Method Article

Diş Kompozit Cytocompatibility Değerlendirme Verimli Yöntemi olarak Confocal Time Lapse Görüntüleme

DOI:

10.3791/51949

⸱

November 9th, 2014

 ,  ,  , 
1Laboratoire des Multimatériaux et Interfaces, UMR CNRS 5615, Université Lyon1, 2UFR d'Odontologie, Université Lyon1; Service de Consultations et de Traitements Dentaires, Hospices Civils de Lyon, 3UFR d'Odontologie, Université Paris Diderot; Service d'Odontologie, APHP, Hôpital Rothschild

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diş kompozit biyouyumluluk en çok çalışılan yönü floresan sinyal ölçümü ile birlikte kendi sitotoksisite 3D CLSM time lapse görüntüleme zamanla hücre kaderinin duyarlı değerlendirilmesine olanak olduğunu. Bu yöntemi kullanan diş kompozit cytocompatibility değerlendirmek için etkili bir araç olabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu genel olarak in vitro hücre malzemesi etkileşimi diş malzemesi biyouyumluluk değerlendirilmesinde yararlı bir kriter olduğu kabul edilmektedir. Bu çalışmanın amacı, diş kompozitlerin in vitro biyolojik uyumluluğunun değerlendirmek için 3 boyutlu CLSM zaman atlamalı confocal görüntüleme kullanmaktı. Bu yöntem, diş bileşik özleri ile temas içinde canlı hücre oranının doğru ve hassas bir göstergesi sağlar. ELS ekstra düşük büzülme, doğrudan restorasyonu için kullanılan bir diş kompozit, örnek olarak alınmıştır. In vitro değerlendirme Live / Dead boyası kullanılarak kültüre birincil insan dişeti fibroblast hücreleri üzerinde gerçekleştirildi. Görüntüler FV10i confocal biyolojik ters sistemi ile elde ve FV10-ASW 3.1 Yazılımı ile analiz edildi. Görüntü analizi süreye 5 saat sonra, test edilen bileşiğin varlığında, çok hafif bir sitotoksisite göstermiştir. Hücre canlılığı hafif bir azalma, test edilen bileşik özütler karş ile temas halinde gösterilmiştired hücreleri kontrol etmek. Bulgular niteliksel ve niceliksel olarak diş kompozit biyouyumluluk davranışlarını değerlendirmek için hassas bir yöntem olarak 3D CLSM time lapse görüntüleme vurguluyor.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyouyumluluk tanımlamak için ISO önerileri kote önemli ölçütlerden biri, hücrelere malzeme toksisite olmaması. Reçine tabanlı diş kompozitler zaman 1-4 üzerinde ve / ya da geç bozunma süreçleri kısmi polimerizasyon başlangıçta nedeniyle olabilir reçineli matrisi bileşenleri, bırakabilir. Bu serbest bileşenler ağız dokuları ile temas ve ürtikeryal ve mukozal reaksiyonlar 5 hastada 6 alerji ve aşırı duyarlılık reaksiyonları geliştirilmesi, mitojene üzerinde tipine dişeti fibroblastlar morfolojisi ve azaltılması modifikasyonları I kollajen protein 7, immünosüpresyonun veya immünostimülasyon gibi çeşitli sakıncaları olabilir genotoksik potansiyel 9 altını saflaştırılmış T-lenfositler ve dalak hücreleri 8 ve primer GF'lerinin DNA hasarı -sürümlü çoğalması. Birçok parametreler gibi c gölge gibi diş kompozit toksisitesini etkileyebiliromposite, ışıkla sertleşen reçine monomer kimyasal bileşim olup, dolgu maddesi ve dönüşüm 10- 13 derecesine bağlıdır. Malzemelerin in vitro toksik potansiyel vivo durumlarda tahmin ve bazı ilgili son noktaların çalışmada klinik durumlara göre olabilir çünkü. Diş bileşikler ve bunların bileşenleri sitotoksisitesi yaygın olarak hücre kültür sistemleri 14- 16 ile değerlendirilmiştir.

Bu in vitro sistemler vadede diş kompozit biyolojik uyumu değerlendirmek için geliştirilmiştir: hücre büyümesi ve hücre apoptozu, hücreler 17 gibi, THP-1monocytes kullanılarak GF'lerinin 18 sitotoksisite, HaCaT'ta inflammatuar potensiyelleri hücreler 2, hücre fonksiyonu gibi keratinositler odontoblast- MDPC-23 hücreleri 19 toplam RNA seviyelerinin azaltılması ve insan dişeti apoptoz indüklenmesinde önemli bir artış gibi keratinositler, 20 veDişeti ve posa fibroblast hücreleri 21 DNA hasarı.

Farklı yöntemler diş kompozit biyouyumluluk araştırmak için önerilmektedir. Belirli bir renklendirici ve hafif tutma ölçümleri gibi kolorimetrik tahlilleri, nedeniyle göreli olarak basit ve düşük maliyetli 22 ila 26, en yaygın olarak kullanılan kalır. Işık aksine mikroskopisi analizi sık sık daha fazla zaman harcar ve yüksek maliyetler doğurur. Ancak, bu mikroskopi teknikleri bazı önemli avantajları var. Hücre yapısının gözlem, böylece daha ilgili ve hassas veriler sağlayan, deneyimli toksik etkileri hakkında genişletilmiş bilgi verir. Özellikle, konfokal mikroskopi 27 giriş, geleneksel geniş alan görüntüleme floresan mikroskopları ile karşılaştırıldığında eksenel çözünürlüğünü artırılması ile biyolojik yapıların gözlem için izin verdi. Dolayısıyla, konfokal görüntüleme farklı alanlarında güçlü bir araştırma aracı haline gelmiştirtıbbi ve bilimsel araştırmalar. Elektronik mikroskopi teknikleri farklı olarak, tarama, konfokal mikroskopi özel flüoresan işaretler dahil edilmesi ile hücrelerin ayrı bileşenleri görselleştirmek için olanağı sunar. Bu özel izleyici çoğu klinik kullanım alanı ve ayrıca laboratuar araştırma çalışmaları sağlayan, bir sulu ortam içinde kararlı makul ölçülebilir, ucuz ve 28 toksik olmayan. Ayrıca, geleneksel bir elektronik mikroskopi analizi için gerekli olan numune kurutma ve fikse zaman atlamalı konfokal görüntüleme için gerekli değildir, ve böylece zaman bağımlı alıcı numuneleri üzerinde de mümkündür. İki-boyutlu görüntü ile karşılaştırıldığında, konfokal görüntüleme maddenin, örnek altı görselleştirme ve farklı edilen derinlik görüntüleri üç-boyutlu yapı, yeniden sağlar; ile sonuçlanan, daha hassas ve daha fazla sayıda yapısal detayları 29, 30. Mevcut Video Çalışma üç boyutlu Hızlandırılmış C kullanımının bir örneğiyenilikçi bir yöntem olarak Dead / Canlı floresan etiketleme ve sinyal ölçümü ile kombine onfocal Lazer Tarama Mikroskobu (3D-CLSM). Bu çalışmada sunulan teknik değerlendirilen hücre yapısını değiştirmeden canlı hücreleri hassas değerlendirilmesi ve time-lapse görüntüleme avantajına sahiptir. Hiçbir hazırlık adımları confocal analizden önce gereklidir. Daha önce, aynı boyama kültürlenmiş süngerimsi kemik çekirdek 31 uygunluğu değerlendirmek için, ancak şu konfokal hızlandırılmış kullanılmıştır. Benzer şekilde, aynı time-lapse konfokal prosedürü / belirli bir bakteri yaşıyor ölü boyama kullanarak kendi Gram türüne 32'ye göre aktif çamur bakterilerde eritromisin zaman öldürmek aktivitesini değerlendirmek için kullanıldı. Bu yöntemler, son uyarlanmıştır ve metakrilat monomerlere 11 göre diş kompozit toksisitesini karşılaştırmak için kullanılmıştır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, üç ana adımdan oluşur: ilk adım kültür ortamı kompozit özü hazırlanmasını içerir; İkincisi ise birincil GF'lerinin (HGF), hücre kültürü, kompozit özleri ve hücre boyama ile hücreler temas; Üçüncü adım konfokal görüntüleme ve flüoresan sinyal analiz oluşur. Dişeti dokuları almak için, protokol Fransız mevzuatında, aydınlatılmış onam ve yerel etik kurul uygun kabul edildi.

1. Kompozit ayıklar Hazırlık

Elüsyon maddesi olarak Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) kullanın. Örneklerinin yüzey alanı ve ekstraksiyon ortamının hacmi arasındaki oran, ISO 10993/12 gereksinimleri en düşük seviyede olduğundan emin olun. Prosedür son 11 tarif ve aşağıda kısaca özetlenmiştir:

  1. Bir ısmarlama tutun kullanarak sertleşmemiş diş kompozit küresel numunelerini oluşturmaker. Tutucu boyutu oral klinik tedavisinde genel olarak tavsiye sertleştirme derinliğine bağlı olarak bir yarıçapı 2 mm.'dir.
  2. Plaka kuyuları hazırlayın,% 5 penisilin / streptomisin ve amfoterisin karışımı% 1 ile cenin sığır serumu (FBS) olmayan bir kültür ortamı, her biri 1 mi (DMEM).
  3. 40 saniye için 1.070 mW cm-2 yoğunluğunun (λ = 465-475 nm), bir LED ışık lambası kullanılarak de ihtiva eden DMEM ortamı içinde tedavi örnekleri. Sertleştirme ucu ve numuneler arasındaki mesafe 0.5 mm aralığı içinde olduğundan emin olun. Diş ve iyileşmemişken diş kompozit arasındaki geçici temas simüle etmek için bu kür modu kullanın. Onar bileşik ve ağız boşluğuna yerleştirildiği zaman, klinik durumda, temas halinde.
  4. Hava içinde% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosfer altında 37 ° C'de örnekleri (DMEM ortamında kompozit numuneler) inkübe edin. Aynı koşullarda kontrol hücreleri için (bileşik örnekleri olmadan) DMEM ortamı inkübe edin.

2. HGF Hücre Kültürü, Kompozit ayıklar Test ve Hücreler Boyama

  1. Büyüme ve hücre kültürlerinin bakımı
    Rutin ortodontik çekimi sırasında çekilen hastaların sağlıklı dişeti doku biyopsileri insan dişeti fibroblastlar izole.
    1. % 10 FBS varlığında DMEM GF'lerinin yetiştirmek, 5% I Penisilin / Streptomisin ve% 1 amfoterisin B hava içinde% 5 CO2 gibi nemli bir atmosfer altında bir inkübatörde 37 ° C'de hücreler koruyun.
    2. Değişen ortam 3 günde, ve geçit hücreleri her 5 gün. Tripsinizasyonla konfluense, hasat hücreleri ulaştıktan sonra.
    3. 5 dakika boyunca 90 x g'de santrifüjleyin hücreler, kültür ortamı içine yeniden askıya. Bir asa el otomatik hücre sayıcı ile hücre sayın.
    4. Bir bölme kaydırma sisteminde, 2.5 x 10 4 hücre / ml'lik bir hücre yoğunluğunda, tohum hücre süspansiyonu. % 5 atmosferinde, gece boyunca 37 ° C'de hücre inkübasyon izin verin.
  2. Kültür içindeki hücrelere bileşik ekstrelerinin ilavesi
    1. (Kuluçkadan 24 saat sonra), test edilen bileşik özlerinin 1 ml slaytı iki kuyu ortamı değiştirin.
    2. Aynı koşullar altında kalan iki kuyu (kontrol hücreleri) koruyun.
    3. Hava içinde% 5 CO2 'nin nemlendirilmiş bir atmosferi altında, bir inkübatörde 37 ° C'de dört kuyu içeren odanın slayt inkübe edin.
  3. Florasanla lekelenmesi
    Üreticinin talimatlarına uygun olarak ökaryotik hücreler için Canlı / Ölü sitotoksiklik leke kullanın.
    Not: kitin, plazma zan bütünlüğü ve esteraz etkinliği dayalı bir popülasyonda hücrelerin yaşama kabiliyetinin saptanması için hızlı bir iki-renkli floresan deneyi sağlar. Leke membranın hücre içi esteraz aktivitesi ve kırmızı-floresan Ethidium homodimeri-1 (EthD-1) belirtmek için kaybını göstermek için aynı anda yeşil floresan Kalsein-AM ile etiketleyerek hasarlı hücrelerin canlı ayırte bütünlüğü.
    1. Kalsein AM 2 uM ve 4 uM EthD-1 (fıbroblast boyanması için, uygun olduğu rapor nihai konsantrasyon) içeren iki leke reaktif bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Seçilen bileşik ekstratlarının varlığında ya da yokluğunda kültürlenmiş yapışık hücrelere leke ekleyin.
    2. Boyandıktan sonra ve zaman atlamalı görüntüleme yoluyla en az 15 dakika sonra, doğrudan ve hızlı bir şekilde boyanan hücre popülasyonları dikkate alınmalıdır. Değil santrifüj yapın ve lekeli hücrelerin fixe yok.

3. Konfokal Time Lapse Görüntüleme ve Sinyal Analizi

Kullanılan sistem, dört diyot lazer birimleri ve her bir numune için en fazla dört flüoresan boyalar için bir çok-lekeli bir görüntü ile donatılmıştır. Sistem bir faiz (600X büyütme) bir bölge gözlemlemek için taşıyabilirsiniz hangi test örneği bir bakış sağlayan bir haritalama görüntüsü (10X büyütme) gerçekleştirebilirsiniz.

  1. Zaman atlamalı görüntüleme
    1. S yerleştirinpecimens konfokal entegre kuluçka karanlık oda (bölme slayt lekeli örnekleri içeren) (37 C, CO 2 ve nemli bir atmosfer içinde% 5).
    2. İlgili lazerler seçin. Kalsein ve EthD-1 heyecanlandırmak için iki lazer kaynaklarla 473 nm (15 mW) ve 559 nm (18 mW) kullanın.
    3. Iki kullanılan floresan boya ile görüntülemede karışma olmadan hat dizileri yoluyla görüntü elde etmek için bir iki sıralı modunu kullanın.
    4. Otomatik tarama biriminde floresan boya ile uygun olarak, şartların oluşturulması için yeni geliştirilmiş bir spektruma sahip bir detektör kullanır.
    5. Maksimum her bir kanal için, tespit edilen floresan bant genişliği optimize. Tutanak tüm satın almalar sıralı potansiyel çapraz konuşmayı önlemek için.
    6. Tedarik yazılımı kullanılarak floresan boya seçimine dayalı en uygun görüntüleme koşullarını seçin.
    7. Otomatik olarak spiral bir desen merkezinde oluşturulan bir haritada bir görüntü elde edinilgi alanı ile kolayca yakından incelenmesi için seçilir.
    8. Seç gözlem modu. Time-lapse, Z-yığını, ve gerektiği gibi çoklu alanı dahil olmak üzere gözlem modları beş türlerine kadar seçin. Bu çalışmada Z-yığını ve time-lapse modları bir arada kullanın ve hızla görüntü yakalama tamamlamak,
    9. Değiştirin ve floresan boya geçmek. Alternatif olarak, floresan ve birbirleri ile hafif kontrast görüntüleri bindirmek. Sol alt harita ekranında seçilen noktasını kullanarak canlı görüntü gözlemleyebilirsiniz.
    10. Çerçeveleme kullanan ve fonksiyonlarını yakınlaştırma tarafından görüntüleme alanını belirler. İsteğe bağlı olarak, floresan boya her tür ekranlar arasında geçiş.
      NOT: Bu protokolde kullanılan mikroskop kompakt bir tasarımda yüksek bir geleneksel confocal aynı işlevselliğe sahiptir. Mikroskop optimal olarak basitleştirilmiş bir dahili inkübatör canlı hücrelerinin kararlı zaman atlamalı görüntüleme için uygun olan ters çevrilmiş su daldırma hedefleri ile donatılmıştır.
  2. Sinyal analizi ve ölçümü
    1. Floresan sinyalini ölçmek için görüntüleme yazılımı kullanın. Her iki test örneği ve hücre kontrolü için 10X amacı ile beş harita görüntüleri edinin.
    2. 0.231 mikron × 0,231 mikron piksel boyutu ile, 1024 × 1024 piksel düzenli görüntüleri elde edildi. Sinyal analizi için Olympus Image Format (OIF) olarak mağaza görüntüler. Bu biçim birlikte çeşitli parametre ayarlarını ve görüntüleri depolamak sağlar. Farklı analiz araçları (yoğunluk profilinin ölçümü, iki kullanılan kanallar arasında yoğunluk oranı) kullanın.
    3. 12 bit / piksel TIFF dosyaları olarak maksimum projeksiyon görüntüleri saklayın.
    4. R komutanı yazılımını kullanarak istatistiksel analizler preform. Bir tekrar testi yapılan varyans analizi (ANOVA) Tek yönlü analizi kullanılarak farklılıkları analiz edin. Raporu (± SD) olarak ortalama, standart sapma ve p <0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı olur.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 kontrol ve test kompozit ekstrelerin (ELS ekstra düşük büzülme) maruz kalan hücreleri için elde edilen haritalama görüntüleri (10X objektif) olarak Canlı / Ölü lekeli hücrelerin bir bakış gösterdi. Hücrelerin, üç boyutlu yapı, büyütme 600x de gözlemlenebildi. Kontrol odasındaki ve test edilen bileşik ekstrelerinin mevcudiyetinde oda içinde toplanan hücrelerin toplanması hücre Görselleştirme Şekil 2'de sunulmuştur. Maksimum çıkıntı (amacı, 60X) süreye başlangıcında için seçilen hücre popülasyonlarının kaderi göstermektedir (15 dakikada) ve bir zaman aralığı süresinin sonunda (5 saat sonra). Görüntülerin Elli yedi yığınlarının (xyzt mod tarama, yığınlarının başına 39 görüntüler, voxel derinlik 1.00 mikron) bu dönemde elde edilmiştir. Kırmızı floresan bir yeşil flüoresan sinyalinde hafif bir azalma ve çok küçük bir değişime maruz bırakılan hücrelerde elde edilmiştir. Önemli bir varyasyon kontrolü için gözlendihücreler. Kompozit özler maruz hücreler kontrol etmek için benzer mil morfoloji üstlendi; morfolojisi (yeşil sinyal azalması ve test edilen bileşiğin varlığında, kırmızı sinyal artmasına rağmen) bu deney koşullarında değişmemiştir. Görüntü analizi, yeşil ve kırmızı sinyal için negatif kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, test edilen bileşik için elde edilen görüntü ile ilgili farklı hücre birikmeye tekabül eden beş seçilen farklı görüntü yığınlarının üzerinde gerçekleştirildi. Lekeli hücrelerin yoğunluğu profili, Şekil 3'te gösterilmiştir; Test edilen bileşik ile temas halinde olan hücre, yeşil ve kırmızı sinyal gelişimi kontrol hücreleri ile karşılaştırılabilir olmuştur. Kalsein ve EthD-1 floresan emisyon yoğunlukları, kontrol hücreleri ve kompozit maruz kalan hücreler üzerinde ölçülmüştür. Ölçüm en fazla beş saat için, bir saatlik aralıklarla yapıldı. Yeşil 495-515 nm entegre edilmiş yoğunluklarının ve kırmızı 620-650 nm sinyallerine dayanan kırmızı / yeşil flüoresans oranı () Time-lapse dönemde hesaplanmıştır. ELS İlave düşük çekme ekstrelere yaşayabilirliği kontrol oranları ve maruz kalan hücreler, 1 mümkün T de gösterilmiştir. Test edilen bileşiğin varlığında, canlı hücre yüzdesi, 1 saat sonra% 93.9 kadar% 100 biraz azalttığı bulunmuştur iletişim. Önemli fark, belirtilen zaman atlamalı süresinin 5 saat sonra, test bileşimi ve (herhangi bir bileşik ekstreler olmayan hücre), negatif kontrol arasında gözlenmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: haritalama görüntünün Bakış zaman atlamalı dönemi (t = 15 dk) başında kompozit özleri (ELS ekstra düşük büzülme) varlığında objektif 10X, (A) kontrol hücreleri ve (B) hücreleri hücrelere lekeli gösterdi. Yeşil alanlar, canlı hücreler vardır ve kırmızı alanlar hasarlı hücrelerdir. Bu daDeney koşulları, (yeşil ve kırmızı floresans) hiç değişim, negatif kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında kompozit maruz bırakılan hücrelerde gözlenmiştir.

figure-results-2
Şekil 2 (A), kumanda odasının ve başlangıçta (B) birleşik ekstreler bölmesi ve maruz kalma süresi hızlandırılmış döneminin sonunda bir hücre popülasyonunun amacı 60X en CLSM resim (I: 15 dakika ve II, sırasıyla: 5 saat, ). Yeşil alanlar, canlı hücreler vardır ve kırmızı alanlar hasarlı hücrelerdir. Görüntülerin paneli yoğunluğu sinyalde hafif bir değişiklik (yeşil sinyalde hafif bir azalma ve kırmızı birinde çok hafif bir artış) göstermiştir. Hiçbir hücre morfolojisi değişiklikleri kompozit ekstratlarının varlığında gözlendi; kontrol hücreleri olarak mil şekilli ve fibroblastik morfolojisi muhafaza hücreler maruz kalmaktadır.


Şekil 3: zaman atlamalı mikroskopi gözlenen hücre hattı profili, 15 dakika ve 5 saat sonra (II), (A) Kontrol hücreleri (B) Bileşik özütler maruz kalan hücreleri (I) '.. Ne olursa olsun test edilen bileşiğin varlığında, yeşil sinyal evriminde Görünür bir değişiklik zamanlı iletişim. Ancak, kırmızı sinyal hafif bir artış temas 5 saat sonra bileşik varlığında gözlenmiştir.

İletişim süresi (saat) Hücre canlılığı, (%)
1 2 3 4 5
Kontrol hücreleri 100 100 100 100 100
ELS ekstra düşük büzülme ® 93.9 ± 7 91.3 ± 5 * 89.5 ± 3 * 87.6 ± 2 * 87.7 ± 3 *

Tablo 1:. Kompozit ekstraktlar Hücre canlılığı temas 1, 2, 3, 4 ve 5 saat sonra canlı, HGF hücreler evrim Oranı / Canlı Ölü sitotoksisite kiti kullanılarak lekeleme ile analiz edilmiştir. Beş görüntülerin SD analizini yığınlarının ± Veriler ortalama değerleri göstermektedir. Değerler p <0.05 kontrol hücrelerinden önemli ölçüde farklıdır.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyouyumluluk malzeme davranışı tıbbi kullanımdan önce değerlendirilecek en önkoşul parametredir. Uluslararası standartlar tıbbi cihazlar ISO 10993 33 ve özellikle diş malzemeleri ISO 7405 34 kapsayacak. Çevreleyen hücrelere toksik etkilerin olmaması gibi malzemelerin biyouyumluluk değerlendirilmesinde anahtar norm. 37 - sitotoksisite testi diş malzeme biyouyumluluk 35 değerlendirilmesinde böyle bir öneme sahip nedeni budur. ISO test yöntemleri metabolik aktivite veya membran bütünlüğü temelinde olabilir önerdi. Seçilen uç noktalar zaman ve değerlendirme testlerinin maliyetini en aza indirmek için bir test malzeme ile uyarılan olumsuz etkilere sıralaması için belirli koşulları takip edilmelidir. Soruşturmanın akım yöntemi (3D konfokal time lapse görüntüleme) esaslı membran bütünlüğü olduğunu. Bu uç aracılığı ile sitotoksisite değerlendirilmesi hücre, biyolojik uyumluluğu değerli bir belirteç olarak görülmektedirTest edilen malzeme ve bunun ile sürülenlerden aynı zamanda ISO son nokta onaylanmıştır. İn vitro testler, bir malzeme örneği, özel bir hücre tipi nasıl etki ettiğinin saptanması için tasarlanmıştır. Kolorimetrik MTT deneyi ilk olarak in vitro ve hücre proliferasyonunun ölçülmesi için yararlı bir yöntem olarak (1983) Mossman tarafından tarif edilmiştir. MTT testi mitokondriyal aktivite belirlenerek aktif hücrelerin formazan kristalleri içine tetrazolyum tuzunun dönüştürülmesi, dayanmaktadır. Bu canlılığı oranı 38 ile tercüme edilebilir. Gupta ve işbirlikçileri MTT testi kompozit reçine sitotoksikligini ölçmek için en yaygın kullanılan yöntem olduğunu bildirdi. Süksinik dehidrojenaz ve alkalin fosfataz tepkileri ayrıca aynı amaç 39 kullanılmıştır. MTT deneyi her ölçüm zamanında hücreleri öldürerek gerektirmektedir Bununla birlikte, kaderin hücre, takip edilemez. Mevcut çalışmada daha yakından boyanmış hücrelerin davranışını izlemek için, DiCanlı hücrelerin rect gözlem, kısa protokol boyama, otomatik görüntü analizi ve floresan sinyal ölçümü ile kombine time lapse CLSM görüntüleme sayesinde gerçekleştirildi.

Diş kompozitler oral dokular, özellikle dişeti ve pulpa hücreleri ile yakın temas. 41 - Fibroblast'lar Bu restoratif kompozit 40 serbest bileşenlerin hedef olacaktır. Ayrıca birkaç çalışma, ölümsüzleştirilmiş hücreler ve birincil hücreler biyomalzeme ile temas içinde değişik hücresel tepkiler sahip olduğu belirtilmektedir. Birincil hücreler biyomaddeleri etkileri 42 değerlendirmek için daha uygun olduğu saptanmıştır. Bu, bu çalışmada test edilen diş kompozitin sitotoksisite değerlendirmesi için hücre modeli olarak primer insan diş eti fibroblast hücrelerinin kullanımını açıklar. 44 - Diş kompozit salınan maddelerin toksisitesi potansiyel geniş 43 incelenmiştir. T değerlendirmek içinUygun malzeme potansiyelini sitotoksik, iki temas modeli hücre gerçekleştirilebilir. Dolaylı temas sistemindeki hücreler, biyolojik ortamda elute olur temas eden hedef ise doğrudan temas modeli sisteminde malzeme doğrudan hedef hücreler ile yerleştirilir. Klinik uygulamada ve restoratif prosedürler için, diş kompozit diş eti dokuları ile dolaylı olarak temas edecek şekilde yerleştirilir. Bu nedenle, mevcut deneysel protokol (test kompozit özleri varlığında hücreler) GF'lerinin ile dolaylı temas sistemi üzerinde duruldu. Daha önce Dahl ve işbirlikçileri tarafından bildirildiği gibi, sitotoksisite yanıtları için faaliyet göreceli dayalı <(% 90), (30% orta (% 30-60), hafif (% 60-90) veya non-sitotoksik)> ciddi olarak sıralanır edildi değerleri kontrol 45 elde edildi. Bu nedenle, elde edilen sonuçların ışığında (Tablo 1) Bu sıralama ve uygun, kompozit ELS ekstra düşük büzülme ver olarak sıralanır olabiliry hafifçe sitotoksik ve tüm zaman atlamalı dönemde hücreleri kontrol karşılaştırılabilir davranış gösterdi. Tam aynı araştırma yöntemi kullanarak, bu çalışmanın sonuçları yakın zamanda yayımlanan bir çalışmada kıyasla olabilir. ELS ekstra düşük büzülme kompozit doğrudan restorasyon 11, aynı klinik uygulama için kullanılan iki önce test kompozitlerle karşılaştırıldığında üstün bir biyouyumluluk göstermiştir. Daha ileri çalışmalar daha da tam bir karşılaştırma oluşturmak için gereklidir.

Belirli bir son nokta değerlendirme için onaylamak için hangi sitotoksisite deneyi karar verirken, bu avantaj ve her testin sınırlarını anlamak önemlidir. Konfokal görüntüleme temel amacı, hücre ya da organların bir 3-D Mimari elde etmektir. Teknik Numunenin yüzeyine değil, aynı zamanda onun yeraltını sadece ortaya yapabiliyor. Burada açıklanan protokol, bir sensi olarak, 3D CLSM time lapse konfokal görüntüleme kullanımını altını çizentif yöntem, bir diş bileşik in vitro olarak biyolojik uyum davranışını değerlendirmek. Bununla birlikte, bu çalışmada karşılaşılan sınırlamalar önlemek amacıyla, titreşim önleyici iş istasyonları daha istikrarlı ve daha uzun bir zaman aralığı görüntülenmesine olanak sağlamak için kullanılabilir; masa laboratuvarda titreşimler neden olabilir zararlı etkilerinden kullanılan confocal sistemini izole olabilir. Ayrıca, malzeme ideal olarak diş eti dokulara zararsız olmalıdır, ağız boşluğunda kullanılmak üzere, sistemik toksisiteye neden olabilir hiçbir madde içermelidir. Kullanılan metodolojiye göre ve mevcut çalışmadan elde edilen sonuçlarda bu test kompozit (ELS ekstra düşük büzülme) Bu deneysel koşullarda sitotoksik olmadığı sonucuna varılabilir. CLSM yöntem, hassas bir canlı hücrelerinin ilk oran vermek üzere, diğer olasılıklar daha fazla bitiş noktası değerlendirmek için öngörülebilir. Özellikle, son zamanlarda rapor edilmiştir kompozit monomerleri thr hücrelerini etkileyenough reaktif oksijen türleri (ROS) 46- 48, daha fazla araştırma sitotoksisite arasında herhangi ağları ve ROS üretimini sinyalizasyon eğer ilişkiyi değerlendirmek için gereklidir. Gelecekteki protokolü aynı anda ROS üretimini değerlendirmek için (H 2 O 2 ve / veya O 2 - boyama) dizayn edilebilir ve zaman atlamalı CLSM görüntüleme kullanılarak sitotoksisite oranı (Canlı / ölü boyama).

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını, açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saremco Dental Switzerland ve Olympus Microsystems France Şirketleri, finansal destekleri için minnettarlıkla teşekkür ederiz. Saremco Dental, dental kompozitler ELS ekstra düşük büzülme ile ilgili cömert bağışları için de takdir edilmektedir. Yazarlar ayrıca, Kimya Bölümü'nden (University College London) Dr. Simon Banks'e İngilizce revizyon konusundaki yardımları için takdirlerini ifade etmek isterler.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Olympus Fluoview FV10i OlympusKonfokal mikroskop
O2< / sub> / CO2< / sub> İnkübatörPnasonicMCO 5MHücre inkübasyonu
Canlı / Ölü KitInvitrojen ve nbsp;MP 03224Boya 
ELS ekstra düşük büzülme  Saremco Dental kompozit
DMEM ortamıSigmaD 6046Kültür ortamı
TripsinSigmaT1426toplama hücreleri
odası slayt sistemi ve nbsp;  PAA14220040XKültür odası
penisilin / streptomisin ve nbsp;PAAP11-010Hücre kültürü
Amfoterisin BPAAP11-001Hücre kültürü
Fetal sığır serumu PAAA11-101Hücre kültürü
Hücre SayacıMerck Millipore00110230TP1Hücre sayımı 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Van Landuyt, K. L., et al. How much do resin-based dental materials release? A meta-analytical approach. Dent. Mater. 27 (8), 723-747 (2011).
  2. Moharamzadeh, K., Van Noort, R., Brook, I. M., Scutt, A. M. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent. Mater. 23 (1), 40-44 (2007).
  3. Santerre, J. P., Shajii, L., Leung, B. W. Relation of dental composite formulations to their degradation and the release of hydrolyzed polymeric-resin-derived products. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 12 (2), 136-151 (2001).
  4. Geurtsen, W. Biocompatibility of resin-modified filling materials. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 11 (3), 333-355 (2000).
  5. Hensten-Pettersen, A. Skin and mucosal reactions associated with dental materials. Eur. J. Oral Sci. 106 (2), 707-712 (1998).
  6. Paranjpe, A., Sung, E. C., Cacalano, N. A., Hume, W. R., Jewett, A. N-acetyl cysteine protects pulp cells from resin toxins in vivo. J. Dent. Res. 87 (6), 537-541 (2008).
  7. Falconi, M., Teti, G., Zago, M., Pelotti, S., Breschi, L., Mazzotti, G. Effects of HEMA on type I collagen protein in human gingival fibroblasts. Cell. Biol. Toxicol. 23 (5), 313-322 (2007).
  8. Jontell, M., Hanks, C. T., Bratel, J., Bergenholtz, G. Effects of unpolymerized resin components on the function of accessory cells derived from the rat incisor. 74 (5), 1162-1167 (1995).
  9. Urcan, E., Scherthan, H., Styllou, M., Haertel, U., Hickel, R., Reichl, F. -X. Induction of DNA double-strand breaks in primary gingival fibroblasts by exposure to dental resin composites. Biomaterials. 31 (8), 2010-2014 (2010).
  10. Sigusch, B. W., et al. Resin-composite cytotoxicity varies with shade and irradiance. 28 (3), 312-319 (2012).
  11. Attik, G. N., Pradelle-Plasse, N., Campos, D., Colon, P., Grosgogeat, B. Toxicity Evaluation of Two Dental Composites: Three-Dimensional Confocal Laser Scanning Microscopy Time-Lapse Imaging of Cell Behavior. Microsc. Microanal. 19, 596-607 (2013).
  12. Ausiello, P., et al. Cytotoxicity of dental resin composites: an in vitro evaluation. J. Appl. Toxicol. 33 (6), 451-457 (2011).
  13. Durner, D., Obermaier, J., Draenert, M., Ilie, N. Correlation of the degree of conversion with the amount of elutable substances in nano-hybrid dental composites. Dent. Mat. 28 (11), 1146-1153 (2013).
  14. Sigusch, B. W., Völpel, A., Braun, I., Uhl, A., Jandt, K. D. Influence of different light curing units on the cytotoxicity of various dental composites. Dent. Mater. 23 (11), 1342-1348 (2007).
  15. Knezevic, A., Zeljezic, D., Kopjar, N., Tarle, Z. Influence of curing mode intensities on cell culture cytotoxicity/genotoxicity. Am. J. Dent. 22 (1), 43-48 (2009).
  16. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. -A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  17. Harorli, O. -T., Bayindir, Y. -Z., Altunkaynak, Z., Tatar, A. Cytotoxic effects of TEGDMA on THP-1 cells in vitro. Med. Oral Patol. Oral Cir. Bucal. 14 (9), 489-493 (2009).
  18. Reichl, F. X., et al. Cytotoxicity of dental composite (co)monomers and the amalgam component Hg(2+) in human gingival fibroblasts. Arch. Toxicol. 80 (8), 465-472 (2006).
  19. Aranha, A. M. F., Giro, E. M. A., Hebling, J., Lessa, F. C. R., Costa, C. A. deS. Effects of light-curing time on the cytotoxicity of a restorative composite resin on odontoblast-like cells. J. Appl. Oral Sci. 18 (5), 461-466 (2010).
  20. Schulz, S. D., König, A., Steinberg, T., Tomakidi, P., Hellwig, E., Polydorou, O. Human gingival keratinocyte response to substances eluted from Silorane composite material reveal impact on cell behavior reflected by RNA levels and induction of apoptosis. Dent. Mater. 28 (8), 135-142 (2012).
  21. Tadin, A., Marovic, D., Galic, N., Kovacic, I., Zeljezic, D. Composite-induced toxicity in human gingival and pulp fibroblast cells. Acta Odontol. Scand. 72 (4), 304-311 (2014).
  22. Schweikl, H., Schmalz, G. Toxicity parameters for cytotoxicity testing of dental materials in two different mammalian cell lines. Eur. J. Oral Sci. 104 (3), 292-299 (1996).
  23. Issa, Y., Watts, D. C., Brunton, P. A., Waters, C. M., Duxbury, A. J. Resin composite monomers alter MTT and LDH activity of human gingival fibroblasts in. 20 (1), 12-20 (2004).
  24. Brambilla, E., Gagliani, M., Ionescu, A., Fadini, L., García-Godoy, F. The influence of light-curing time on the bacterial colonization of resin composite surfaces. 25, 1067-1072 (2009).
  25. Modareszadeh, M. R., et al. Cytotoxicity of set polymer nanocomposite resin root-end filling materials. Int. Endod. J. 44, 154-161 (2011).
  26. Tamilselvam, S., Divyanand, M. J., Neelakantan, P. Biocompatibility of a conventional glass ionomer, ceramic reinforced glass ionomer, giomer and resin composite to fibroblasts: in vitro study. J. Clin Pediatr. Dent. 37 (4), 403-406 (2013).
  27. White, J. G., Amos, W. B., Fordham, M. An evaluation of confocal versus conventional imaging of biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol. 105 (1), 41-48 (1987).
  28. Alpino, P. H. P., Pereira, J. C., Svizero, N. R., Rueggeberg, F. A., Pashley, D. H. Use of fluorescent compounds in assessing bonded resin-based restorations: a literature review. J. Dent. 34 (9), 623-634 (2006).
  29. Chen, Y., Liang, C. -P., Liu, Y., Fischer, A. H., Parwani, A. V., Pantanowitz, L. Review of advanced imaging techniques. J. Pathol. Inform. 3, 22(2012).
  30. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques—FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  31. Stoddart, M. J., Furlong, P. I., Simpson, A., Davies, C. M., Richards, R. G. A comparison of non-radioactive methods for assessing viability in ex vivo cultured cancellous bone: technical note. Eur. Cell Mater. 12, 16-25 (2006).
  32. Louvet, J. N., Attik, G., Dumas, D., Potier, O., Pons, M. N. Simultaneous Gram and viability staining on activated sludge exposed to erythromycin: 3D CLSM time-lapse imaging of bacterial disintegration. Int. J. Hyg. Environ. Health. 214 (6), 470-477 (2011).
  33. Dentistry - Preclinical evaluation of biocompatibility of medical devices used in dentistry - Test methods for dental materials. International Standards Organization. , (2009).
  34. Biological evaluation of dental devices. International Standards Organization. , (2009).
  35. Elshahawy, W. M., Watanabe, I., Kramer, P. In vitro cytotoxicity evaluation of elemental ions released from different prosthodontic material. Dent. Mater. 25 (12), 1551-1556 (2009).
  36. Williams, D. F. On the mechanisms of biocompatibility. Biomaterials. 29 (20), 2941-2953 (2008).
  37. Illeperuma, R. P., et al. Immortalized gingival fibroblasts as a cytotoxicity test model for dental materials. J. Mater. Sci. Mater. Med. 23 (3), 753-762 (2012).
  38. Wataha, J. C., Lockwood, P. E., Bouillaguet, S., Noda, M. In vitro biological response to core and flowable dental restorative materials. Dent. Mater. 19 (1), 25-31 (2003).
  39. Ergun, G., Egilmez, F., Yilmaz, S. Effect of reduced exposure times on the cytotoxicity of resin luting cements cured by high-power led. J. Appl. Oral Sci. 19 (3), 286-292 (2011).
  40. Yap, A. U., Han, V. T., Soh, M. S., Siow, K. S. Elution of leachable components from composites after LED and halogen light irradiation. Operative Dentistry. 29 (4), 448-453 (2004).
  41. Lee, S. Y., Greener, E. H., Menis, D. L. Detection of leached moieties from dental composites in fluids stimulating food and. 11 (6), 348-353 (1995).
  42. Anselme, K., Davidson, P., Popa, A. M., Giazzon, M., Liley, M., Ploux, L. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomateriala Journa. 6 (10), 3824-3846 (2010).
  43. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  44. Gupta, S. K., Saxena, P., Pant, V. A., Pant, A. B. Release and toxicity of dental resin composite. Toxicol. Int. 19 (3), 225-234 (2012).
  45. Dahl, J. E., Frangou-Polyzois, M. J., Polyzois, G. L. In vitro biocompatibility of denture relining materials. Gerodontology. 23 (1), 17-22 (2006).
  46. Krifka, S., Seidenader, C., Hiller, K. A., Schmalz, G., Schweikl, H. Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells. Clin. Oral Investig. 16 (1), 215-224 (2012).
  47. Krifka, S., Spagnuolo, G., Schmalz, G., Schweikl, H. A review of adaptive mechanisms in cell responses towards oxidative stress caused by dental resin monomers. Biomaterials. 34 (19), 4555-4563 (2013).
  48. Chang, M. C., et al. The role of reactive oxygen species and hemeoxygenase-1 expression in the cytotoxicity, cell cycle alteration and apoptosis of dental pulp cells induced by BisGMA. Biomaterials. 31, 8164-8171 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Confocal Time Lapse ImagingDental Composite BiocompatibilityHuman Gingival FibroblastsLive Dead Staining3D CLSM ImagingCytotoxicity AssessmentFluorescent Signal AnalysisCell Viability MeasurementComposite Extract PreparationMaximal Projection Images

Related Articles