Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Özet

Streptococcus pneumoniae'deki rekabete, pnömokok ve diğer ilgili türlere karşı inhibe edici aktiviteye sahip bakteriyosinler, küçük antimikrobiyal peptitler aracılık eder. Burada, bakteriyosin aktivitesinin ve inhibitör spektrumun karakterizasyonuna, bakteriyosine özgü bağışıklığa ve salgılanan çekirdek algılama peptitlerinin saptanmasına izin veren optimize edilmiş bir bakteri kaplama testini açıklıyoruz.

Özet

Streptococcus pneumoniae, yerleşik organizmalarla rekabet etmesi gereken nazofarenksin çok çeşitli polimikrobiyal topluluğunu kolonize eder. Bakteriyel olarak üretilen antimikrobiyal peptitlerin (bakteriyosinler) bu rekabetçi etkileşimlerin sonucunu belirlediğini gösterdik. Tüm tam dizili pnömokok suşları a bakteriosin-l ike peptid (blp) lokusu barındırır. Blp lokusu, bir dizi farklı bakteriyosin ve bunların düzenlenmesi, işlenmesi ve salgılanması için gereken yüksek oranda korunmuş bileşenlerin tümünü kodlar. Lokusun bakteriyosin bağışıklık bölgesinde (BIR) bulunan bakteriyosinlerin çeşitliliği, pnömokok rekabetinin önemli bir katkısıdır. Bakteriyosinlerle birlikte, bağışıklık genleri BIR'de bulunur ve üretici hücreyi kendi bakteriyosininin etkilerinden korumak için gereklidir. Bindirme testi, bakteriyosinlerin aracılık ettiği rekabetçi etkileşimler için çok sayıda suşu incelemek için hızlı bir yöntemdir. Bindirme testi ayrıca bakteriyosin spesifik bağışıklığın karakterizasyonuna ve salgılanan çekirdek algılama peptitlerinin saptanmasına izin verir. Test, bakteriyosin üretimi için test edilecek bir suş ile bir agar plakasının önceden aşılanması ve ardından bakteriyosin duyarlılığı için test edilecek bir suş içeren yumuşak bir agar kaplamasının uygulanmasıyla gerçekleştirilir. Bıçağı çevreleyen bir boşluk bölgesi, kaplama suşunun önceden aşılanmış suş tarafından üretilen bakteriyosinlere duyarlı olduğunu gösterir. Herhangi bir boşluk bölgesi gözlenmezse, ya kaplama suşu üretilen bakteriyosinlere karşı bağışıktır ya da önceden aşılanmış suş bakteriyosin üretmez. Blp lokusunun belirli bir suşta işlevsel olup olmadığını belirlemek için, bindirme testi, önceden aşılanmış suş tarafından peptit feromon sekresyonunu değerlendirmek için uyarlanabilir. Bu durumda, kaplamada farklı feromon özgüllüğüne sahip bir dizi dört lacZ-raportör suşu kullanılır.

Giriş

Streptococcus pneumoniae, nazofarenks polimikrobiyaldir eden ortak bir şekilde koloni, bakteriyel olarak üretilmiş antimikrobiyal peptitler (bakteriosinler) üretimi aracılığıyla diğer pneumococci ve yakından ilişkili türleri ile rekabet edebilmektedir. Bugüne kadar incelenen her tam sıralandı pnömokok suşu b acteriocin- l ike p peptit odağı blp bir sürümünü içerir. Pnömokok bakteriyosin üretimi, hem in vitro ve in vivo sonuç ^1-4 rekabet önemli olduğu gösterilmiştir. Rekabetçi dinamikleri, spesifik peptit feromon tepki olarak aynı kökenli bağışıklık proteinlerle birlikte çeşitli bakteriyosinlerin ekspresyonu ile etkilenmektedir. Blp lokusunun indüksiyonu bir peptit feromon, BlpC, sensör kinaz BlpH bağlanan olan bir çekirdek algılama sistemi ile kontrol ve sonuçlanan bir sinyal akışını başlatır edilirblp lokus ^5,6 transkripsiyonu. BlpC dört alelik varyasyonlar vardır ki, kendi doğasındaki BlpH ⁶ her bağlanmaktadır. Hücre, kendi bakteriyosin etkilerini hayatta kalabilmesi için ortak kökenli bağışıklık proteinleri kodlayan genler bakteriyosin genlerin her biri ile aynı operonunun transkribe edilmektedir. Soy korunması için gerekli olan özel gen bağışıklık yetersiz kalması durumunda, bir rakip soyu dışsal feromon tepki olarak blp lokusu yukarı doğru düzenleme mümkün olup olmadığını ya Öldürme oluşur. Taşıyıcı kompleksi, BlpAB salgısı ile işleme peptit feromon ve bakteriyosin peptidler ^2,4 için gereklidir. Son zamanlarda, bu pnömokok suşları önemli bir bölümünün de bir durumdur bu feromonu ve bakteriyosin ^1,2 salgılamasına hale blpA geninde bir mutasyon korunmuş olması, yani "dolandırıcı" olduğu gösterilmiştir. Bu suşlar kişnemek tarafından salgılanan eksojen BlpC ² yanıt edebiliyoruzbağışıklık proteinlerin üretimi için izin sıkıcı suşları.

Süpernatanlarından bakteriyosinlerin, ham preparatlar saflık elde etmek için biyokimyasal yöntemler kullanılarak adımları Üretici türlerde hazırlanabilir, ancak, bu yaklaşım, büyük izolat koleksiyonlarının taranmasında yararlı değildir ve bakteriyosin ekspresyon seviyesinin suyu büyüyen kültürlerden düşükse ^{2,7- 9.} Bindirme deney in vitro olarak mevcut olabilir suşları arasındaki rekabet dinamiğini incelemek için hızlı bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bunu yapmak için, bir pnömokok soyu önceden aşılanmış agar plaka üzerine ve blp lokusunun uyarılması için yeterli lokal konsantrasyonları elde etmek için bakteriyel büyümeye izin verilir. Ikinci bir soy daha sonra hassasiyeti test etmek için önceden aşılanmış soyu üzerine uygulandığında, erimiş bir yumuşak agar çözeltisi içine aşılanır. (Inhibe edici aktivitesi bağımsız olarak) blp lokusunun değerlendirmek aktivitesi için, suşlar th bir dizi ile kaplanabilirDaha önce tarif BlpC haberci soylarını ree. Bu suşlar, pnömokok tarafından salgılanan en yaygın üç BlpC feromonlar yanıt üç farklı blpH allellerinden biri içeren yapılmıştır. Haberci soylarının bir BlpH bağımlı promotörün kontrolü altındadır ve kendini uyarma ^10,11 engeller blpC geninde bir delesyon yerine entegre bir lacZ genini sahiptir.

Protokol

Yapımcı Genleme 1. Hazırlık

1. Şerit, bir pnömokok kökenli soyu -80 ° C dondurucu stoktan% 5 koyun kanı triptik soya agar plakası üzerine bakteriyosin üretimi için test edilecek.
   Not: inhibisyonu için test edilecek olan soyun ilk büyüme kan plakaların kullanımı büyük ölçüde tahlilin tekrarlanabilirliğini arttırır. Büyüme koşulları, belirli bir organizmanın değiştirilmesi gerekebilir, ancak ek olarak, bakteriyosin üreten diğer non-pnömokok suşları kullanılabilir. Biz başarıyla yayma deneyi Streptococcus mitis ve Lactococcus lactis kullandık.
2. % 5 _CO2 ile 37 ° C 'de gece boyunca plaka (O / N) inkübe edin.
3. Üretici soyunun inkübasyondan sonra, TSA 25 ml ihtiva eden plakalar üzerine katalaz 3000 ila 4000 birimleri pipetleme triptik soya agar (TSA) plaka hazırlanması yapılmış ve steril cam boncuklar kullanılarak katalaz çözeltisi yayıldı. Yaklaşık 10 dakika altında plaka kurumasını bekleyinbiyolojik güvenlik kabini.
4. Bir pipet üzerine bakteri görünür bir miktar toplayın. Kurutulmuş TSA plakasına pipet bıçakla.
   NOT: Bir üretici suş daha fazlası tek bir TSA plakaya bıçakladı edilebilir. Oluşan haleler örtüşmeyen böylece bıçaklandığı uzayda önemlidir.
   1. Mümkünse, bir pozitif kontrol ve bir negatif kontrol olarak, kaplamayla kullanılacak soyu gibi bir üretici bakteriyosin bilinen maddeleri içerir.
      NOT: Pozitif ve negatif kontroller daha önce yayınlanmış ve istek ¹⁰ üzerine mevcuttur.
5. 6 saat boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de birden fazla saplamanız içeren TSA plaka inkübe edin.

Bindirme Genleme 2. Yapımı Gliserol Stokları

1. Yayma deneyi bir gün önce (gliserol ilave edildikten sonra orta üslü faza kadar yetiştirilir ve daha sonra -80 ° C'de saklandı kültürler), gliserol stokları hazırlayın. Pnömokok str 5-10 koloni aşılamakain% 0.5 maya ekstraktı (THY) Todd-Hewitt ortamda hassasiyet veya feromon salgılama açısından test edilmelidir.
   NOT: BlpC uyarılabilir gazetecilere İnşaatı daha önce ² tarif edilmiştir ve suşları istek üzerine mevcuttur.
2. Çalkalamadan 37 ° C su banyosu içinde sıkıca kapalı kapak THY 5 ml cam tüpler içinde 5-10 koloniler inkübe edin.
3. Bunlar, bir 0.5, 0.3 OD ₆₂₀ gelene kadar, 37 ° C kültürleri inkübe edin.
   NOT: Bu, kullanılan gerginlik bağlı olarak yaklaşık 4-5 saat sürer.
   1. Yavaşça tüpü OD ölçme önce bir kaç kez ters çevirin.
4. Deneme aynı gün yapılamaz veya zorlanma gliserol stoğu yapmak ve daha sonraki bir tarihte deney devam, gelecekte birden çok kez kullanılabilir edilecektir. Gliserol stokları için,% 20 bir son konsantrasyona kadar kültürler gliserol ekleyin. -80 ° C'de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza içine kısım kültürleri. NOT: Örnekler s olabilir-80 ° C'de ay boyunca yırtılmaktadır. Gliserol stokları yapmıyor ise, yayma deneyi doğrudan örnekleri kullanabilirsiniz.

3. Kaplama Testi

1. Hemen önce, uygulamayı bindirme bindirme bileşenleri karıştırmak için. 15 ml konik bir tüp içinde 5 ml THY, katalaz 3,000-4,000 U ve ya hemen aynı günde ya da oda sıcaklığında eritildi, kültür, bir gliserol stokları yetiştirildi katlamalı soy çorba kültürü 200 ul ilave edin. Raportör suşu kullanılarak, kaplama karışımına, X-gal ve 50 ul (40 mg / ml) ilave edilmektedir. Plaka başına bir konik bir tüp içinde kullanın.
2. Önce erimiş TSA ilave edilmeden önce oda sıcaklığında katlamalı karışımı dengelenmesi.
3. Inkübatör bıçaklanarak zorlanma ile TSA plakasını sökün. Mikrodalga katı TSA eritin ve kullanmaya hazır olana kadar 55 ° C su banyosunda tutmak. % 1.5 agar erimiş TSA 3 ml ekleyin karışımı katlamalı 55 ° C'ye kadar soğutuldu.
   1. Pipetlemeden önce hemen bindirme karışım hazırlayın, karışım çok katılaşmaya başlayacaktırhızlı. NOT: bindirme kaplama önce katılaşmaya başlar, sonuçlar uninterpretable olacaktır.
4. Pipetleme ve 5 ml'lik pipet karışımın içine kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olmak ile birkaç kez aşağı bindirme karışımı karıştırın. Yavaşça bıçaklayarak TSA plakasına doğrudan bindirme karışımı pipetle. Agar sertleşmesine izin birkaç dakika için masa üstü plaka tutun.
   1. Bindirme karışımı dağıtmak için plakasını döndürmek etmeyin, bu bindirmenin içine bıçakladı kültüründen büyüme çeker.
5. Dikkatle% 5 CO ₂ O / N (yaklaşık 16-18 saat) içeren 37 ° C inkübatör içine kalıbı ile TSA plakasını yerleştirin.
6. Gecede büyümeden sonra plakaları gözlemleyin. Plakalar inhibisyon veya feromon sinyal oluştu alanlar haricinde bindirme suşu büyüme opak görünmelidir. Bunlar sırasıyla, bıçaklanarak zorlanma çevresinde net ya da mavi bölgeler olarak görünecektir.
   NOT: Her ne kadar kuvmavi veya açıklığın çapının enlemeleri, niceliksel değerlendirilmesi için belirlenebilir çapı farklılıklar da plakasına býçaklanmýţ bakteri miktarına bağlı olarak değişebilir. Bindirme tahlil herhangi bir nicel değerlendirme dikkatle yorumlanmalıdır gereken, kalitatif bir testtir. Negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, herhangi bir görünür temizleme aktivite olarak kabul edilir.

Sonuçlar

Yayma deneyi iki olası sonuç vardır. Gece boyunca inkübasyondan sonra bıçakladı suşunun büyümesini görmek mümkün olmalıdır. Şekil 1A, üst tabaka gerilme Bakteriyosinler üretilen duyarlıdır. Atılımının bir bölge bıçakladı gerginlik çevredeki görülebilir. Buna ek olarak, kaplama karışımı içine bıçakladı soyun dönen mümkündür ve Şekil 1A 'da görülebilir. Şekil 1B, üst tabaka gerilme bıçak çevreleyen bir halo olmaması ile belirtildiği gibi salgılanan bakteriyosinlerin için ...

Tartışma

Bu bindirme tahlil bakteriyosin üreticileri için faaliyet alanını belirlemek ve pnömokok suşları arasında oluşabilecek rekabet etkileşimleri göstermek için hızlı bir yoldur. Bindirme deney, tek bir plaka üzerinde birden fazla bakteriyosin üretimi suşları taranması için kullanmak üzere adapte edilebilir. Başarıyla, 96 oyuklu bir plakanın yarısını SBA plakalarının aşılanması için bir 48 pimli çoğaltıcı kullanarak, bu deneyde büyük gerilme koleksiyon gösterildi. Gece boyunca inkübasyondan sonra, büyüme replikatörü kullanıl...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 5 Koyun Kanı ile Triptikaz Soya Agar	Fisher	B21261X	Dondurucu kültürlerinden büyüme için
Katalaz	Sigma	C100-500mg	Plaka başına 4.741 Birim
Todd Hewitt Et Suyu + Maya Özü (THY)	Fisher	DF0492-17-6	30 g THB, 5 g maya özütü, 1 L ddH2O otoklav
Triptikaz Soya Suyu + Agar plakaları (TSA)	Fisher	B11768 & nbsp;	30 g TS, 15 g agar, 1 L ddH2O otoklav
5-bromo-4-kloro-3-indolil ve beta;-D-galaktopiranosid (X-gal)	Sigma	B4252-50MG	Dimetilformamid
Petri kaplarında	Fisher	FB0875712
	kültürlerin OD değerini ölçer
C su banyosu
37 & derece; % 5 CO2
15 ml konik tüplü

çözün Spectrophometer 37 &> ; C inkübatör