In vitro sentezi insan hücrelerinde protein sentezlenmesinin uyarımından için mRNA'nın Değiştirilmiş

Özet

Bu video makalede, hücrelerdeki protein ekspresyon indüksiyonu için modifiye edilmiş mRNA in vitro sentezini tarif eder.

Özet

İstenilen hücrelerinde protein sentezinin endüksiyonu için sentetik mesajcı RNA (mRNA) kodlama eksojen dağıtım rejeneratif tıpta, temel hücre biyolojisi, hastalıkların tedavisi ve hücrelerin yeniden programlanmasının alanlarında büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, akış sitometrisi ile indüklenmiş protein ekspresyonu azaltılmış immün aktivasyon potansiyeli ve stabilitesi arttırılmış üretilen mRNA kalite kontrolü, hücrelerin transfeksiyonu mRNA ile ve test modifiye mRNA'nın üretimi için aşamalı protokolde bir adım tarif eder. EGFP mRNA ile tek bir transfeksiyon sonrasında 3 güne kadar, transfekte edilmiş HEK293 hücreleri eGFP üretir. Bu video makalede, EGFP mRNA sentezi bir örnek olarak tarif edilmektedir. Bununla birlikte, bu prosedür, diğer arzu edilen mRNA'nın üretilmesi için uygulanabilir. MRNA, modifiye edilmiş sentetik kullanarak hücreleri geçici olarak normalde eksprese olmaz arzu edilen proteinleri eksprese etmek için uyarılan edilebilir.

Giriş

Hücrelerde, haberci RNA transkripsiyon (mRNA) ve istenen mRNA'nın proteinlere aşağıdaki çeviri hücrelerin düzgün işleyişini sağlamak. Kalıtsal veya sonradan kazanılmış genetik bozukluklar proteinlerin yetersiz ve işlevsiz sentezine yol ve şiddetli hastalıklara neden olabilir. Bu nedenle, eksik ya da kusurlu protein üretimini uyarmak için yeni bir tedavi yaklaşımı hücreler içine mRNA, değiştirilmiş sentetik eksojen dağıtım, istenilen protein için kodları. Böylece, hücreler normal olarak üretemez ya da doğal olarak ihtiyaç olan fonksiyonel proteinleri sentezlenmesi için tetiklenir. Bu yaklaşım kullanılarak, genetik bozukluklar mRNA'nın katılmasıyla çözülebildiğini bozuk veya eksik protein ¹ kodlar. MRNA, tedavi aynı zamanda tümör hücrelerinin ya da patojen uyarıcılar tarafından ifade edilen proteini antijenleri ile sentezlemek için aşılama için kullanılabilir. Böylece, konak bağışıklık sistemi tümör hücrelerini etkili bir şekilde ortadan kaldıracak ya INFE önlemek için etkinleştirilebilirseksiyonlar ^2,3. Bundan başka, son yıllarda, mRNA, başarılı bir şekilde uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) üretmek için kullanıldı. Bu amaçla, fibroblastlar yeniden programlama için sentezleme ^4-6 faktörleri uyarılması için ve rejeneratif tıpta büyük bir potansiyele sahip iPSCs bunları dönüştürmek için mRNA ile transfekte edilmiştir.

Daha önce, bilinen mRNA kullanımı, düşük stabilite ve güçlü immünojenite ile ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, geleneksel bir mRNA klinik uygulamalar ile sınırlı kalmıştır. Bununla birlikte, Kariko ve arkadaşları tarafından mRNA molekülü içinde 5-metilsitidin ve pseudouridine ile sitidin ve üridin yerine biyolojik sıvılar içinde kararlı mRNA moleküllerini hale getirilir ve önemli ölçüde artık tadil edilmiş mRNA'ların klinik uygulanabilirliği karşılaştırın immün ^{aktivasyonu, 7-10,} azaltmıştır.

Sentetik olarak üretilen tadil edilmiş mRNA'ların kullanarak, istenen gen transkript geçici olarak in vivo ¹¹ teslim edilebilirya da in vitro protein ifadesini uyarmak için. İlave edilen mRNA, hücre nakil mekanizması tarafından fizyolojik koşullar altında çevrilmiştir. Nedeniyle Viral gene terapi vektörleri göre konakçı hücre genomuna entegrasyon eksikliği, onkojenez riski ^12,13 önlenir. Böylece, modifiye sentetik mRNA kullanılarak tedavi gelecekte daha iyi klinik kabul alırsınız.

Burada, modifiye mRNA üretiminde (Şekil 1) mRNA ile hücreler ve transfekte hücrelerde protein ifade değerlendirilmesi, transfeksiyon için detaylı bir protokol açıklar.

Protokol

Gerekli olan DNA dizinlerini Kodlama içeren plazmidlerin 1. Büyütme (CDS)

1. Ön oda sıcaklığına getirilmiş ve dönüşüm kiti dahildir SOC ortamında, 37 ° C'de 100 ug / ml ampisilin ihtiva eden LB agar plakaları. 42 ° C su banyosu dengeye getirin.
2. Kimyasal bileşen E bir şişe çözülme buz üzerinde coli.
3. Kimyasal bileşen E. şişe içine CDS içeren plazmidin 1-5 ul (100 ng, 10 pg) ekleyin coli ve hafifçe karıştırın. Pipetleme hücreleri karışmaz. Plasmidlerini ekledikten sonra, yavaşça tüp dokunarak karıştırın.
4. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe karışımı.
5. Isı şok E. çalkalamadan bir su banyosu içinde 42 ° C sıcaklıkta 30 sn için E. coli.
6. 2 dakika boyunca buz üzerinde şişe yerleştirin.
7. E. önceden ısıtılmış SOC ortamında 250 ul ekleyin E. coli bakteriyel bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C de 1 saat süre ile, 300 rpm'de yatay bakteri sallayın.
8. 100 ul ve önceden ısıtılmış LB agar plakaları üzerinde bir dönüşüm karışımı 150 ul yay plakalar ters çevirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
9. Koloniler görünür hale sonra, 100 ug / ml ampisilin ile 5 ml LB ortamı içeren 15 ml'lik bir kültür tüpü içine, her plakadan tek bir koloni inoküle. Kültür late Günlük veya durağan faz içinde yer alana kadar 300 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de gece boyunca inkübe.
10. Dönüşmüş E. coli, uzun süreli depolama için E. coli, pipeti dondurarak saklamaya uygun viallerin içine% 100 gliserol, 75 ul. Bakteri kültürüne (dondurulmuş bir stoku,% 25 gliserol içeren) 225 ul eklenir, iyice karıştırılır ve -80 ° C 'de cryovial saklayın.
11. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir plazmid arındırma kiti ile birlikte istenen CDS içeren plazmidler izole edin.
12. Bir spektrofotometre kullanılarak, plazmid konsantrasyonunun belirlenmesi.
13. 20 ul alikotları hazırlanması ve uzun bir süre boyunca -20 ° C'de saklayın.

Plazmid Ek'lerin BORSASI "> 2. Amplifikasyon ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu Poli T-kuyruk ekleme (PCR)

1. Not: PCR kullanılarak amplifiye edilir, in vitro transkripsiyon (IVT), burada söz konusu CDS EGFP için DNA şablonu elde etmek için. Aynı zamanda, 120 timidinler (T) 'in bir poli T-kuyruk T ₁₂₀ uzantılı bir ters primer kullanılarak inserte eklenmiştir. Böylece, oluşturulan mRNA'lar IVT sonra tanımlanmış bir uzunluğa sahip olan bir poli A kuyruğu elde edilir.
2. Tablo 1 'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi PCR ile bir karışım hazırlayın.
3. Iyice reaksiyon karışımı karıştırın. Not: PCR ürünü, 4-5 IVT reaksiyonlarında kullanılabilir. IVT için DNA şablonu miktarını artırmak için, PCR karışımı, toplam hacmi arttırılabilir. Birkaç PCR tüpleri, her biri 100 ul PCR karışımı, PCR ürünü yeterli bir verim elde etmek için kullanılabilir.
4. Bir PCR PCR tüpleri yerleştirin ve PCR çevrim protokolü (Tablo 2) kullanılarak PCR çalıştırın.
5. P temizleyin20 ul nükleaz içermeyen su kullanılarak DNA üreticinin talimatlarına ve elüte göre olan bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak CR reaksiyonu.
6. Bir spektrofotometre kullanılarak, DNA'nın konsantrasyonu ölçümü. Not: Saptanan DNA konsantrasyonu yaklaşık olarak 300 ug / ml'dir. Böylece, beklenen toplam miktarının ~ 6 mg olmalıdır. Diğer proteinler için DNA miktarı CDS uzunluğuna bağlı olarak farklı olabilir, plazmid miktarı PCR, primer tavlama sıcaklığı ve devir sayısı için de kullanılır.
7. Uzun bir süre için, -20 ° C'de DNA Freeze veya IVT doğrudan kullanın.

3. Kontrol Adım: PCR Ürünü Kalitesi

1. DNA jel elektroforezi ile PCR ürününün kalitesini kontrol edin.
2. Bir şişe içinde 1 x TBE agaroz istenilen miktarda karıştırın. Bir% 1 agaroz jeli için, 1 x TBE, 50 ml agaroz 0.5 g ekleyin.
3. Agaroz kadar mikrodalga eritilir. Kaynamaya izin vermeyin. Agaroz çözüm tamamen olduğundan emin olun.
4. 50 ml agaroz jel için 5 ul nükleik asit jel leke ekleyin.
5. , Bir agaroz jel kutuya jel dökün tarağı ayarlayın ve jel katılaşmış kadar yaklaşık 1 saat bekleyin.
6. Tarağı çıkarın ve bir jel tepsiye jel kutusu yerleştirin.
7. 12 ul bir toplam hacimde 2 ul, 6x yükleme tamponu ile 80-10,000 bp'lik bir DNA merdiven 2 ul (200 ng) ve PCR ürünü, 200 ng her karıştırın.
8. Dikkatlice agaroz jel kuyu içine DNA örnekleri yükleyin.
9. Tampon olarak 1 x TBE kullanarak 1 saat boyunca 100 V'ta agaroz jel üzerinde çalıştırıldı.
10. Bir görüntüleme sistemi (Şekil 2) DNA bantları görselleştirmek.

4. in vitro transkripsiyon (IVT)

1. Not: PCR'den sonra plasmit amplifiye edilir ve bir poli T kuyruğu eklenmiştir. IVT sırasında genetik bilgi haliyle RNA'nın DNA'dan transkribe edilmektedir. Oluşturulan mRNA transkript hücrelerde proteinlerin üretilmesi için kullanılır.
2. Bir Rnase d çalışma alanı ve pipetler temizleyinecontamination çözeltisi. Reaksiyon RNases karışır sık ​​sık kullanımı, PCR, temiz ve steril çift filtre pipet uçları ve kirlenmeyi en aza indirmek için eldiven değiştirmek.
3. Tablo 3'te tarif edildiği gibi NTP / kap benzeri bir karışım hazırlayın.
4. Vorteks ile iyice NTP / kap analog karışımı karıştırın ve kısaca aşağı doğru döndürün.
5. Tablo 4'te tarif edildiği gibi IVT, reaksiyon karışımı bir araya getirin.
6. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme iyice IVT reaksiyon karışımı karıştırın. Daha sonra tüpün altındaki karışımın toplanması için kısa bir süre için PCR tüpü santrifüj.
7. Termomikser içinde 3 saat 37 ° C'de inkübe edilir.
   NOT: En uygun kuluçka zamanı ekler ve belirli bir şablon transkripsiyonel etkinliğinin uzunluğuna bağlıdır. Kısa uçlar (nt <500), bir uzun bir enkübasyon süresi avantajlı olabilir. Bir zaman ders deney maksimum verim için optimum inkübasyon süresini belirlemek için yapılabilir. Bu nedenle, exampl için, IVT reaksiyonları kurmake 1, 2, 3, 4, 6 saat, ve gece boyunca kuluçka için ve mRNA miktarının belirlenmesi. EGFP mRNA üretimi için in vitro transkripsiyon kinetiği Şekil 3'te gösterilmiştir.
8. , Şablon DNA kaldırmak IVT Reaksiyon karışımına DNase 1 ul (2 U / ml) ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edilir.
9. Imalatçının talimatlarına uygun olarak bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyon karışımının saflaştınlır. 40 ul nükleaz içermeyen su ile iki kez spin kolon zardan modifiye mRNA'nın tasfiye edilir. Not: bulgulanan RNA konsantrasyonu, yaklaşık 1.500 ug / ml arasındadır. Böylece, beklenen toplam miktarı, ~ 120 ug olması gerekir. Diğer proteinler için sentez mRNA miktarı CDS uzunluğu ve IVT için kullanılan PCR ürününün miktarına bağlı olarak değişebilir.

Antarktika fosfataz ile saflaştırılmış mRNA 5. Tedavi

1. Not: üretilen mRNA 5 çıkarmak için fosfataz ile işlemden geçirildi 'tri-Bağışıklık aktifleşmesi Rig-I tarafından tanınan ve kurşun olabilir fosfatlar. Ayrıca, fosfotaz muamelesine kendinden ligasyon reaksiyonunda yeniden daire haline engeller.
2. Saflaştırılmış mRNA solüsyonuna 79 ul 10x Antarktika fosfataz reaksiyon tampon maddesi 9 ul ekleyin. Daha sonra, Antarktika fosfataz (5 U / ul), 2 ul ekleyin ve yavaşça örnek karıştırın. 30 dakika boyunca 37 ° C'de, reaksiyon karışımı inkübe edin.
3. Imalatçının talimatlarına uygun olarak bir RNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyon karışımının saflaştınlır. 50 ul nükleaz içermeyen su ile iki kez spin kolon zardan modifiye mRNA'nın tasfiye edilir.
4. Bir spektrofotometre kullanılarak, modifiye mRNA'nın konsantrasyonu ölçümü. Giriş 260 nm / 280 nm'de absorbans, (A ₂₆₀ / A _280), ≥ 1.8 ve ₂₆₀ oranı / ₂₃₀ saflığa işaret eden, 2.0 olduğundan emin olun.
   NOT: beklenen toplam verim, hangi sufficie olduğunu, yaklaşık 90 ug olmalınt yaklaşık 36 mRNA Transfeksiyonlar için.
5. Nükleaz içermeyen su ilave edilerek, 100 ng / ul mRNA konsantrasyonu ayarlayın.
6. -80 ° C'de Transfeksiyonlar ve mağaza için gerekli olan tek kullanımlık kısma modifiye mRNA'nın kısım. Birden fazla donma ve çözülme döngüleri kaçının. Düzgün hazırlanmış ve mRNA yıllardır istikrarlı saklanır. Çalışma sırasında, her zaman buz üzerinde modifiye mRNA tutun.

6. Kontrol Aşama: Sentezlenen Modifiye mRNA'nın Kalitesi

1. RNA, jel elektroforezi ile modifiye mRNA'nın kalitesini kontrol edin.
2. Bir şişe içinde 1 x TBE agaroz istenilen miktarda karıştırın. Bir% 1 agaroz jeli için, 1 x TBE, 50 ml agaroz 0.5 g ekleyin.
3. Agaroz kadar mikrodalga eritilir. Kaynamaya izin vermeyin. Agaroz çözüm tamamen olduğundan emin olun.
4. 50 ml agaroz jel için 5 ul nükleik asit jel leke ekleyin.
5. Bir agaroz jel kutuya jel dökün tarağı ayarlayın ve jel soli oluncaya kadar yaklaşık 1 saat beklemekasitleştirildi.
6. Tarağı çıkarın ve bir jel tepsiye jel kutusu yerleştirin.
7. 0.5-10 kb RNA merdiveni 3 ul (3 ug) ve mRNA, 10 uL bir toplam hacimde 7 ul yükleme tamponu ile değiştirilen her sentezlenir 200 ng karıştırın. Yükleme tamponu kompozisyonu, Tablo 5'te tarif edilmektedir.
8. 10 dakika süreyle 70 ° C de merdiven ve mRNA örnekleri, denatüre.
9. Dikkatle merdiveni ve% 1 agaroz jel üzerinde mRNA örnekleri yükleyin.
10. Tampon olarak 1x TBE kullanılarak 1 saat boyunca 100 V elektroforezi gerçekleştirin.
11. Bir jel dokümantasyon sistemi (Şekil 4) kullanılarak UV transilluminator ve fotoğraf üzerinde merdiven ve mRNA bantları görselleştirmek.

7. Transfeksiyonu için Hücrelerin Hazırlanması

1. 12 gözlü plakanın her bir kuyucuğu Levha 2 x 10 ⁵ hücreleri (HEK293 hücreleri) içerir.
2. Bir hücre kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe hücreleri. Not: transfeksiyon gününde, hücreler REAC olmalıdır% 80-90 hed.

8. Hücre mRNA Transfeksiyon gerçekleştirme

1. Modifiye edilmiş mRNA çözülme.
2. Transfeksiyon için lipoplexes oluşturur.
3. Modifiye edilmiş mRNA, 25 ul (2.5 ug) ve 12-çukurlu bir levhanın bir kuyu transfeksiyonu için transfeksiyon karışımı oluşturmak üzere, serum ortamı, indirgenmiş 473 ul Opti-MEM (Minimal Essential Medium) katyonik lipit transfeksiyon reaktifı 2 ul ekleyin. Transfekte edilecek kuyu sayısı uygun hacimleri Scale. Negatif bir kontrol olarak, mRNA olmadan bir transfeksiyon karışımı hazırlayın.
4. Pipetleme tarafından yavaşça karıştırınız. Transfeksiyon için lipoplexes oluşturmak için 20 dakika boyunca oda sıcaklığında transfeksiyon karışımı inkübe edin.
   NOT: transfeksiyon karışımı hiçbir antibiyotikler içerir. Böylece, hücrelerin kullanımı sırasında kısırlık sağlamak için özen gösterin.
5. 500 ul DPBS hücreleri yıkayın / kuyu.
6. 12-iyi bir pla iyi biri transfeksiyon karışımı ul 500 eklete.
7. 37 ° C de 4 saat ve% 5 _CO2 için hücreleri inkübe edin.
8. Transfeksiyon karışımı aspire ve hücrelerin 1 ml tam hücre kültür ortamına ilave edin.
9. Hücre kuluçka makinesi içinde 24 saat boyunca kuluçkaya bırakılır.
10. Floresan mikroskobik yapın bir floresan mikroskobu (Şekil 5) kullanılarak analiz eder. Not: eGFP dışında mRNA, mRNA kodlayıcı ile transfeksiyon ile üretilen hücrelerde başka proteinlerin ekspresyonunu incelemek için hücreler, lamelleri yetiştirilebilir. Daha sonra transfeksiyon gerçekleştirilebilir ve hücreler, uygun antikorlar ile boyanmış ve fluoresan mikroskobu ile analiz edilebilir.

Hücrelerde eGFP İfade 9. Akış Sitometrik Analizleri

1. Kaynaklardan gelen hücre kültürü ortamı çıkarın ve (kalsiyum ve magnezyum içermeyen), 1 ml DPBS ile her bir yıkama. Hücre kültür plakalarının yüzeyinden hücreleri ayırmak için oyuk başına 500 ul tripsin / EDTA ilave edin. Daha sonra, 500 eklemekul TNS başına iyi tripsin inaktive.
2. Oda sıcaklığında, 300 x g'de 5 dakika boyunca müstakil hücreleri santrifüjleyin. Sadece pelet bırakarak süpernatantı. 150 ul hücre sabitleme çözeltisi hücre pelletini ve tüp sitometri akışı içine hücre süspansiyonu aktarın.
3. EGFP ifade eden hücrelerin yüzdesini ve Coğrafi İfade (floresan yoğunluğunun geometrik ortalama) (Şekil 6) kullanılarak floresans yoğunluğu analiz edin.

Over Time Protein İfade 10. Ölçümü

1. Ayrıca 8. adımda tarif edildiği gibi, bir 12-yuvalı plakanın 3 gözleri içindeki hücreler mRNA transfeksiyonu yapın mRNA ilavesi olmadan transfeksiyon karışımı ile HEK293 hücrelerinde 3 kuyu inkübe edin.
2. EGFP 1, 2 ekspresyonunu ölçmek ve Transfeksiyondan 3 gün sonra, proteinin (Şekil 7) süresini değerlendirmek.

Sonuçlar

EGFP CD içeren pcDNA 3.3 plasmidi kullanılarak, tadil edilmiş eGFP mRNA sentezi (Şekil 1) kurulmuştur. PCR ile uç amplifikasyon ve poli T-atık sonra, yaklaşık 1100 bp uzunluktaki temiz bir bant (Şekil 2) tespit edilir. MRNA (Şekil 3) verimi IVT zaman Artırılmış artırılması. IVT sonra, yaklaşık 1100 bp uzunluğunda bir açık mRNA bandı üretilecek EGFP mRNA'nın uzunluğu (Şekil 4) tekabül edecek şekilde tespit edilmiştir.

Oluştur...

Tartışma

MRNA, tedavi rejeneratif tıpta, hastalıkların ve aşı tedavisi alanında büyük bir potansiyele sahiptir. Bu video, hücrelerdeki protein ifadesinin endüksiyonu için bir stabilize edilmiş, modifiye mRNA'nın üretmektedirler. Bu protokol kullanılarak, istenen diğer mRNA oluşturulabilir. Modifiye edilmiş mRNA in vitro sentez hedef proteinlerin sentezlenmesinin uyarılması için arzu edilen mRNA ile hücrelerin transfeksiyonu sağlar. Ekzojen olarak teslim mRNA tamamen indirgendi kadar Böylece, arzu edilen protein, fiz...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hücre kültürü
DMEM, yüksek glikoz	PAA	E15-009
FBS	Yaşam Teknolojileri	10500
Penisilin / Streptomisin	PAA	P11-010	100x
L-glutamin	PAA	M11-004	200 mM
DPBS, kalsiyum ve magnezyum içermez	PAA	E15-002
%0.04 Tripsin / %0.03 EDTA	Promocell	C-41020
TNS	Promocell	C-41120	Tripsin Nötralize Edici Çözelti,% 0.1 BSA HEK-293 hücrelerinde% 0.05 tripsin inhibitörü
	ATCC	CRL-1573
< güçlü > Sarf Malzemeleri< / güçlü >
doku kültürü plakaları, 12 kuyulu	Corning	3512
Hücre kültürü şişesi (75 cm2)	Corning	430641
DNaz ve RNaz içermeyen 1,5 ml steril mikrosantrifüj tüpleri	Eppendorf	0030 121.589	Safe-Lock, Biopur
15 ml konik tüpler	greiner bio-one	188271
PCR temiz ve steril epT.I.P.S. çift filtreli pipet uçları	Eppendorf	10 ve mikro; L: 022491202; 100 ve mikro; L: 022491237; 1.000 ve mikro; l: 022491253
Cryovial	greiner bio-one	122279-128	Cryo.s
Bakteri kültürü için 14 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüp	BD Falcon	352059
Plazmid amplifikasyonu ve saflaştırması
>pcDNA 3.3_eGFP Plazmid	Addgene	26822
One Shot Top10 kimyasal bileşen Escherichia coli	Invitrogen	C4040-10
Steril su (Ampuwa)	Fresenius Kabi	1636071
LB ortamı (Luria/Miller)	Carl Roth	X968.1	25 g L-1 steril suda çözün.
LB agar (Luria/Miller)	Carl Roth	X969.1	40 g L-1 steril suda çözün.
Ampisilin Hazır Çözelti	Sigma Aldrich	A5354	100 mg / ml & nbsp;
Gliserol	Sigma Aldrich	G2025
QIAprep Spin Miniprep Kiti	Qiagen	27104
mRNA production
HotStar HiFidelity Polimeraz Kiti	Qiagen	202602
QIAquick PCR Arıtma Kiti	Qiagen	28106
MEGAscript T7 Takımı	Yaşam Teknolojileri	AM1334
5-Metilsitididin-5 akut, -trifosfat ve nbsp;	Trilink	N1014	5-Metil-CTP
Psödouridin-5&akut;-trifosfat	Trilink	N1019	Yalancı UTP
3&akut;-O-Me-m7G(5&akut;)PPP(5&akut;)G RNA kapak yapısı analog	New England Biolabs	S1411L
RiboLock RNaz İnhibitörü	Thermo Scientific	EO0381	40 U/µ l
TURBO DNase	Yaşam Teknolojileri	AM1334	2 U/&mikro; l (MEGAscript T7 Kit'ten)
Antarktika fosfataz	New England Biolabs	MO289S
RNeasy mini kiti ve nbsp;	Qiagen	74104
RNaseZap çözümü	Yaşam Teknolojileri	AM9780
Transfeksiyon
>Lipofectamine 2000 Transfeksiyon Reaktifi	Invitrogen	11668-019	Katyonik lipid transfeksiyon reaktifi
Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı	Invitrogen	11058-021	Fetal Sığır Serumu (FBS) takviyesinin azaltılmasına izin veren Geliştirilmiş Minimal Esansiyel Orta (MEM);
Jel elektroforezi
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Jelli Nükleik Asit Jel Lekesi	Biotium	41003	10.000x suda
peqGOLD Range Mix DNA-Merdiven	Peqlab	25-2210
Flow sitometri analizleri
CellFIX (1x)	BD Biosciences	340181	10x konsantre
Kesici uç amplifikasyonu ve poli (T) kuyruk PCR için astar
Forward Primer (HPLC sınıfı) 10 & M	Ella Biotech		5&akut;-TTGGACCCTCGTAC AGAAGCTAATACG-3&akut;
Ters Astar (HPLC sınıfı) 10 & mikro; M	Ella Biotech		5&akut;- T120-CTTCCTACT CAGGCTTTATTCAA AGACCA-3&akut;
Equipment
Cell inkübatör	Bağlayıcı		CO2 (%5) ve O2 (%20)
CASY hücre sayacı	Schä rfe Sistem
Steril Çalışma Tezgahı	BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH
Bakteriyel inkübatör	Incutec
Su banyosu
ScanDrop spektrofotometresi	Analitik Jena
PCR ısı döngüsü	Eppendorf
Mikrosantrifüj	Eppendorf
Vortex	peqlab
Thermomixer	Eppendorf
Elektroforez için jel aparatı	Bio-Rad
Jel dokümantasyon sistemi	Bio-Rad
FACScan Sistemi	BD Biosciences
Floresan mikroskobu	Nikon
Faz kontrast mikroskobu	Zeiss