x). Çoklu örnekler için, numuneler artı 2 sayısına göre yukarıda sözü edilen birimler çarpın.
- PCR 6 ul her bir PCR tüpü 26 ul karıştırmak ve bir son hacim için her bir tüpe telomeraz reaksiyonu (20 ul), tüm birimi ekleyin.
- Bir PCR termo döngü cihazı için PCR tüpleri yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın:
- 90 ° C - 2 dk.
- 94 ° C - 30 san. *
- 60 ° C - 30 san. *
- 72 ° C -. 45 sn *
- 72 ° C - 2 dk.
-20 ° C'de muhafaza PCR ürünleri.
* = 34 devir
5. Agaroz Mini-gel Hazırlama, Örnekleri Koşu ve Jel Boyama
- 25 ml soğuk tampon maddesi elektroforezi (TBE) ve tampon solüsyonu 2-4 kez hacminin yavaş yavaş yüksek çözünürlüklü (HR) agaroz toz halinde 1,125 g çözelti hızlı bir şekilde karıştırılır iken serpmek, bir cam kaba, bir karıştırma çubuğu ilave edin . Karıştırma çubuğu çıkarın, havalandırma için küçük bir delik plastik bir şal ve delgi ile beher kaplayın. Daha sonra 3 dakika boyunca "düşük" güç mikrodalga beher ısıtın ve "Yüksek" güç anahtarı ve dökülmesini neden değil itina ile kısa bakliyat çözüm ısıtın. Isıtılarak oluşturulan köpük, birkaç saniye sonra, büyük kabarcıklar haline gelir ve kaybolur, agaroz hazır olduğuna dikkat edin.
- Jel, oda sıcaklığında katılaşan sonra jel, kullanımdan önce 4 ° C'de 20 dakika boyunca soğuk izin yatay mini jel cihazına jel döküm.
- 25 TUZAK numune ul (20 ul TRAP PCR ürünlerinin ve 5 ul 6x jel yükleme boyası) ile her şerit yerleştirin ve 11 çalıştırmak4 ° C soğuk oda içinde 3 saat boyunca 0 V.
- 15 ul 10,000X nükleik asit leke, 0.1 M NaCl (0.29 g) ile 50 ml iki defa destillenmiş su (DDW) stok çözeltisi eklenerek çalışma çözeltisi nükleik asit lekesi 3x hazırlayın. Nazik çalkalama ile 20 dakika boyunca jel Leke.
- TRAP merdiven DNA bantları görmek için 302 nm dalga boyunda UV transilluminator kullanın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tüm hücre protein için 1 ve 3 aylık yaş 3, CD-1 erkek ve 3, CD-1 erkek fareler türetilen, frontal lob (FL), beyin sapı (BS), serebellum (CR) hazırlanmıştır modifiye TRAP tahlil ve radyoaktif TRAP eski 2 aylık yaşta 3 CD-1 erkek fareler. Telomeraz aktivitesi modifiye TRAP deneyi kullanılarak ayıkla 1 mcg proteinler tespit ve 2 mcg proteinler radyoaktif TRAP için ayıklamak edildi. Radyoaktif TRAP ile ve modifiye TRAP ile telomeraz aktivitesinin tespiti 1C genel DNA merdiveni (Şekil 1A
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
PCR 4 ile telomeraz reaksiyonu 3) telomeraz reaksiyon ürünlerinin amplifikasyonu - beyin dokusu 2) spesifik bölgelerinden 1) proteinlerinin ekstre Telomeraz suretiyle, primer uzaması TS: TRAP ile fare beyin telomeraz aktivitesi analizi 4 ana adımdan oluşur yüksek çözünürlüklü agaroz jel kullanılarak, PCR-ürünlerinin) ayrılması.
DNA merdiveni ve PAGE PCR ürünleri ayırma hassas bir şekilde tespit radyoaktif dCTP 'lerin kullanımı: Bu değiştirilmiş TRAP yönteminin Geleneksel tahlilde yüksele...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen B.G. Negev teknolojisi ve Linda Powers'ın katkılarıyla desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| TRAP Karışımı (10x) | Manuel olarak yapıldığında, aşağıdakileri UPW'de karıştırın: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, %0.5 TWEEN (Sigma'dan satın alınmıştır). Alikotlar -20 ° C'de dondurulur. | ||
| Ringer'ın çözümü | Manuel olarak yapıldığında, aşağıdakileri DDW'de karıştırın: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4· H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g / L D- (+) - glikoz susuz. | ||
| İzofluran | Minrad A.Ş. | NDC 60307-110-10 | Kimyasal başlıkta dikkatli kullanım |
| dNTP'ler (10 mM) | Sigma | D7295 | |
| TS astar (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') | Sigma | DNA oligoları DRY formatında sipariş edildi ve gerekli konsantrasyona göre UPW eklendi | |
| ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3') | Sigma | DNA oligoları DRY formatında sipariş edildi ve UPW isteğe göre eklendi konsantrasyon | |
| Titanyum Taq Polimeraz / Tampon | Clontech | S1792 / S1793 | |
| Yüksek Çözünürlüklü agaroz | Sigma | A4718 | Herhangi bir yüksek kaliteli yüksek çözünürlüklü agaroz sütlenebilir |
| Mini jel aparatı | Bio-Rad | 170-4466 | |
| Nükleik Asit Lekesi (JEL-KIRMIZI) | Biotium | 41003 | |
| IC astar (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3') | Sigma | DNA oligoları ve gerekli konsantrasyona göre eklenen UPW | |
| CHAPS lizis tamponu | Hücre Sinyalleme Teknolojisi | 9852S | 1 mM'lik nihai konsantrasyona PMSF (proteaz inhibitörü) ekleyin |
| Ultra Saf Su (UPW) | Biyolojik Endüstriler | 01-866-1B | |
| CD-1 fareler | HARLAN Laboratories INC. |
Kaynaklar
- Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis. Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).
- Cong, Y., Shay, J. W. Actions of human telomerase beyond telomeres. Cell Res. 18, 725-732 (2008).
- Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. Curr.Mol. Med. 13, 1010-1022 (2013).
- Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B. PloS one. 8, e66602(2013).
- De Jesus, B. B., Blasco, M. A. Potential of telomerase activation in extending health span and logevity. Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).
- Blackburn, E., Collins, K. Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).
- Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice. J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).
- Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice. Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).
- Eitan, E., et al. Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis. EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).
- Kim, N. W., Wu, F. Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP). Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
