Mikro Silikon konsolun Kullanımı Hücresel kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için İn Vitro

Hem insan hem de kemirgen kaynaklarından elde edilen kas hücrelerinin in vitro kültürü onlarca yıldır mümkün olmuştur^1,2. Bununla birlikte, standart lamel preparatları biyokimyasal değerlendirme için yararlı olsa da, hücrenin birincil fonksiyonel çıktısının (kasılma) analizini kolaylaştırmazlar ve bu nedenle hücresel olgunlaşma ve performansı değerlendirmek için bir araç olarak biraz sınırlı bir değere sahiptirler. Bu tür in vitro kültürlerden elde edilebilecek veri miktarını en üst düzeye çıkarmak için, bu tür hücreleri, fonksiyonel performanslarının gerçek zamanlı değerlendirmesine izin veren konfigürasyonlarda barındırabilen sistemlerin geliştirilmesini ilerletmek gerekir. Çok sayıda üç boyutlu kas modelinin kurulması, bu ihtiyacı karşılama yolunda bir miktar ilerleme kaydetmiştir ve bu tür sistemler, kültürlenmiş kas hücrelerinin kasılma kapasitesini in vitro^3-5 olarak değerlendirmek için bir dizi yayında kullanılmıştır. Bu tür sistemler doku modelleme ve rekonstrüksiyon çalışmaları için paha biçilmez olsa da, tek hücre tepkileri çalışmaları için uygulanabilirlikleri sınırlıdır. Tek lif çalışmalarının gerekli olduğu bu gibi durumlarda, karmaşık ve emek yoğun ex vivo metodolojiler tek seçenek olarak kalmaktadır^6-10. Ayrıca, ilaç geliştirme ve tarama protokolleri için karmaşık, çok organlı platformların geliştirilmesine yönelik mevcut hareket, non-invaziv, kolayca ölçeklenebilir ve destekleyici hücreler ve doku modelleriyle kolayca entegre olan sistemlerin kurulmasını gerektirmektedir¹¹.

Mikro ölçekli konsollar, tek hücrelerin/küçük hücre popülasyonlarının fonksiyonel kasılma kapasitesini değerlendirmek için basit bir yöntem sunar^12,13. Teknik, modifiye edilmiş Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) teknolojisine (AFM) dayanmaktadır¹⁴ ve kültürlenmiş miyotüp kasılma aktivitesine yanıt olarak mikro ölçekli konsol sapmasını ölçmek için bir lazer ve foto-dedektör sistemi kullanır. Modifiye edilmiş Stoney denklemleri daha sonra miyotüpteki gerilimi ve gözlemlenen substrat sapmasını¹⁵ oluşturmak için miyotüp tarafından uygulanan kuvveti hesaplamak için kullanılır. İlaç toksisitesi/etkinliği çalışmaları için potansiyel orta ila yüksek verimli uygulamalar sunan, çoğullanmış konsol dizilerinin eşzamanlı olarak değerlendirilmesini sağlayan bir tarama programı yazılmıştır^15,16. Bu tür bir teknoloji, in vivo ilaç etkinliğini tahmin etmek için fonksiyonel, klinik öncesi tahlillerin geliştirilmesinde paha biçilmez olabilir.Ayrıca, konsol çiplerinin silikonda üretilmesi, immün boyama, western blotting ve PCR gibi standart biyomoleküler tahliller için hücrelerin analiz sonrası işlenmesini engellemez.

Bu el yazması, mikro ölçekli silikon konsolların üretimi ve hazırlanması, donanım ve yazılım kurulumu ve bu çipler üzerinde kültürlenen kasılma hücrelerinin işlevselliğini değerlendirmek için çalıştırma yönergeleri hakkında ayrıntılı talimatlar sağlar. Bu yüzeylerdeki hücrelerin kaplanması ve bakımı için standart hücre kültürü teknikleri uygulanabilir, bu nedenle güvenilir kültür parametrelerinin mevcut olduğu herhangi bir kontraktil hücre tipi bu cihazla kolaylıkla entegre edilebilmelidir. Bu sistemde kullanılan nispeten basit 2D kültür parametreleri, diğer hücre modellerinin entegrasyonunu veya kaslarla etkileşime girebilen hücre tiplerinin (innerve edici nöronlar gibi) eklenmesini doğrudan yapar ve bu modelin daha karmaşık fonksiyonel in vitro testlerin geliştirilmesinde uygulanabilirliğini büyük ölçüde artırır ve memeli sistemlerinin çok organlı modelleri.

1. Konsol Chip Fabrikasyon

Açıklanan imalat adımlarının gösterilen ayrıntıları Şekil 1 'de verilmiştir.

1. Bir fırın içinde silikon üzerinde yalıtkan (SOI) gofret yerleştirin ve bunları kurutmak için 20 dakika boyunca 125 ° C'de pişirilir.
2. Bir plazma kullanılarak susuz SOI gofretin sap tabakası üzerine silikon oksit, 1.5 mikron kalınlığında bir tabaka yatırın kimyasal buhar çöktürme (PECVD) aracı artırıldı.
3. Cihaz katman yukarı bakacak şekilde spin lak mandrenin gofret yerleştirin. , Gofret merkezli olduğundan emin olun 1,000 rpm / saniye bir hızlanma 60 saniye boyunca 3000 rpm'de gofret merkezinde ve spin P20 astar 2 ml dağıtmak. P20 astar cihaz fotorezist tabakaya yapışmasını teşvik etmektedir.
4. Gofret spin lak mandrenin görünse de, o ile 1000 rpm / saniye oranında hızı 60 saniye boyunca 3000 rpm'de S1818 gofretin ortasına ışığa ve spin 2 ml dağıtmakFotorezist 1.5 mikron kalınlığında bir tabaka btain.
5. Sıcak bir plaka üzerinde gofret yerleştirin ve 1 dakika boyunca 115 ° C'de bir fırında yumuşak gerçekleştirin.
6. Cihaz üzerinde bir tabaka ışığa için konsol maskeden desen transfer etmek için bir iletişim fotolitografi maske hizalama kullanılarak sert kontakt UV ışınlarına maruz kalma gerçekleştirin. 125 mj / S1818 fotodirenç için cm ² poz enerji değerine göre pozlama süresini hesaplayın.
7. Hafifçe ileri ve geri gofretin çalkalayarak, 1 dakika boyunca 726 MIF fotorezist geliştirici gofret daldırarak fotorezist geliştirir.
8. De-iyonize (DI) su ile durulayın gofret ve tercihen bir sıkma durulama kurutma makinesi (SRD) aracını kullanarak, kurutun.
9. Aseton batırılmış bir pamuk bez kullanılarak (kenardan 5 mm kadar) gofretin kenarından fotorezist çıkarın.
10. Fotorezist tarafı yukarı bakacak şekilde, bir Derin Reaktif İyon Asitli (DRIE) aracında gofret yükleyin ve devi ile desenli silikon tabakasını etch için bir reçete çalıştırınce katmanı. Bir aşındırma durak olarak gömülü oksit katmanı işlevleri, yani tam bir iz sağlamak için gerekli olması beklenmektedir% 100'den daha fazla döngü için% 50 ile bir iz gerçekleştirin.
11. Fotorezist şerit 20 dakika boyunca sıcak bir fotorezist Banyo çözeltisi içindeki gofret yerleştirin. DI su ile gofret durulayın hızlı-dökümü-rinser (QDR) gofret aktarın. Fotorezist şerit ardından, durulama ve gofretin kuruması için SRD aracında gofret yükleyin. Beklendiği gibi konsol desen görünür sağlamak için bir mikroskop altında gofret kontrol edin.
12. Bir PECVD alet gofretin cihaz katmanda un katkılı bir silikon oksit 1 mikron kalınlığında bir tabaka bırakın. Daha fazla işlem kademesi sırasında konsollar için koruyucu tabaka olarak bu oksit tabakası çalışır.
13. Gofretin arka tarafının başlatmak üzere yukarı bakacak şekilde sap tabakası ile dönel kaplayıcı aynası üzerine, gofret yerleştirin. Olun gofret 3000 rpm'de P20 gofretin ortasına astar ve spin 2 ml dağıtılması, ortalanır1000 rpm / saniye oranında hızı 60 sn.
14. Gofret spin lak mandrenin görünse de, bir 6.5 mikron kalınlığında bir tabaka elde edilmesi için 1000 rpm / saniye oranında hızı 45 saniye boyunca 2000 rpm'de gofretin merkezi ve spin üzerine SPR220-4.5 fotodirenç 2 ml dağıtmak Fotorezist.
15. 2 dakika boyunca 115 ° C'de bir fırında yumuşak gerçekleştirmek için bir yakınlık sıcak bir plaka üzerinde gofret yerleştirin.
16. Ön / arka uyum yeteneğine sahip bir fotolitografya temas hizalama kullanarak, ön yan konsol desen arka pencere maske hizalayın ve kolu katmanda fotodirenç için arka pencere maskeden desen transfer etmek için bir sert kontakt UV maruziyetini gerçekleştirin. 480 mj / SPR220-4.5 fotodirenç için cm ² poz enerji değerine göre hesaplanan bir pozlama süresi kullanın.
17. UV'ye maruz kalmadan sonra, çok ince bisküviler bir sonraki işleme aşamasından önce 30 dakika süre ile karanlık bir yerde kalmasını sağlar.
18. Gofretin daldırarak fotorezist geliştirilmesi2 dakika süre ile, 726 MIF fotorezist geliştirici hafifçe ileri ve geri gofreti çalkalandı.
19. De-iyonize (DI) su ile durulayın gofret ve tercihen bir sıkma durulama kurutma makinesi (SRD) aracını kullanarak, kurutun.
20. 12 saat boyunca 90 ° C'de bir fırında gofret yerleştirin.
21. Florlu gazlar ile RIE sistemi ve oksit gravür için bir tarifi kullanarak gofret ters silikon oksit tabakası etch. Gofretin ters desenli oksit daha sonraki işlemler için bir aşındırma maske olarak görev yapar. Maruz kalan penceresinde silikon oksit tamamen kazınmış olduğundan emin olmak için bir mikroskop altında gofret kontrol edin.
22. Aseton batırılmış bir bez kullanılarak temiz oda (kenardan 5 mm kadar) gofretin kenarında fotorezist çıkarın.
23. Bir DRIE aracında gofret yüklemek ve bir aşındırma durak olarak gömülü oksit tabakası işleyişi ile 500 um'lik bir derinliğe desenli tabaka sap oyulması için bir tarifi çalıştırın. Aşırı ısınmasını önlemek için birden çok çalışır içine bu etch bölünmüşsilikon tutarsız aşındırma neden gofret. Bu aşındırma adımı tamamen dirseklerin altında silikon kaldırır.
24. Dirseklerin altında gömülü oksit tabakası ve dirseklerin üstüne koruyucu oksit katman şerit,% 25 sulandırılmış HF pürüzlendirici kullanan bir ıslak aşındırma adımı gerçekleştirir.
    Not: Bu adım silikon konsolun alt yüzeyi serbest bırakır ve aynı zamanda lazer ile dirsekli araştırmak için bir erişim sağlamak için altına bir pencere açar.
25. DI su banyoları dizi ve azot ile dikkatlice kuru kullanarak gofret durulayın. Konsollar kendi üslerinde yalnızca desteklenen yana, doğrudan dirseklerin üzerine DI su veya inert gaz güçlü spreyler kullanmayın.
26. Sap tabakası aşındırma adımı esnasında üretilen klevajın çizgileri boyunca gofret bireysel fiş bölmektedir.

2. Hücre Kültürü

1. Daha önce yayınlanmış yöntemlerden ^17'ye göre 13F lamelleri hazırlayın.
   NOT: Eğer 13F koyrslips mevcut değildir, 95 ° C'nin üzerindeki bir temas açısına sahip herhangi bir hidrofobik yüzey kullanılabilir.
2. Konsol cips ve% 70 etanol çözeltisi içinde 13F lamelleri sterilize ve bir akış kaputu kurumaya bırakın.
3. Bir standart 12 plaka içindeki 13F lamelleri üstüne bireysel konsol cips yerleştirin.
4. Kaplayın hücre tipi için optimize biyopolimer veya yüzey modifikasyonu ile dirsekleri standart hücre kültür protokollere göre kullanılır.
5. Istenen konsantrasyona kendi özel büyüme ortamında hücrelerin yeniden askıya.
   NOT: Bu protokol konsol penceresinden düşen ve istenilen konsol yüzeyine yapışan olmayan hücrelerin önemli bir sayıda neden olur. Hücre preparasyonlar, bu sebepten, standart preparatları için bir örtücü cam, daha konsantre 3-4x yapılmalıdır. Örneğin, sıçan iskelet kas uydu hücreleri, tipik olarak tohumlama 500-700 hücre / mm kare ^15,16 ilk önce tohum ekme yoğunluğu kullanılarak yürütülürVe / meydan aa 2000 hücre olacak şekilde konsol alt tabakalar kullanılmaktadır. Optimizasyon deneyler, uygun bir tohum yoğunluğu belirlemek için yeni bir hücre kaynakları ile yapılmalıdır.
6. Orta kabarcık tamamen konsol pencere kapsayan sağlanması konsol çip yüzeyi üzerine, hücre süspansiyonu 200 ul pipetle. Orta pencereden fitiller ve dirseklerin üstüne bir statik kabarcık oluşturmak vermezse 13F lamel değiştirmek ve kaplama reattempt.
7. Bir kuluçka yongası içeren plaka aktarın ve hücreler, en az 1 saat (tercihen 2-3 saat) boyunca yapışmaya izin verir.
8. Bu kaplama tamamlandıktan sonra, büyüme ortamı, 1 ml kültür, bir 13F lamel olmaksızın temiz bir çukuruna çipi transferi, ve en fazla steril forseps kullanır.
9. Inkübatör plaka dönün.
10. Lamelleri in vitro bakım için standart bir protokole uygun hücreleri korumak. Iskelet kası hücreleri için,Hücreler birleştiklerinde, gerekli olacaktır hale kez ortam bileşiminin bir anahtar miyotüp oluşumunu tetiklemek için karıştırılabilir.

Konsol Saptırma Analiz için Donanım ve Yazılım 3.Kurulum

1. Dik elektrofizyoloji mikroskop aşamasında içine ısıtılmış kültür çanak yerleştirin.
2. Isıtılmış mikroskop kademesine ile henüz (+ 10 mM HEPES) içinde süspanse edilmektedir besleme ortamının 3 ml ilave edilir.
3. 15 mm'lik bir ayırma mesafesi ile ısıtılmış kültür çanak iç paslanmaz çelik elektrotlar monte ve bir darbe üreteci arasında değişen yoğunlukta, frekans ve dalga biçimi alan uyarım darbelerini üretebilen bağlamak, sistem alan uyarımı üretmek için izin Uygun zaman hücrelerin.
4. , Mikroskop tablonun alt tarafına, X ve Y platformlarının üzerine monte edilen bir helyum-neon lazer cıvata ve lazer ışını, bir 30 ° 'lik açı relativ de ısıtılmış kültür çanak tabanı boyunca yönlendirilecek şekilde ayarlayınkonsolun düzlemine e.
5. , Mikroskop sahne alt etmek, XY öteleme aşamalarında üzerine monte edilmiş bir kadran fotoğraf-dedektör modülü cıvata ve 4 kadranın merkezinde yansıyan lazer ışını topraklar. Şekil 2, böylece konumunu ayarlamak kurmak donanımın bir bakış sağlar Açıklanan protokol uygulanması için gerekli.
6. Cantilevers üzerinden tarama doğrusal aktüatörler kontrol etmek için bir yazılım program yazın. Şekil 3'te sunulan akış şemasına değini ile yazılım programı yazmak. Bu sistem ile kullanılmak üzere programlanmış bir grafik arayüz Şekil 4'te sunulmuştur.

4. Kaydı Konsol Sapma Veri

1. Konsol analiz donanımı ve ilgili yazılımlar açın.
2. Ortama ısıtılmış sahne termistoru yerleştirin ve 37 ° C okumak için sabırsızlanıyorum.
3. Cantileve ile aşamaya konsol çipi takınSahnenin sağ tarafında yönelmiştir rs.
4. Mikroskop ışık kaynağı açın.
5. Konsol varsayarsak sahnenin sağında, konsol 1 yöneliktir: görünüm içine konsolun kenarlarını getirmek ve konsol 1. NOT ucunda lazer ışını konumlandırmak için lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı kullanmak için Odak mikroskop Dizinin sol üst konumlandırılmış biridir ve sayılar sol alt aşağı 16 çalıştırın. Konsol 17 sağ üst pozisyonda ve sağ alt (Şekil 5A) içinde 32 hareket eder.
6. Basın kayıt yazılımı üzerinde "oynamak".
7. Sinyal foto-dedektörü kontrol kademeli motora ayarlayarak, x ve y çerçeveleri hem de "0" okur, böylece foto-dedektörü yerleştirin.
8. Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı Set konsol 1 pozisyon (Şekil 4).
9. . Adımı 4.7 tekrarlayın, konsolun 16 ucuna lazer taşıyın ve cantilev seter lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı 16 pozisyon.
10. Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı adımı 4.7. Ve set konsol 32 pozisyonunu tekrar, konsolun 32 ucuna lazer taşıyın.
11. Lazer / fotoğraf-detektör kontrol yazılımı adımı 4.7. Ve set konsol 17 pozisyonunu tekrar, konsolun 17 ucuna lazer taşıyın.
12. Mikroskop ışık kaynağı ve laboratuarda havai ışığı kapatın.
13. Kayıt yazılımı basın "rekor".
14. 1 Hz frekansta 40 msn'de, 5 V bakliyat için nabız jeneratörü donanımı ayarlayın ve makineyi açın.
    NOT: İsteğe bağlı olarak, bu noktada belirli bir hücre kaynakları için optimize edilmiş stimülasyon protokolleri istihdam, belirtilen ayarları insan ve kemirgen hücre kaynaklarının ^12,13,15,16 kullanılarak toplanan verilere dayalı kurallar vardır.
15. Lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı kullanarak, her on 5 saniye durdurma, 32 konsol dizi boyunca tarama donanımı ayarlayınör.
16. 32 konsolun Tarama işlemi tamamlandığında, daha sonra kayıt yazılımı ve veri dosyasını getirmek, uyarıcı kapatın.
17. Kontraktil aktivite kanıt her bir dirsek gelen kaydedilen iz inceleyin. Olumlu tepkiler her konsolun bir kenara not edin. Saptırma taban üzerinde en az 0,1 V ise, bir daralma, bir tepe noktası olarak tanımlanır.
18. Lazer / fotoğraf dedektör kontrol yazılımı üzerinde tarama protokolü herhangi bir sigara duyarlı konsol çıkarın.
19. Aktif konsollar daha sonra hücrenin spontan kontraktil aktivitenin bir okuma almak için uyarı olmaksızın rescanned edilebilir.
20. Kültürlenen hücrelerin fonksiyonel çıktıya üzerindeki etkisini gözlemlemek için ortama terapötik bir bileşik ilave edildikten sonra, ya da geniş alan elektriksel uyarımı olmaksızın taramaları çalıştırın.
21. Elektriksel Uzun süre ve Contr tarama seviyeleri için hücreleri uyararak yorgunluk değerlendirmeler yürütmek actility belirli bir eşiğin altına düşmesi pik gücü için ne kadar sürdüğünü ölçmek için.
22. Motor nöronlar, kas ile ko-kültür içinde muhafaza edilir deneylerde, nöromüsküler nöronal bir uyarıcı motonöron-miyotüp konsol ko-kültürler işlemi ile bağlantı oluşumu (glutamat gibi) veya sinaptik inhibitör ölçün (örneğin, D-tubokurarin) ve tarama spontan aktivitede artış ve azalışlar sırasıyla ^16.
23. Planlanan deneyler ihtiyaçlarına göre belirlenecektir gibi özel taramalar yapar.

Konsol Sapma Verilerin 5. Analiz

1. Kullanım Stoney denklemleri ¹⁵ hücre tabakası veya miyotüp (Pascal), ve (nano-Newton) hücresel kasılma gücünün doğrudan ölçümü stres bir okuma içine (Volt) ham konsol sapma verilerini dönüştürmek için (aşağıda ayrıntılı) güncellendi:
   reklam / 51866 / 51866eq1.jpg "/> Denklem 1
   Denklem 2
2. Δ = konsol ucu sapma ve stres miyotüp tarafından üretilen yerlerde, σ _c üniforma kalın filmi konsol, C _dedektörün tam genişliğini varsayarak miyotüp tarafından üretilen = stres, = fotoğrafın üstüne lazer konumuna gerilimi ilişkin sistemine özgü katsayısı -detector, θ = konsolun düzlemine lazer ve detektör açısının E _Si silikon elastik modüle = t _Si konsolun kalınlığı = t = _f miyotüp kalınlığı v = _Si oranı arasında Zehir silikon, L = konsol uzunluğu, dedektör konsol ucundan lazer P = yolu uzunluğu, w _{Şekil 6'da verilmiştir.}
3. Düzgün bir film miyotüp olduğunu varsayarak, miyotüp yapan kuvvet Stoney uygulama için kullanılan stresten kuvvet hesaplama ve varsayılan hücre bir kesit alana eşitleyerek, 3. Denklem yol filmde kuvvete eşittir denklem.
   Denklem 3
4. Fonksiyonel Veri toplama, imünositokimyasal analizler için konsol fiş düzeltmek veya standart teknikler kullanılarak protein veya DNA analizi için hücreler kullanır.
5. İsteğe bağlı olarak, daha sonraki bir zaman noktasında, işlevsel performansı yeniden değerlendirme amacıyla kuluçka yerine moleküler analiz için hazırlanırken hücreleri döner.

Dirseklerin kontraktil hücrelerinin başarılı kültürü, standart hücre kültürü teknikleri (Şekil 5) kullanılarak, nispeten basit bir işlemdir. Yakalanma hücreleri destekleyici dirseklerin yüzdesi, hücre tipine bağlı olarak değişir incelenmiş ve belirli bir kültür tekniği kullanılmış olmasıdır. Sıçan arka bacak türetilen birincil embriyonik hücreleri kullanarak, kontraktil aktivite incelendi konsolun tespit% 12 (n = 4). Açıklanan lazer ve foto-dedektör sistemi kullanılarak kasılma fonksiyonu analizi seribaşı hücrelerin işlevsel vadeye ilişkin kesin ve gerçek-zamanlı veri sağlar. Şekil 7'de gösterildiği gibi, standart elektrofizyolojik yazılımının kullanılması, daha sonra bu yarı gevşeme için tepe kuvveti, kuvvet zirve zaman ve zaman gibi uygun fonksiyonel özellikleri, hesaplanması kolaylaştıran, ham verileri analiz etmek için kullanılabilir. Daha sonra, veri toplama muamele edilmiş kültürlerden tedavi edici terkipler ile sağlarve ilaç ilavesi olmaksızın fonksiyonel özellikleri ile karşılaştırılması, böylece bileşik, aktivite ve in vivo tepkilerinin sonraki tahminler değerlendirilmesine olanak tanır. Ayrıca, genişletilmiş protokoller dolayısıyla bu sistem (Şekil 8) 'den elde fizyolojik veri düzeyini genişletilmesi, kültürlü hücrelerde yorgunluk oranlarını değerlendirmek için araçları sağlar.

Konsol, in vitro olarak kültürü nöromüsküler sinaps oluşumu (Şekil 9) değerlendirilmesine izin verecek şekilde. Gibi kültürlerde, spontan kontraktil aktivite oranları oranları ile karşılaştırıldığında, iskelet kası miyotüplerinin 16 ile kültür sisteminde, motor nöronlar için değiştirilebilir glutamat gibi bir nörona özgü uyarıcı ile muamele edilmesine cevaben, daralma. Daralma oranlarında gözlenen herhangi bir glutamat kaynaklı artışlara asetilkolin salımı ve ardından miyo yol kültürlenmiş nöronların aktivasyonunu göstermektedirtüp aktivasyonu. Glutamat kaynaklı etkinliğinin durdurulması yol açan bu tür asetilkolin reseptör tıkayıcı, D-tübokürarin sinaptik inhibitörleri ile tedavi, bu kültürlerde 16 fonksiyonel nöromüsküler sinaps varlığı ilişkin başka kanıtlar sağlar.

Şekil 1. Şematik ayrıntılarıyla konsol üretim süreç akış. Akış şemasında verilen numaralar başlıklı yöntemler bölümünde protokol adımlara korelasyon "Konsol çip fabrikasyon." Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. Donanımcantilevers hücresel daralma değerlendirmek için kullanılan lazer / fotoğraf-detektör sisteminin ayrıntıları. Konsol değerlendirilmesi için kullanılan modifiye elektrofizyolojik mikroskop (A) fotoğrafı. Lazer (i) ve foto-detektör (ii) XY öteleme aşamalarında sahnede altına monte edilir. Şeffaf bir kültür çanak sahnenin alt üzerinden konsol diziye lazer geçişine izin aşamasında (iii), üzerine monte edilir. (B) şematik "yukarıdan-aşağıya" mikroskop sahne perspektif. XY platformlarının, dizideki her dirsekli sorgulamak için lazer hareketini kolaylaştırmak, X ve Y düzlemleri (kırmızı oklar) hem de lazer ve fotodetektör hareketini sağlar. Konsol cips (iii) lazer (i) fotoğrafı Close up (C). Düzgün çalışması için sistemi için sırayla sahne sağa doğru bakacak çıkmalarıyla aşamaya konulmalı veFoto-detektör (ii) aşamasında mikroskop altına monte edilmiştir. Lazer konsol çip (θ) düzlemine göre 30 ° 'lik bir açı ile konumlandırılmıştır. (D) kültür çanağı fotoğrafı kadar kapatın. Elektriksel stimülasyon gümüş bir elektrot çifti aracılığıyla uygulanır geniş alan birbirinden 15 mm bir konuma (iv). Yemeğin alt tarafına bağlı bir ısıtma elemanı (V), analiz sırasında 37 ° C'de kültürü korumak için kullanılır. Sıcaklık kontrolü, dinamik ve orta (gösterilmemiştir) yerleştirilen bir termistör vasıtasıyla düzenlenir olduğunu. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Kontrol yazılımı yatan mantık Şekil 3. Akış şeması. kullanıcı girişi ve tarama hareketini denetleyen bir döngü için bir ana döngü: Lazer ve foto-detektör iki yazılım tarama kontrolü hareketini döngüler. Ana döngüsü içinde, yüksek hacimli veri toplama için orta için ikinci döngü aktivasyonu takip sırasında Kur yapılır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazılımın Şekil 4. grafiksel kullanıcı arayüzü konsol değerlendirmesi sırasında lazer ve foto-detektör pozisyonlarını kontrol etmek için kullanılır. (A), düğmeler ve böylece el için yazılım sağlayan, el ile 4 köşe dirsekleri pozisyonlarını ayarlamak için kontrol eder. (B) X ve Y'nin her ikisi de düzlemde lazer ve foto-detektör pozisyonları kontrol (1, 16, 17 ve 32) içindizideki kalan konsolun pozisyonlarını tahmin. (C) Denetimler kullanıcıların dahil konsol hangi seçmek için izin her tarayın. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bu sistem içinde kullanım için özel üretim konsol çipin 5. Görüntü Şekil ve benzeri yüzeylerde tutulan hücrelerin temsili görüntüler. Tek bir özel inşa konsol çip (A) Fotoğraf. Her çip sağ üst görüntü ve konsolun 32 sol alt konumlandırılmış 16. Cantilever 1 2 sıra halinde düzenlenmiş 32 konsol içerir. Konsol fiş 15 x 15 mm2. Primer fare iskelet kas hücreleri (B) faz kontrastlı dirsekteki büyütülürs. Her konsol kalın 750 100 mikron genişliğinde uzun um ve 4 mikron. (C) bir konsol üzerinde tutulan bir primer sıçan miyotüp imünositokimyasal leke. Hücreler, miyozin ağır zinciri için bir antikor probu kullanılarak boyandı. Kontraktil makine olgunlaşma gösteren kültür elyafın çizgili görünümünü unutmayın. Konsol kenarları yapay ölçekte bir gösterge sağlamak için bu görüntüde vurgulanmıştır. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Konsol üzerinde miyotüplerinin tarafından üretilen kuvvet türetmek için Stoney denklemlerinden kullanılan terimleri gösteren Şekil 6. şematik. Miyotüp, C tarafından üretilen δ = konsol ucu sapma ve stresdetektör = fotodetektör laser konuma gerilimi ile sisteme özel katsayısı θ = konsolun düzlemine lazer ve detektör açısının E Si silikon elastik modüle = t Si = kalınlıkları konsol, t f = miyotüp kalınlığı, v Si = silikon Zehrin oranı, L = konsol uzunluğu ve dedektöre konsol ucundan lazer P = yol uzunluğu. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7. Temsilcisi ham veri ve açıklanan konsol sistemi kullanılarak kasılma formu analizi. (A) konsol üzerinde birincil sıçan miyotüplerinin geniş alan elektrik stimülasyonu bir ham veri iz örneği. Konsolun üstünde zorlanma uzunlamasına belirten Üst iz = x-ekseninde (Volt) lazer saptırma. Konsol üzerinde burulma gerginliğini gösteren Orta iz = y ekseninde (Volt) lazer saptırma. Alt iz = Bu sistemde miyotüp daralmayı ortaya çıkarmak için kullanılan elektrik sinyalleri zamansal konum göstergesi. (B) standart elektrofizyoloji yazılımı kullanarak, maksimum kuvvet (PF) ölçmek mümkündür, zaman yarısına kuvvet (TTP) ve zaman zirve Primer sıçan iskelet kası miyotüplerinin gelen toplanan ham verilerden gevşeme (1/2 RT) yapıldı. (C) Harmanlı daralma verileri (n = 11). Bir modifiye Stoney denkleminin Uygulama Volt ham veri okumalardan konsol stres hesaplanmasını sağlar. Bu verilerden, (Newton) kuvvet doğrudan bir hesaplama da oluşturulabilir. W yeniden basıldı yayınlanmış verilerinci izni 13. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil konsol kültürlerde iskelet kas yorgunluğu analizini gösteren 8. Temsilcisi verileri. (Volt) Ham veri miyotüp (nano-Newton) kuvvet ve yeniden çizilen bir ölçümü dönüştürüldü. Veri 0 dakika (siyah iz) ve sürekli stimülasyon 120 dakika (gri iz) sonra 1 Hz geniş alan elektriksel sinyallere yanıt olarak konsol üzerinde miyotüp kasılmalar büyüklüğünü göstermektedir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Ve bir nöromüsküler blokerine eklenmeden, motonöron stimülasyon işlevsel etkilerini gösteren konsol üzerinde sağlanan iskelet kas motor nöron ko-kültür analizi Şekil 9. Örnek izler. (Volt) Ham veriler miyotüp bir ölçümü ile dönüştürüldü Kuvvet ve (nano Newton) yeniden işlenmiştir. nöronal uyarım olmadan kültürlenmiş miyotüplerinin spontan kasılmaları (A) ölçümü. 200 uM glutamat ilavesi yoluyla nöronal uyarım aşağıdaki miyotüp daralma (B) ölçümü. (C) Ölçüm glutamat ve 12.5 mcM D-tubokurarin tedavisi sonrasında miyotüp daralma. Izni 16 ile yeniden basıldı yayımlanan veriler. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Aşağıdaki tablolar konsol değerlendirmesini gerçekleştirmek için gerekli açıklanan doğrulama deneyleri kültür hücreleri kullanıldı özgü reaktifler yanı sıra ekipman listesi. Kullanılan kültür reaktifler gerekli değildir ve bu sistem kolayca in vitro kasılma hücreleri korumak herhangi bir laboratuar kültürü protokolleri ile entegre edilmesi gerektiğini lütfen unutmayın. Sağlanan listelenen reaktifler Araştırmacılar açıklanan belirli deney sonuçlarını tekrarlamak isteyen gerekir.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.