Prostat Hücrelerinin Yönlü Göç Eğitim için özel tasarlanmış galvanotaksis Chambers kullanılması

Summary

Özel yapım bir galvanotoksis odasında göç eden, ölümsüzleştirilmiş prostat hücrelerine fizyolojik bir elektrik alanı uygulamak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemi kullanarak, 2 sıra tümörjenik olmayan prostat hücresinin sahada farklı derecelerde göç yönlülüğü gösterdiğini gösteriyoruz.

Abstract

fizyolojik elektrik alan gibi embriyo gelişimi, nöronal akıbet ve epitel yara iyileşmesinde hücre göçü yönetmenlik gibi belirli biyolojik fonksiyonları, hizmet vermektedir. In vitro olarak kültürlenen hücrelere doğru akım elektrik alanı uygulanması yönlü hücre göçü veya galvanotaksis neden olur. Burada ortaya 2 boyutlu galvanotaksis yöntemi ölçüye poli (vinil klorür) (PVC) odaları, cam yüzeyi, platin elektrot ve hücreler, görüntülü edildiği, bir motorlu kaide kullanımı ile modifiye edilir. PVC odaları ve platin elektrotları düşük sitotoksisite gösterirler ve uygun fiyatlı ve yeniden kullanılabilir vardır. Cam yüzeyi ve motorlu mikroskop sahne görüntülerin kalitesini artırmak ve hücrelere cam yüzeyi ve tedavileri mümkün değişikliklere izin. Biz olmayan iki tümörijenik, SV40-ölümsüzleştirdi prostat hücre hatları, prns-1-1 ve PNT2 ve galvanotaksis filme. Bu iki hücre hatları benzer göç hızları göstermek ve hem de doğru göçkatot, ancak galvanotaksis yönelmişlik farklı bir derecede gösteriyor. Bu protokol ile elde edilen sonuçlar prns-1-1 ve PNT2 hücre hatları kendi yönlü göç yanıtları yöneten farklı içsel özelliklere sahip olabileceğini düşündürmektedir.

Introduction

Endojen elektrik alanlar, cilt ^{1, 32, 33} ve beyin ² gibi çeşitli dokularda, tespit edilir. fizyolojik elektrik alanı nöron ^{5, 6} büyümesinin yol ve epitelyal kornea yara kapanması ^{1, 7} teşvik yönlendiren embriyo gelişimi ^{3, 4} de dahil olmak üzere, belirli bir biyolojik fonksiyonları yerine getirir,. in vitro kültürlenmiş hücrelere doğru akım elektrik alanı uygulanması taklit fizyolojik elektrik alanı ve yön hücre göçü, ya da galvanotaksis uyarmaktadır. Galvanotaksis, neuroblasts ^2, ve nöronal progenitör hücreleri ^14, fibroblastlar ^8, balık keratinositler ^9, insa....

Protocol

1. Kültürleme Prostat Hücreleri

1. Kültür prns-1-1% 5 _CO2 ile 37 ° C'de% 10 FBS ve antibiyotik antimikotik ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde, 100 mm kültür çanakları üzerinde ve PNT2 prostat hücreleri. Hücreler galvanotaksis deneyler için% 80 confluency ulaşana kadar her gün kültür ortamı yenileyin.

2. Montaj galvanotaksis Odaları

1. Alt odalarını Montaj
   1. 2-propanol ile plastik galvanotaksis odası silin. Bir şırınga ile bir bölmenin alt tarafındaki dairesel açıklıklar etrafında deniz grade silikon astarı uygulayınız ve büyük bir coverglass (Şekil 1) takın. Coverglass bast....

Results

Prostat hücreleri (prns-1-1 ve PNT2) iki satır, bu yöntemle araştırılmıştır. Her iki hatta hücreler 2 saate (Şekil 5A) boyunca 1.0 +/- 0.3 mikron / dakika arasında benzer hızlarda göç ederler. Bununla birlikte, elektrik alanına yön prns-1-1 hattı için 0.7 +/- 0.3 ve PNT2 hattı (Şekil 5B) 0.2 +/- 0.8. Sonuçlar, pozisyonel ipuçları farklı yön yanıtlarına neden farklı hücresel sinyal mekanizmalarına sahip olduğunu düşündüren, (100 hücre izlendi p <0.01), bu iki hücre hatları galvanotaks.......

Discussion

Bir hücrenin galvanotaksis tepki analizi pek çok hücresel göçmen veya büyüme için önemli bir fonksiyonel gösterge ^{27, 28} süreçleri olmuştur. Burada iki prostat hücre hatları film cam yüzeyi ile bir ısmarlama odasına kullanın. Bu hücre hatları galvanotaksis farklı derecelerde gösterdi, ve hücre içi lokalizasyonu veya galvanotaksis-sağlayan proteinlerin aktivasyonu galvanotaksis karşılık olarak gözlenen farkın neden ölümsüz hücre sıraları oluşturma işlemi sırasında müdahale olabilir düşünmekteyiz.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
>pRNS-1-1 prostat hücreleri			Lee, et al. (1994)
PNT2 prostat hücreleri	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	37 °C'ye kadar ısınma; Fetal
Sığır Serumu	Atlanta Biologicals	S11150	PBS'de %10, 37 ° C'ye kadar ısıtın; C kullanmadan önce
Antibiyotik-Antimikotik (100x)	Life Technologies	15240	500 ml ortama 5 ml
ekleyin 2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-		137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2< / sub>HPO4< / sub> ve 1.000 ml H içinde KH2< / sub>PO 4< / sub> 1.000 ml H 2< / sub> O, pH 7.4'e kadar ve otoklavlanmış, 37 °C'ye kadar ısıtın; C kullanmadan önce
% 0.25 Tripsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	37 °C'ye kadar ısınma; C kullanmadan önce, hücreleri 37 ° C'de 3-5 dakika tedavi edin; C
Galvanotoksi cihazı
Galvanotoksi odaları	Precision Plastics Inc, CA		Özel tasarım (1/4" x 2" x 3.5"), toksik olmayan, şeffaf PVC odalar. Tasarım özellikleri için lütfen yazarlarla iletişime geçin.
Galvanotaksis elektrotları	UCD elektrik dükkanı		esnek kordonlu platin sarmal elektrotlar
Galvanotaxis güç kutusu	Yüzey Mühendisliği, CA		voltmetre ile özel tasarlanmış DC güç çıkışı
Mikroskop Kapak Camı, Büyük, 45 x 50 mm, No. 1.5	Fisher	12-544-F
Mikroskop Kapak Camı, küçük, 25 x 25 mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Elmas nokta işaretleyici	ThermoScientific	750
Denizcilik sınıfı silikon sızdırmazlık maddesi, şeffaf	3M	051135-08019
Yüksek vakumlu gres	Dow Corning	2021846-0807
6 ml şırınga	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Şırınga, 1.5 ml	Nichiryo	SG-M
Pamuk aplikatörleri	Purtian Medikal Ürünler	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC boru	Nalgene	8000-9030	503/16 Kimlik x 5/16 OD x 1/16 Duvar
Bacto-Agar	Difco	0140-01	2 agar çözeltisi yapın
Tıraş Bıçağı	Personna	74-0001
Ekipmanlar ve Yazılım
Tezgah Üstü Santrifüj	Eppendorf	5810R	A-4-62 rotorlu
Cellometer Auto T4	Nexcelom ile çalıştırılır	Otomatik T4
Hücreölçer sayma odaları	Nexcelom	CHT4-SD100-002	yük 20 & # 956;
Kültür Sıcaklığı Isıtma plakası	Bel-Art Scienceware	370150000'i	; C
Eclipse TE-2000 mikroskobu, motorlu tabla ve çevre haznesi ile	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objektif len	Nikon
Retiga EX CCD fotoğraf makinesi	Qimaging		Soğutmalı CCD camara, tek renkli, 12-bit
Basınçlı hava, %5 CO2	Airgas		özel sipariş
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image edinme yazılımı
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell izleme yazılımı ve migrasyon açılarını ölçmek için özelleştirilmiş
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 Mac için	Microsoft Microsoft