Method Article

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü, Aedes albopictus

DOI:

10.3791/51961

⸱

November 30th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Insect Physiology Lab, EEOB, The Ohio State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA-Seq analizleri, model olmayan organizmalarda adaptif özelliklerin moleküler temellerini belirlemek için giderek daha önemli hale geliyor. Burada, diyapoz ve diyapoz olmayan Aedes albopictus sivrisinekleri arasında diferansiyel olarak ifade edilen genleri tanımlamak için bir protokol, sivrisinek yetiştiriciliğinden RNA dizilimine ve RNA-Seq verilerinin biyoinformatik analizlerine kadar açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fotoperiyodik diyapoz, bireylerin zorlu mevsimsel ortamlardan, özellikle gelişimsel durma ve azalmış metabolizma gibi bir dizi fizyolojik değişiklikle kaçmalarına izin veren önemli bir adaptasyondur. RNA-Seq aracılığıyla küresel gen ekspresyonu profili, fotoperiyodik diyapozun transkripsiyonel mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Asya kaplan sivrisineği, Aedes albopictus, yetiştirme kolaylığı, kolayca indüklenen diyapoz ve mevcut genomik kaynaklar nedeniyle diyapozun transkripsiyonel temellerini incelemek için olağanüstü bir organizmadır. Bu makale, A. albopictus'ta diyapoza bağlı transkripsiyonel farklılıkları tanımlamak için genel bir deneysel iş akışı sunmaktadır. Yetiştirme teknikleri, diyapoz ve diyapoz olmayan gelişimi indüklemek için gerekli koşullar, bir popülasyondaki diyapoz yüzdesini tahmin etme yöntemleri ve sivrisinekler için RNA ekstraksiyonu ve bütünlük değerlendirmesi belgelenmiştir. Illumina dizileyicilerden gelen RNA-Seq verilerini işlemek için bir iş akışı, diferansiyel olarak ifade edilen genlerin bir listesiyle sonuçlanır. Temsili sonuçlar, bu protokolün, fotoperiyodik farklılıklar nedeniyle A. albopictus'ta transkripsiyonel düzeyde diferansiyel olarak düzenlenen genleri etkili bir şekilde tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Mütevazı ayarlamalarla, bu iş akışı, diğer sivrisineklerdeki diyapozun transkripsiyonel temellerini veya diğer önemli yaşam öyküsü özelliklerini incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni nesil dizileme (NGS) teknolojilerindeki hızlı gelişmeler, model olmayan organizmaların 1-3 geniş bir çeşitliliğinde çok çeşitli genetik olarak karmaşık ekolojik adaptasyonların moleküler temellerini araştırmak için heyecan verici fırsatlar sunmaktadır. Bu yaklaşım son derece güçlüdür, çünkü özellikle ilginç ve/veya iyi tanımlanmış bir ekolojiye veya evrimsel geçmişe sahip organizmaların yanı sıra tarımsal zararlılar ve hastalık vektörleri gibi pratik kaygı taşıyan organizmaların popülasyon ve fonksiyonel genomik çalışmaları için bir temel oluşturur. Bu nedenle, NGS teknolojileri ekoloji alanlarında hızlı ilerlemelere yol açmakta ve hızlı çağdaş iklim değişikliğineverilen biyolojik tepkilerin mekanik temellerini anlama4, istilacı türlerin yayılması 5 ve konakçı-patojen etkileşimleri6,7 gibi sorunları ele alma potansiyeline sahiptir.

NGS teknolojilerinin ekoloji ve evrimsel biyolojideki temel ve uygulamalı soruları ele almak için olağanüstü potansiyeli, kısmen, bu yaklaşımların çoğu araştırma laboratuvarı için mümkün olan makul bir maliyetle herhangi bir organizmaya uygulanabilmesi gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Ayrıca, bu yaklaşımlar, bir mikrodizi çipi veya tam genom dizisi gibi a priori genetik kaynaklara ihtiyaç duymadan genom çapında bilgi sağlar. Bununla birlikte, NGS deneylerinin verimliliğini en üst düzeye çıkarmak için, RNA örneklemesinin gelişimsel zamanlaması ve dokuya özgülüğü gibi konular da dahil olmak üzere deneysel tasarımın dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Ayrıca, bu deneyler tarafından üretilen büyük miktarda veriyi, genellikle birkaç yüz milyon DNA dizisi okumasını analiz etmek için gereken teknik beceriler, özel bir zorluk olmuştur ve NGS yaklaşımlarının yaygın olarak uygulanmasını sınırlamıştır.

İstilacı ve tıbbi açıdan önemli sivrisinek Aedes albopictus'taki diyapozun transkripsiyonel temelleri üzerine yapılan son RNA-Seq çalışmaları, model olmayan bir organizmada karmaşık bir ekolojik adaptasyonun moleküler temelini incelemek için NGS teknolojisini başarılı bir şekilde uygulamak için kullanılabilecek bazı deneysel protokollerin yararlı bir örneğini sunmaktadır 8-10. A. albopictus, Asya'ya özgü ancak son zamanlarda Kuzey Amerika, Güney Amerika, Avrupa ve Afrika'yı istila eden oldukça istilacı bir türdür11,12. Birçok ılıman böcek gibi, A. albopictus'un ılıman popülasyonları, fotoperiyodik diyapoz olarak adlandırılan bir tür uyku haline girerek kış boyunca hayatta kalır. A. albopictus'ta, pupa ve yetişkin dişilerin kısa (sonbahar) gün uzunluklarına maruz kalması, embriyolojik gelişimin tamamlandığı diyapoz yumurtalarının üretimine yol açar, ancak yumurtanın koryonu içindeki pharate larvası, yumurtayı kuluçka uyaranına dirençli hale getiren gelişimsel bir durmaya girer15-17. Diyapozlu yumurtalar, diyapozsuz yumurtalara göre kurumaya karşı daha dirençlidir5,18 ve daha fazla toplam lipid19 içerir. A. albopictus'taki fotoperiyodik diyapoz, bu nedenle, ılıman ortamlarda kışın zorlu koşullarında hayatta kalmak için gerekli olan, maternal olarak kontrol edilen, uyarlanabilir bir fenotipik plastisitedir. Çok çeşitli böceklerde fotoperiyodik diyapozun iyi anlaşılmış ekolojik öneminerağmen 20,21, bu önemli adaptasyonun moleküler temeli hiçbir böcekte iyi karakterize edilmemiştir22. Fazat larva aşamasında embriyonik diyapoza uğrayan A. albopictus gibi organizmalarda, anne tarafından alınan fotoperiyodik sinyalin yavrulara nasıl geçtiğini ve embriyonik gelişim boyunca nasıl devam ettiğini anlamak özellikle zorlayıcı bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Bu protokol, A. albopictus'ta fotoperiyodik diyapozun transkripsiyonel bileşenlerini aydınlatmak için gerçekleştirilen NGS deneyleri (transkriptom dizileme) için sivrisinek yetiştirme, deneysel tasarım ve biyoinformatik analizleri açıklar. Bu protokol, A. albopictus'ta diyapoz ile ilgili ek çalışmalar için kullanılabilir, yumurta diyapozu23 geçiren diğer aedine sivrisinekleri gibi diğer yakından ilişkili türlerde diyapozu araştırmak için uyarlanabilir ve ayrıca daha genel olarak, herhangi bir böcekteki herhangi bir karmaşık adaptasyonun transkripsiyonel temellerini incelemek için NGS yaklaşımlarını kullanmakla ilgilidir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki A. 1. Larva Yetiştirme albopictus Grupları Erişkinliğe

  1. İki optimum diapause ifadesi 16 21 ° C'de programlanabilir aydınlatma ile fotoperiyot dolapları ve yaklaşık% 80 bağıl nem ayarlayın.
    1. Bir 16L Program bir kabine: 8K ışık: karanlık döngüsü (non-diapause LD fotoperiod uyaran). Bir 8L ikinci kabine ayarlayın: 16D ışığı: karanlık döngüsü (uyarıcı diapause) 13.
    2. Her iki dolapları aynı zamanda Programın 'ışıklar' fotoperiyodların arasındaki sirkadiyen zaman senkronize etmek.
  2. Deney gerçekleştirmek için gerekli yumurta miktarını hesaplayın. Kafes başına 300-500 yumurta hedefleyin. En azından üç diapause kafesleri çoğaltmak ve olmayan üç-diapause kafesler RNA üretimi için gerekli olan çoğaltmak. Bu deney başına 1,800-3,000 yumurta Takriben için toplamları.
    1. Yaklaşık içine deiyonize H 2 O 500 ml yumurta kağıtları daldırarak tarafından Hatch yumurta
    2. Ekle ca. Zemin köpek maması ve tuzlu su karidesi oluşan 1 ml gıda bulamaç olarak daha önce 24 nitelendirdi. Kafes ile konteyner örtün ve bir lastik bant ile yerine örgü tutmak.
    3. Yaklaşık 24 saat LD fotoperiyodun kabine yerleştirin.
  3. Aktarım yumurtadan larva için 10 x 10 x 2 cm'lik Petri yaklaşık 90 ml ile doldurulmuş kaplar deiyonize H2O
    1. Tabak başına yaklaşık 30 larva koruyun. Örneğin, her Pazartesi, Çarşamba, Cuma ve (MWF) 24 yemeklere her 48-72 saat temizlemek için larva aktarın.
    2. Daha önce olduğu gibi, iyonu giderilmiş su içinde ezilmesi köpek maması ve tuzlu su karidesi her MWF oluşan besleme yaklaşık 1 mi gıda bulamaç 24 tanımladı.
  4. Her kafes biyolojik çoğaltmak içermektedir her fotoperiyod tedavisi için 3-4 yetişkin kafesleri ayarlayın.
    1. 9.5 L kovalar ters taraftan, bir 10-by-14 cm delik kesip, ve 15 cm çapında bir delik. Comesh ile ilk Sür. Ortopedik çorap yaklaşık bir ayak uzunluğu kesin, ve diğer deliğin içine etrafında bir ucunu tutkal.
    2. Çorap kapalı ve düğüm kapatma ayak ucunu kesin - kafesin iç erişim gerektiğinde yalnızca açık. Kafes kapak için, sadece jant bırakarak, tüm iç kesip, ve örgü 24 ile iç plastik değiştirin.
    3. Kafesin tarafında kalıcı bir kalem ile deney ile ilgili numarayı, kafes başlangıç ​​tarihini ve diğer bilgileri çoğaltmak, fotoperiod unutmayın.
  5. Islak filtre kağıdı ile yetişkin kafesleri alt Hat. Filtre kağıdı 24 ovipozisyon teşvik, hangi kafeste yerel nem oranı yükselir, ancak suya durmaktan kaçınmak için yeterli deiyonize H 2 O ile filtre kağıdı nemlendirin. Gerektiğinde kurutulması için günlük olarak tekrar nemli filtre kağıdı edin.
  6. En az 100 kadın dahil, bir RNA kütüphanesi için yeterli yumurta üretmek için / 9.5 L cage, kafes başına en fazla 500 sivrisinek ile.
  7. En fazla 50 pupa başına 25 mi H2O yoğunluğunda, temiz H2O küçük bir kap içinde pupa MWF yeri ve toplamak Bir yetişkin kafesine pupa fincan aktarın. İlgili fotoperiyodun kabine yerleştirin kafesleri - A. albopictus pupa 15 fotosensitiftir.
  8. Ölü pupa oluşumu kitle mortaliteye neden olabilir, çünkü, bardak H 2 O temiz ve berrak olduğunu günlük olun ve ölü pupa çıkarın. Tüm pupa ortaya Ey bardak sonra H 2 çıkarın.
  9. Ortaya yetişkinler için şeker sağlamak için kafesin üst örgü organik üzüm yerleştirin. Üzüm Monitör ve küf birikmesini önlemek için her 3-5 gün onları değiştirmek.

Yetişkin 2. Bakım Çiftleşme ve Yumurta Üretim izin ver

  1. (SECTI nemli bir filtre kağıdı ile kafes alt astar yüksek nemde (yakl.% 80) en kafesleri bakımı, ve yukarıda tarif edildiği gibi, küflü üzüm erişim sağlamakons 1.5 ve 1.9).

3. Kan-besleme

  1. Yumurtlama yaklaşık 100% diapause yumurta 14 başlamadan önce kadın en az sekiz net kısa gün maruz emin olmak için eclosion sonra 2-6 gün arasında kan besleme kadınlarda hazırlanın.
  2. Hemotek Membran Besleme sistemi hazırlayın. Güç kaynağı besleyen birimleri takın. Ayar vidası kullanarak 37 ° C her biriminin sıcaklığını ayarlayın. Kalibrasyon sırasında besleme ünitesinin sıcaklığını ölçmek için bir elektronik termometre ve probu kullanın.
  3. Yemek haznesini hazırlayın. Yemek rezervuar diyafram üzerinde kollajen besleme membranın bir kare gerin ve bir O-ring ile sabitleyin. Dikkatle kırışıklıkları kaldırmak için köşeleri çekin; makas ile aşırı membran düzeltin.
    NOT: Kollajen membran tüm sivrisinek türleri için de işe yaramayabilir ve bir çalışma varsa optimum membran bulmak için çeşitli denemek için gerekli olabilirA dışında başka türler albopictus. Parafilm pipiens'in ile iyi çalışır.
    1. Kan kullanmadan önce en az 1 saat süre ile, oda sıcaklığında, dondurulmuş çözülme saklanır.
    2. Membran aşağıya bakacak şekilde tutun rezervuar, desteksiz ve dolum portları yukarı bakacak. Bir anti-pıhtılaştırıcı olarak sodyum sitrat olan tavuk tam kan, yaklaşık 3 ml ile doldurulması için bir transfer pipeti veya şırınga kullanın. Plastik fişler ile dolum noktalarını Seal.
  4. Besleyici altındaki ısı transfer plaka üzerinde damızlık üzerine vidalanarak besleyici hazırlanan rezervuar takın. Sivrisinekler kafesin örgü ile besler, böylece besleyici ters çevirin ve kafesin üst, aşağı membran tarafına yerleştirin. Besleme en üst düzeye çıkarmak için yaklaşık 45 dakika boyunca kafes üzerine besleyici tutun.

4. yumurtlama teşvik

  1. Dört beş gün renkli bir karanlık her kafes donatmak, kan yemek sonrası 50 ml cağartılmamış tohum çimlenme kağıdı (yumurta kağıt) veya dokulu olmayan ağartılmış kağıt havlu ile kaplı ve deiyonize su ile 9 yarıya doldurun kadar. 250'den fazla sivrisinek bir kafes içinde iseniz, iki bardak kullanın.
    NOT: Küçük kafeslerde veya tek dişi şişeleri için, yumurtlama kaplarda "hay infüzyon" nedeniyle mikrobiyal floranın 25 koku ovipozisyon artabilir.

5. toplayın ve Mağaza Yumurta

  1. Yumurta üretimi genellikle önümüzdeki hafta boyunca azalır, sonra beş gün kan beslenme sonra yaklaşık zirveleri, çünkü kan besleme 4-5 gün içinde yumurta toplama başlar.
  2. Deneyin ihtiyaçları yumurta toplama sıklığını Vary. Genel amaçlar için, bir MWF programa yumurta kağıtları toplamak. Her kafes yumurta kağıtları çıkarın ve taze kağıt ile değiştirin. Yumurta depolama karıştırıcı etkilerini önlemek için SD fotoperiyodun kabinesinde Petri kapları ve mağaza son zamanlarda kaldırıldı kağıtları yerleştirin.
  3. Yumurta kağıtları yeniden izin Yumurta kuruma direncini artırır 26 serozal manikür oluşumuna, izin sonrası yumurtlama 2 gün boyunca ıslak ana.
  4. Yaklaşık 48 saat sonra toplama, açık havada kuru yumurta. Kağıt H 2 O koyu veya yumurta yumurtadan uyaran o kadar ıslak gevşek ve hafifçe nemli, ama öyle ki kağıt kurutun.
    NOT: Bir 6,5 "x 4" Kağıt kuruması yaklaşık 3.5 saat sürebilir. Bu yumurta kuruma 27 neden olacak gibi değil, aşırı kuru yumurta kağıtları dikkatli olun.
  5. LD ve SD hem fotoperiyodların rezerv ek yumurta diapause insidansını değerlendirmek ve (Diapause Ölçme Bölüm 6) photoperiodic etkisini yorumlamak.
  6. Uzun süreli depolama için, 21 ° C'de yumurta kağıtları tutmak ve Petri kutularına yaklaşık% 80 nem. Embriyo gelişimi, 21 ° C'de 4-5 gün sürer, yerel nem korumak için bir su şişesi ile bir Saklama kabı depolama kabı içinde Petri kapları tutun.
ove_title "> 6. Diapause İnsidans Tedbir

  1. Ek saklıdır embriyolar diapause yanıtı ölçmek için 7-20 gün eski (yumurtlama, Bölüm 4 Canlandıracak bakınız) kullanın.
  2. Her yumurta kağıt üzerinde bulunan yumurta sayısını kaydedin.
  3. Tamamen yaklaşık 80 ml ​​deiyonize H 2 O ile 90 ml'lik Petri kabındaki bireysel yumurta kağıtları daldırarak yumurtadan yumurta teşvik Yaklaşık 0.25 mi gıda bulamaç ekleyin.
  4. 24 saat sonra ince çizgiler birinci değişim safhasındaki larva sayısı kalın. Larvaları görselleştirmek ve çanağın bir tarafında bir ışık kaynağı yerleştirmek için siyah bir yüzey Petri tabağına yerleştirin. Larva bireysel larva net bir taksitli için izin ışık kaynağından uzak hareket edecek. Bireysel larva anlatırken önlemek için sayım sırasında bir pipet ile bireysel larva çıkarın.
  5. Yeni bir Petri kabı ve yeniden-kuru yerleştirin yumurta kağıtları. Yeniden yumurtadan yumurta yine ~ 1 hafta ve sonra yukarıdaki yöntemi kullanarak yumurtadan yumurta taksitli.
  6. Kalan u Yeri yumurta kağıtları Yaklaşık 80 ml ​​beyazlatma solüsyonu 28 ml 90 yeni Petri kapları yumurta n-yumurtadan. Yumurta kağıtları tamamen ağartma çözeltisine batırılmış emin olun ve çamaşır suyu kokusunu önlemek için bir davlumbaz gecede altında bırakın.
    NOT: Bu maddeler, 4 ° C'de yaklaşık 1 hafta boyunca muhafaza edilebilir, ancak aksi takdirde taze yapılmalıdır.
  7. Koryon temizlemek ve embriyo, un-yumurtadan yumurta görselleştirme sağlayacak beyazlatma gibi bir ışık mikroskobu kullanılarak yumurta kontrol edin. Yumurta embriyolu ise yumurta sırt tarafında birbirine zıt iki küçük siyah noktalar şeklinde görünen gözlü grimsi beyaz bir renge sahip olur. Un-taranmış, embriyonlu yumurta 13 sayısını taksitli.
  8. Hayır =% diapause: Aşağıdaki formül ile diapause sıklığını belirler. embriyone un-yumurtadan yumurta / (hayır. yumurtadan yumurta + hayır. embriyone un-yumurtadan yumurta) 100 13 x.

Yumurta / pharate Larvalarına 7. RNA Ekstraksiyon

"ontent> NOT: Bir laminer akış kaputu kullanın Trizol.

  1. Bir deve tüyü fırça kullanarak cam taşlama için yumurta kağıtları farklı gelişim zaman noktalarında gelişen embriyolar ya pharate larva içeren Fırça sivrisinek yumurtaları. Tamamen toz haline gelene kadar Trizol yumurta (doku 50-100 mg başına 1 mi) öğütün. Yeterli RNA elde kütüphanede başına en az 400 yumurta kullanın.
    1. Seçenek olarak ise, sıvı azot içinde dondurularak yumurta bileşenini ve Trizol taşlama önce bir ay kadar için mikrosantrifüj tüpleri içinde -80 ° C'de saklandı.
  2. Trizol RNA ekstraksiyonu yapın, üreticinin talimatlarına uygun olarak, izopropanol çökeltme eklenmiştir.
  3. RNA, bağlı bozulmayı önlemek için herhangi bir kalıntı nükleazlar kaldırmak için RNaz dekontaminasyon çözelti ya da diğer maddeler ile birlikte tezgah tedavi edin.
    1. DNase ile ekstre RNA tedavi edin. Üreticinin talimatlarına göre, 37 ° C'de 30 dakika boyunca DNaz ile RNA örnekleri inkübe edin. 1 & # kullanın181; 50 ml'lik bir reaksiyon içinde RNA kadar 10 ug l DNaz. Bir reaksiyonda RNA fazla 10 ug varsa DNase miktarını artırır.
    2. 5 ul askıya DNaz inaktivasyon reaktif ekleyerek DNase inaktive. Kuluçka döneminin (hafif girdaplama) sırasında üç kez karıştırma, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    3. 1.5 dakika için 10,000 x g'de santrifüjleyin. Sonraki adımlar için yeni tüplere tedavi RNA örnekleri ihtiva eden üst sıvıyı aktarın.
  4. Fluorometri toplam RNA örneklerinin kalitesini değerlendirmek. Bu görev için uygun alet ile bir özel tesisine örnekleri gönderin. Tesis çip aşılanan floresan boya ile görüntülendi numune RNA türlerinin, boyutlarını belirlemek için çip jel elektroforezi gerçekleştirecektir. Sonuçlar bir electropherogram olarak iade edilecektir.
    1. Varlığı o tarafından kanıtlandığı gibi, varlığında veya bozunma ürünlerinin yokluğunda toplam RNA numunelerinin bütünlüğünü belirlemekElde electropherogram (Şekil 1B) üzerinde 18S ve 5S ribozomal RNA zirveleri arasında f zirveleri.

8. RNA Sıralama

  1. Standart protokolleri takip zenginleştirilmiş eşleştirilmiş-uç mRNA kütüphaneleri ve mRNA sıralama, yapımı için ticari bir sıralama merkezi yeterince yüksek kalitede (Şekil 1A) ve miktarı (kütüphane başına genellikle> 3 mg) ile toplam RNA örnekleri gönderin.
  2. Birden fazla şeritli bir tek deney sıralanması için kullanılan ediliyorsa, sıralama sırasında şerit arasında teknik varyasyon için hesap sıralama için iki şerit halinde bireysel kütüphaneler bölünmüş.

9. lllumina Oku Temizlik

NOT: Şekil 2, bu protokolün biyoinformatik bölümünü özetlemektedir. Bu protokolün biyoinformatik bölümünde kullanılan tüm programlar ve kaynakların tam listesi için, Tablo 1 bakınız. InAyrıca, Ek Dosya 1 Aşağıdaki biyoinformatik protokol adımların her biri için komut satırı örneklerini içerir.

  1. NCBI UniVec Çekirdek veritabanına% 95 kimlik ya da daha yüksek bir eşleşme için ssaha2 29 (Tablo 1) kullanarak (Tablo 1), C. albopictus rRNA dizi (Gen Bankası # L22060.1), ve sıralama adaptörleri (Ek Dosya 1'de verilmiştir Ayrıntılı komut satırı örnekleri). Sağlanan Perl script (Ek Dosya 2) adapte örneğin Perl kullanarak maçlarda veya benzeri bir komut dosyası aracı ile okuma çiftleri çıkarın.
  2. Kalan Temiz SolexaQA paketiyle 30 okur (Tablo 1; Ek Dosya 1): DynamicTrim.pl varsayılan ayarları kullanarak 20'den daha az bir phred puan eşdeğeri olan bölgeleri kırpın.
    1. Kaldır ileri hem LengthSort.pl ile daha kısa 25 bp okur ve ters aynı anda okur. FastQC (Tablo 1 ile fastq temizlenen dosyaların kalitesini değerlendirmek ) - Özellikle, başına tabanı dizisi kalitesi ve başına dizisi kalitesi puanları 20'nin üzerinde olduğunu doğrulayın.

10. Dijital Normalleştirme

  1. K-mer boyutu 20, 20 bir kapsama kesme, ve x kullanarak (özellikle normalize-by-median.py; (Ek Dosya 1 Tablo 1) khmer aracını kullanarak 31 okur temizlenmiş dijital normalleşme bir tur yapın = 1E10).
  2. Yüksek RAM ile bir makine mevcut (GBS yüzlerce) ise Alternatif, Trinity normalize_by_kmer_coverage.pl komut (Tablo 1) kullanın.

11. De Novo Transkriptom Meclisi

  1. Montaj büyüklüğüne bağlı olarak, RAM kadar 256 Gb ve 24 işlemcilerde olan bir bilgisayar veya bilgisayar kümeye erişimi edinin.
  2. Komşularla içine yerleştirilen dijital normalize okuma monte etmek, Trinity 32 (Ek Dosya 1 Tablo 1) kullanın. Azaltmak için,bellek kullanımı, --min_kmer_cov 2 kullanın.

12. Meclis Değerlendirme

  1. Trinity kontig çıkış Assemblathon2 projesi 33 assemblathon_stats.pl çalıştırın. (; Ek Dosya 1 Tablo 1) Bu script gibi iskelelerinin sayısı, N50, montaj kompozisyon, ve daha fazlası gibi değerlendirilmesi montaj kalitesi ile ilgili temel hesaplamaları gerçekleştirir.

Montajlı transcriptome 13. Ek Açıklama

  1. Bir referans protein kümesi karşı toplanma BLASTX (Tablo 1) gerçekleştirin; sivrisinekler için, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens ve Aedes aegypti uygun referanslar vardır. Özellikle, BLASTX (Ek Dosya 1) takip patlamanın referans protein Fasta dosyasını, biçimlendirmek.

14. Harita RSEM 34 Kullanma Meclise okur (Tablo 1)

  1. Bir 'transkript-to-gen haritasının' dosyası oluşturun hangiİlk sütun referans gen kimlikleri ve ikinci sütun kontigi kimlikleri içeriyor. Bir elektronik tablo editörü olarak, BLASTX çıkışından birinci ve ikinci sütun takas ve bir .txt dosyasına bu sütunları yazın. Unix formatına sonuçlanan .txt dosyasında satır sonlarını dönüştürmek için lineBreak programını kullanın.
  2. RSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan rsem-hazırlamak-referans komut kullanarak transcriptome Fasta dosyasından bir başvuru dataset oluşturun.
  3. RSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan rsem-hesaplamak ifade komutunu kullanarak her kütüphane için ayrı ayrı ifade değerlerini hesaplayın. Okur gibi, okuma-temizleme adım (adım 9.2) kaynaklanan fastq eşleştirilmiş dosyaları kullanın.
    1. Biyolojik tekrarında RNA dizileme için iki şerit bölünmüş ise, tek bir dosya oluşturmak için ifade hesabında hem fastq dosyaları içerir.
  4. Kolayca diğer p tarafından işlenen bir matris her kütüphaneden ifade sonuçlarını dönüştürmeRSEM paketinin (Ek Dosya 1) sağlanan sağlanan komut rsem-oluşturmak-veri-matris kullanarak rograms.

15. Diferansiyel İfade Analizi

  1. R ve Edger (Tablo 1) takın.
  2. Adım 14.3 (Ek Dosya 1) den RSEM sonuçlarını yüklemek için read.delim kullanın. Gerekirse, en yakın tam sayıya sayıları yuvarlak.
    NOT: Kenar düzeninin kılavuzu önemini algılamak için yeterince yüksek bir ifade ile genlere veri kümesi sınırlayan önerir.
  3. Edger için verileri biçimlendirmek için, yüklenen veri dosyası (Ek Dosya 1) bir DGEList nesnesi oluşturur. Ardından, TMM normalleştirme (Ek Dosya 1) kullanarak veri normalleştirmek. Veri (Ek Dosya 1) ortak ve tagwise dağılımlarını tahmin.
  4. Bir Benjamini-Hochberg ile farklı ifade genleri tanımlamak p-değeri <0.05 (Ek Dosya 1) düzeltildi. Bereket vs log-kat-değişim (Ek Dosya 1) dağılımını çiziniz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki temsili RNA örneklerinin Florimetri (Şekil 1A, B) nt yaklaşık 2.000 iki bant gösterdi. böcek 28S ribozomal RNA, kolayca kısa ısıtma veya hidrojen bağları 35 bozan maddeler ile parçalanmıştır hidrojen bağları ile bir arada tutulan iki polinükleotid zincirlerinden meydana gelmektedir. Elde edilen iki bileşen yaklaşık 18S ribozomal RNA gibi aynı boyutta. ikinci RNA numunesi bozulması yüksek seviyelerde (Şekil 1B) göstermiştir.

A'nın tems...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol A indüklenen diapause photoperiodically nedeniyle farklı şekilde ifade edilen genleri bulmak için yöntemler sunulur albopictus. photoperiodic diapause yanıt odaklanan kişiler için özellikle - protokolü benzersiz acemi kullanıcılar için erişilebilir bir moleküler fizyoloji programın tüm deneysel yönlerini yapmak için sivrisinek yetiştirme ve biyoinformatik teknikleri birleştiren önemli olduğunu. Yetiştiricilik hataları tespit etmek genellikle gereklidir - - Mevcut yöntemler, bildiğimiz kadar...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi 5R21AI081041-02 ve Georgetown Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
İnkübatör - Model 818Thermo-Scientific3751120 V
Kontrollü ortam odasıThermax ScientificN/AThermax Scientific Products tarafından özel spesifikasyonlara göre inşa edilmiş gömme kontrollü ortam odası. Bir inkübatöre daha büyük bir alternatif. http://thermmax.com/
Cool Floresan ampulPhilips3921834 W
Petri Kabı 100 mm x 20 mmFisher08-772-E Filtre Kağıdı
20,5 cmFisher09-803-6J
9,5 L KovaPlasticanBway Ürünlerhttp://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117
Yardımcı Programı Kumaş-Cibinlik BeyazJoann10173292
http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html Ortopedik çoraplarAlbahealth23650-040Ürün No. 081420
Organik Kuru ÜzümNewman'ın KendiUPC'si: 884284040255
Yumurtlama kapları (kahverengi)Fisher Scientific03-007-52Ürün aslında üstünü gördüğümüz 125 ml'lik amber bir şişe.
Geri Dönüşümlü Kağıt HavlularYedinci Nesil30BPT120
Modüler Mates Kare Tupperware SetiTupperwarehttp://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items
Cam ÖğütücüCorning Incorporated7727-2Bu Tenbroeck doku öğütücüler yumurtaları kırar ve RNA'yı TRI Reaktifine bırakır.
TRI ReaktifiSigma AldrichT942450-100 mg doku başına 1 ml TRI Reaktifi uygulayın. Dikkat — Bu reaktif toksiktir.
TURBO DNA içermeyenAmbion/Yaşam TeknolojileriAM1907Bu kit, geleneksel DNaz işleminden daha fazla verim sağlar ve ardından fenol/kloroform temizliği yapar ve kullanımı daha kolaydır.
RNaseZapAmbion/Yaşam TeknolojileriAM9782Tezgah yüzeylerine ve RNA örnekleriyle temas halinde olabilecek herhangi bir ekipmana bolca uygulayın. Çözelti hafif alkali/aşındırıcıdır, tahrişe neden olabilir ve yutulduğunda zararlıdır.
2100 BiyoanalizörAgilent TechnologiesG2939AABir çip üzerine 12 adede kadar RNA örneği yerleştirin.
Hemotek Membran BesleyiciHemotek 5W1Bu sistem  aynı anda kullanılabilen 5 besleme istasyonu sağlar. PS5 Güç Ünitesi ve Güç kablosu dahildir; 5 FUI Besleyici + Yemek Rezervuarları ve O-ringler; Plastik Tıkaçlar, Hemotek kollajen besleme membranı; Sıcaklık ayar aracı; ve Fiş çıkarma aracı. Şirketin posta adresi: Hemotek Ltd; Ünite 5 Birlik Mahkemesi; Alan Ramsbottom Yolu; Büyük Harwood; Lancashire, Birleşik Krallık; BB6 7FD; Tel.: +44 1254 889 307.
Dijital Termometre ve ProbHemotek MT3KFUMicroT3 termometre ve KFU probu. Bu, her bir FUI besleme ünitesinin sıcaklığını ayarlamak için kullanılır.
Tavuk Tam Kanı, Sodyum Sitrat ile steril olmayanPel-Freez Biologicals33130-1500 ml kan donduruldu ve -80 & # 176'da 20 ml'lik alikotlarda saklandı; 1 yıla kadar C. Kullanmadan önce kanı oda sıcaklığında en az 1 saat çözdürün.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bilyk, K. T., Cheng, C. H. C. Model of gene expression in extreme cold - reference transcriptome for the high-Antarctic cryopelagic notothenioid fish Pagothenia borchgrevinki. BMC Genomics. 14, 634(2013).
  2. Chapman, M. A., Hiscock, S. J., Filatov, D. A. Genomic divergence during speciation driven by adaptation to altitude. Mol. Biol. Evol. 30, 2553-2567 (2013).
  3. Schwarz, D., et al. Sympatric ecological speciation meets pyrosequencing: sampling the transcriptome of the apple maggot Rhagoletis pomonella. BMC Genomics. 10, 633(2009).
  4. Barshis, D. J., et al. Genomic basis for coral resilience to climate change. P. Natl Acad. Sci. USA. 110, 1387-1392 (2013).
  5. Urbanski, J. M., Aruda, A., Armbruster, P. A. A transcriptional element of the diapause program in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, identified by suppressive subtractive hybridization. J. Insect Physiol. 56, 1147-1154 (2010).
  6. Huang, Y. H., et al. The duck genome and transcriptome provide insight into an avian influenza virus reservoir species. Nat. Genet. 45, 776-783 (2013).
  7. Sessions, O. M., et al. Host cell transcriptome profile during wild-type and attenuated dengue virus infection. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (3), 2107(2013).
  8. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Deep sequencing reveals complex mechanisms of diapause preparation in the invasive mosquito, Aedes albopictus. P. R. Soc B. 280, (2013).
  9. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Elsik, C. G., Denlinger, D. L., Armbruster, P. A. Transcriptome sequencing as a platform to elucidate molecular components of the diapause response in Aedes albopictus. Physiol. Entomol. 38, 173-181 (2013).
  10. Poelchau, M. F., Reynolds, J. A., Denlinger, D. L., Elsik, C. G., Armbruster, P. A. A de novo transcriptome of the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, to identify candidate transcripts for diapause preparation. BMC Genomics. 12, 619(2011).
  11. Benedict, M. Q., Levine, R. S., Hawley, W. A., Lounibos, L. P. Spread of the tiger: Global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector-Borne Zoonot. 7, 76-85 (2007).
  12. Lounibos, L. P. Invasions by insect vectors of human disease. Annu. Rev. Entomol. 47, 233-266 (2002).
  13. Urbanski, J. M., et al. Rapid adaptive evolution of photoperiodic response during invasion and range expansion across a climatic gradient. Am. Nat. 179, 490-500 (2012).
  14. Lounibos, L. P., Escher, R. L., Lourenco-de-Oliveria, R. Asymmetric evolution of photoperiodic diapause in temperate and tropical invasive populations of Aedes albopictus (Diptera Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 96, 512-518 (2003).
  15. Mori, A., Oda, T., Wada, Y. Studies on the egg diapause and overwintering of Aedes albopictus in Nagasaki. Trop. Med. 23, 79-90 (1981).
  16. Pumpuni, C. B. Factors influencing photoperiodic control of egg diapause in Aedes albopictus [dissertation]. , (1989).
  17. Wang, R. L. Observations on the influence of photoperiod on egg diapause in Aedes albopictus Skuse. Acta Entomol. Sinica. 15, 75-77 (1966).
  18. Sota, T., Mogi, M. Survival-time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol. Exp. Appl. 63, 155-161 (1992).
  19. Reynolds, J. A., Poelchau, M. F., Rahman, Z., Armbruster, P. A., Denlinger, D. L. Transcript profiling reveals mechanisms for lipid conservation during diapause in the mosquito, Aedes albopictus. J. Insect Physiol. 58, 966-973 (2012).
  20. Andrewartha, H. G. Diapause in relation to the ecology of insects. Biol. Rev. 27, 50-107 (1952).
  21. Danks, H. V. Insect Dormancy: An Ecological Perspective. Biological Survey of Canada (Terrestrial Arthropods). , Ottowa, Canada. (1987).
  22. Denlinger, D. L. Regulation of diapause. Ann. Rev. Entomol. 47, 93-122 (2002).
  23. Rev Entomol, A. nn 59, 93-122 (2014).
  24. Armbruster, P. A., Conn, J. E. Geographic variation of larval growth in North American Aedes albopictus (Diptera). Culicidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 99, 1234-1243 (2006).
  25. Reiter, P., Amador, M. A., Colon, N. Enhancement of the CDC ovitrap with hay infusions for daily monitoring of Aedes aegypti populations. J. Am. Mosquito Contr. Association. 7 (1), 52(1991).
  26. Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Dev. Biol. 8, 182(2008).
  27. Munstermann, L. Care and maintenance of Aedes mosquito colonies. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. Crampton, J., Beard, C., C, L. ouis , Springer. Netherlands. 13-20 (1997).
  28. Trpis, M. A new bleaching and decalcifying method for general use in zoology. Can. J. Zoolog. 48, 892-893 (1970).
  29. Ning, Z. M., Cox, A. J., Mullikin, J. C. SSAHA: A fast search method for large DNA databases. Genome Res. 11 (10), 1725-1729 (2001).
  30. Cox, M. P., Peterson, D. A., Biggs, P. J. SolexaQA: At-a-glance quality assessment of Illumina second-generation sequencing data. BMC Bioinformatics. 11, 485(2010).
  31. Brown, C. T., Howe, A., Zhang, Q., Pyrkosz, A. B., Brom, T. H. A reference-free algorithm for computational normalization of shotgun sequencing data [Internet]. , Available at: http://arxiv.org/abs/1203.4802 (2012).
  32. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nat. Biotechnol. 29 (7), 644-652 (2011).
  33. Bradnam, K. R., et al. Assemblathon 2: evaluating de novo methods of genome assembly in three vertebrate species. GigaScience. 2, 10(2013).
  34. Li, B., Dewey, C. RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome. BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).
  35. White, B. N., De Lucca, F. L. Preparation and analysis of RNA. Analytical Biochemistry of Insects. Turner, R. B. , Elsevier Scientific Publishing Company. Philadelphia, PA. (1977).
  36. Hawley, W. A. The biology of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Contr. Assoc. 4, 1-39 (1988).
  37. Dowling, Z., Ladeau, S. L., Armbruster, P., Biehler, D., Leisnham, P. T. Socioeconomic status affect mosquito (Diptera:Culicidae) larval habitat type availability and infestation level. J. Med Entomol. 50, 764-772 (2013).
  38. Benedict, M. Q. Chapter 2,4,10. Bloodfeeding: Membrane apparatuses and animals. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4). (2010).
  39. Das, S., Garver, S., Ramirez, J. R., Xi, Z., Dimopolous, G. Protocol for dengue infections in mosquitoes (A. aegypti) and infection phenotype determination. J. Vis. Exp. 5 (220), (2007).
  40. Goff, S. A., et al. The iPlant collaborative: cyberinfrastructure for plant biology. Plant Sci. 2 (34), (2011).
  41. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, 139-140 (2010).
  42. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27 (16), 2194-2220 (2011).
  43. Goecks, J., et al. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), 86(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Photoperiodic DiapauseRNA Seq AnalysisAedes AlbopictusDiapause InductionGene Expression ProfilingTranscriptome AssemblyDifferential Expression AnalysisRNA ExtractionIllumina SequencingBioinformatics Workflow

Related Articles