Prostat Hücrelerinin Yönlü Göç Eğitim için özel tasarlanmış galvanotaksis Chambers kullanılması

Summary

Özel yapım bir galvanotoksis odasında göç eden, ölümsüzleştirilmiş prostat hücrelerine fizyolojik bir elektrik alanı uygulamak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemi kullanarak, 2 sıra tümörjenik olmayan prostat hücresinin sahada farklı derecelerde göç yönlülüğü gösterdiğini gösteriyoruz.

Abstract

fizyolojik elektrik alan gibi embriyo gelişimi, nöronal akıbet ve epitel yara iyileşmesinde hücre göçü yönetmenlik gibi belirli biyolojik fonksiyonları, hizmet vermektedir. In vitro olarak kültürlenen hücrelere doğru akım elektrik alanı uygulanması yönlü hücre göçü veya galvanotaksis neden olur. Burada ortaya 2 boyutlu galvanotaksis yöntemi ölçüye poli (vinil klorür) (PVC) odaları, cam yüzeyi, platin elektrot ve hücreler, görüntülü edildiği, bir motorlu kaide kullanımı ile modifiye edilir. PVC odaları ve platin elektrotları düşük sitotoksisite gösterirler ve uygun fiyatlı ve yeniden kullanılabilir vardır. Cam yüzeyi ve motorlu mikroskop sahne görüntülerin kalitesini artırmak ve hücrelere cam yüzeyi ve tedavileri mümkün değişikliklere izin. Biz olmayan iki tümörijenik, SV40-ölümsüzleştirdi prostat hücre hatları, prns-1-1 ve PNT2 ve galvanotaksis filme. Bu iki hücre hatları benzer göç hızları göstermek ve hem de doğru göçkatot, ancak galvanotaksis yönelmişlik farklı bir derecede gösteriyor. Bu protokol ile elde edilen sonuçlar prns-1-1 ve PNT2 hücre hatları kendi yönlü göç yanıtları yöneten farklı içsel özelliklere sahip olabileceğini düşündürmektedir.

Introduction

Endojen elektrik alanlar, cilt ^{1, 32, 33} ve beyin ² gibi çeşitli dokularda, tespit edilir. fizyolojik elektrik alanı nöron ^{5, 6} büyümesinin yol ve epitelyal kornea yara kapanması ^{1, 7} teşvik yönlendiren embriyo gelişimi ^{3, 4} de dahil olmak üzere, belirli bir biyolojik fonksiyonları yerine getirir,. in vitro kültürlenmiş hücrelere doğru akım elektrik alanı uygulanması taklit fizyolojik elektrik alanı ve yön hücre göçü, ya da galvanotaksis uyarmaktadır. Galvanotaksis, neuroblasts ^2, ve nöronal progenitör hücreleri ^14, fibroblastlar ^8, balık keratinositler ^9, insan epitel ve kornea keratinositler ^10-12 okudu ¹³ lenfosit olmuştur. (-) Kutbuna uygulamalı alana maruz kaldığında, incelenen hücrelerin çoğunluğu katot doğru yönde göç. Bununla birlikte, yüksek düzeyde metastatik dahil olmak üzere çeşitli kanser hücreleri,insan göğüs kanseri hücreleri ve insan prostat kanseri hücre kuşağı PC-3M, anodal (+) kutup ^{15, 16} hareket eder. Çeşitli mekanizmalar galvanotaksis aracılık aktivasyonu da dahil olmak üzere elektrik alanını duymak üzere hücrelerin yeteneği, açıklamak için öne sürülen EGF ¹² reseptörleri olan, epitel sodyum kanalı ^17, PI3K ve PTEN ^18, ve kalsiyum serbest mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamıştır. ^{15, 19} iyonların ve birden çok sinyal yollarının galvanotaksis katılan mümkündür.

Burada ortaya 2 boyutlu galvanotaksis yöntemi yapışık, hareketli hücrelerin belli bir yönde geçişini tanımlamak için, ya da ^{18, 20.} Bu teknik, değiştirilmiş olan birleşik hücre tabakasının bireysel hücre göçü ^{10, 12, 17} ya da göç izlemek için yararlıdır Peng ve Jaffe ^21, ve Nishimura ve ark. ısmarlama, açık PVC odaları ile ^10, çıkarılabilir coversl ileIPS gibi bağışıklık floresan görüntüleme gibi ikincil analizi için galvanotaksis, sonra kolayca hücre alımı için izin. galvanotaksis odaları cam yüzeyi yüksek büyütmede ve floresan etiketli hücreleri ile filme sağlayan, optik-uyumludur. Aynı zamanda, bu tür bir yüzey kaplaması veya masraf değiştirilmesi gibi, cam yüzeyin modifikasyonu ile deney tasarımı sağlar. No: 1 coverglass yapılmış Aralayıcılar hücreleri üzerinde mevcut akışını en aza indirmek için odalar içinde kullanılır; Bu nedenle akım karesiyle orantılıdır joule ısıtma, deney sırasında hücreler aşırı ısınmasına olmaz. bağlayan köprüler Agar hücreleri ile elektrotların direkt temasını önlemek ve galvanotaksis sırasında ortam pH veya iyon konsantrasyonunun değişimi önlemek.

İki olmayan insan prostat kanser oluşturucu hücre çizgileri bu çalışmada kullanılan galvanotaksis yanıtı için incelenmiştir. prns-1-1 ²² ve PNT2 ²³ hem SV4 olanBüyüme faktörüne bağlı hücre çizgileri, prostat spesifik antijeni (PSA) düşük ya da hiç bir ifade ile 5, 8, 18 ve 19 sitokeratin epitel işaretlerini ifade 0-ölümsüzleştirilmiş. Her iki hücre dizisi normal epitel hücreleri çokgen morfolojisini muhafaza ama kromozom anormalliği karar verildi.İşlemi ^{22, 24} gözlendi. Prns-1-1 ve PNT2 çoğu deneyde içindeki davranışları paylaşmalarına rağmen bunlar asinar yapısının oluşumu ve farklılıkları gösteriyor galvanotaksis. 3-boyutlu matrisi üzerinde Matrigel, prns-1-1 hücreleri, normal prostat bezi dokusu ²⁵ benzeyen lümen içi boş asinar yapılar oluştururlar. Bununla birlikte, PNT2 hücreleri lümen veya polarize epitel ²⁶ olmadan katı küreler oluşturma. prns-1-1 hücreler de bu çalışmada PNT2 daha yüksek bir galvanotactic tepki göstermektedir. Listesi asinar yapısının oluşumu ve galvanotaksis arasındaki korelasyon prns-1-1 galvanotactic sinyalleri pr organize edilmesinde rol oynayabileceğini öneriyorostate bezi dokusu endojen elektrik alanlarına tepki olarak hareket ve bu 2 hücre hatları arasında ayrım yapmak için daha fazla özelliklerini içerir.

Protocol

1. Kültürleme Prostat Hücreleri

1. Kültür prns-1-1% 5 _CO2 ile 37 ° C'de% 10 FBS ve antibiyotik antimikotik ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamı içinde, 100 mm kültür çanakları üzerinde ve PNT2 prostat hücreleri. Hücreler galvanotaksis deneyler için% 80 confluency ulaşana kadar her gün kültür ortamı yenileyin.

2. Montaj galvanotaksis Odaları

1. Alt odalarını Montaj
   1. 2-propanol ile plastik galvanotaksis odası silin. Bir şırınga ile bir bölmenin alt tarafındaki dairesel açıklıklar etrafında deniz grade silikon astarı uygulayınız ve büyük bir coverglass (Şekil 1) takın. Coverglass bastırın ve pamuklu aşırı tutkal silmek için bir pamuk aplikatör arka tarafını kullanın. Yarı dairesel açıklıklar orta ve elektrik akımı, iki iç, orta rezervuar arasında yer alan hücreler üzerinde akmasına izin verir.
   2. 6 mm x 2 yapmak için küçük bir coverglass kesinBir elmas noktası işareti ile 5 mm tutucular.
   3. Odasına çevirin. Bir şırınga ve / veya alt camına 2 dairesel açıklıklar arasındaki hücre bağlanması için bir 10 mm x 25 mm kanal yüzey oluşturmak için metal bir spatula ile silikon tutkal şeritleri 2 uygulanır. 2 dairesel açıklıklar arasındaki cam aralama 2 adet Tutkal. Aralayıcıları aşağı doğru itin ve pamuklu ve / veya kürdan ile aşırı tutkal silmek için pamuk aplikatör arka tarafını kullanın.
   4. Silikon yapıştırıcı kürünü kadar 24 saat odasına kurutun. Tutkal, asetik asit kalıntılarını çıkarmak için damıtılmış su gece boyunca odası bekletin. Acil kullanım için odasına kurutun, veya temiz bir kap içinde daha sonra kullanılmak üzere odasına saklayın.
      
      Şekil 1: bottom galvanotaksis odasının Meclisi. A) büyük coverglass) T, temiz odanın. B tabanına yerleştirilmiştirCam ayırıcılar adet 2 dairesel açıklıklar arasında yapıştırılmış wo hücreler eklemek için bir 10 mm x 25 mm kanal oluşturmak için.
2. Galvanotaksis odalarına hücreleri Tohumlama
   1. Deney için gerekli galvanotaksis bölmelerin gerekli sayıda hazırlayın. Her bir hücre hattı veya tedavi tek galvanotaksis odası gerektirir. 2-propanol ile galvanotaksis odaları silin. Steril PBS ile 3 kez yıkayın odaları ve odalarına 2 dairesel açıklıklar arasındaki sıvı akışını kontrol edin.
   2. Steril hücre kültür tabaklarında odacıkları içine alın ve bunları, 15 dakika boyunca 37 ° C'de dengelenmeye gelmeye bırakın. 5 dakika için 37 ° C de, 5 ml% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak kültür kabı prostat hücreleri ayırmak. PBS içinde 5 ml% 10 FBS ile tripsin-EDTA nötralize.
   3. 15 ml tüpler hücreleri aktarın ve 200 x g, 37 ° C'de 5 dakika boyunca hücreler santrifüj. Süpernatan aspire ve kültür ortamı, 1 ml hücre yeniden askıya.
   4. 20 μ alHücre eriyiği bir sayım odasına yüklemek ve hücre sayısını hesaplayın. Kültür ortamında 8 x 10 ⁴ hücre / ml hücre konsantrasyonunu ayarlayın.
   5. 37 ° C inkübatör dışına galvanotaksis odaları atın. Her bölmenin üzerine hücre süspansiyonu 350 ul Tohum.
   6. Islak Kimwipe ya da% 5 _CO2 ile 37 ° C de kuluçka makinesi içinde bir nem odasında kültür çanağı içinde gece boyunca odalarında hücreleri inkübe edin.

Şekil 2:. Bölmeye tohum hücreleri alt bölme kurutuldu ve temizlenir A) Prostat hücreleri tripsinize sayılır ve bölmeye aktarılır ve bir gece boyunca inkübe edilir B) üst coverglass filme önce bölmeyi kapatmak için takılır...

3. BirEn iyi odaları ssembling
   1. Çekimlerden önce üst odasını birleştirin. Mikroskop sadece bir seferde tek bir galvanotaksis odasını görüntüleme ağırlayacak. Her galvanotaksis bölmesi için 37 ° C'de kültür ortamında 10 ml kadar ısıtın. 37 ° C ısıtma plakasına kuluçka bir galvanotaksis odası aktarın.
   2. Birleşmeyen hücrelerin çıkarılması için kültür ortamı ile hücrelerin durulayın. Bölme ortamın 400 ul bırakın. Her iki cam aralama üstünde yüksek vakum yağı uygulamak için bir şırınga kullanın.
   3. Odasına mühür küçük bir coverglass ekleyin. Yavaşça bir pamuk aplikatör arka tarafı ile coverglass bastırın. Pamuklu aşırı orta siliniz.
   4. Cam yüzeyini kurulayın ve coverglass ve odanın arasındaki boşluğu kapatmak için yüksek vakum gres sürün. Yağ yaymak için bir metal spatula kullanın. İç rezervuarlar için kültür ortamı 4 ml ekleyin ve rezervuar arasındaki sıvı akışını kontrol edin.
4. Agar olunköprüler
   1. 2 inç uzunluğunda bir PVC boru donanımının bir çift kesme (503/16 çapa x 5/16 dış çaplı x 1/16 duvar), çevirme ve 100 ml'lik bir beher içine yerleştirin.
   2. 200 mg Bacto-Agar ölçün ve% 2 agar jel için 10 ml kültür ortamı ile bir 50 ml'lik bir şişe içinde ilave edin. 30 saniye boyunca mikrodalga. Bir transfer pipet ile plastik boru agar jel yükleyin. Ağarı katılaştırmak için bir 10 dakika boyunca, oda sıcaklığında, agar köprüler bırakın.
   3. Galvanotaksis odasının dış rezervuar 2 ml kültür ortamı ekleyin. Akımını yapmak için iç ve dış ortam rezervuar agar köprüler yerleştirin.

Şekil 3:. Odasının üzerine hücreleri filme bir diyagram galvanotaksis odasının son montajını göstermek için. odası tamamen yüksek vakum gres ile mühürlenir. Orta t ilave edilirO rezervuarları doldurun ve iki agar köprü odasına yerleştirilir. Daha sonra galvanotaksis odası mikroskop kademesine aktarılmaktadır ve elektrotların elektrik alanı uygulamak için eklenir. Monte galvanotaksis odasının yan görünüşüdür elektrik akımı agar köprü ve cam kapak arasındaki boşluk boyunca hücrelerin üzerine akar göstermek için gösterilmiştir.

3. Time-lapse Görüntüleme

1. Önce görüntüleme dolaşan hava, 2 saat içinde% 5 _CO2 ile 37 ° C çevre odasında açın.
2. Mikroskop açın ve görüntü elde yazılımı başlatmak. Mikroskop sahne kalibre ve 10X objektif seçin.
3. , Mikroskop sahneye galvanotaksis odaları transfer bant ile sabitleyin odasına ve hücrelerin odaklanın. Sağ taraftaki katot ile dış rezervuar için galvanotaksis elektrotlar yerleştirin. Tel ve bant ile elektrotlar sabitleyin.
4. Güç bo açınX odasına bir elektrik alanı uygulamak için. 25 mm uzunluğunda odasının (100 mV / mm) için 2.5 volt ulaşmak için odasına genelinde voltmetre ile çıkış gerilimini ölçün. Çıkış akımını ayarlayarak deney sırasında saha gücünü korumak.
5. On Time-lapse filmleri oluşturmak için yazılım film odasının karşısında 10 puan seçin. 2 saat 10 dakika aralıklarla satın alma koşulları kurun.
6. Filme başlatın ve gerektiği gibi çıkış akımını ayarlayın.
7. Deneyin sonunda, sahneden odasına çıkarın ve% 95 alkol ile hücreleri tamir. Temizlemek için bir jilet ile açık odasını kırın ve tekrar kullanın.

Galvanotaksis 4. miktarının belirlenmesi

1. Time-lapse film ve yeniden orient görüntülerin üstüne katot döndürün. Hücre izleme yazılımı filmleri verin.
2. El ile her bir film (Şekil 4A, B), her bir zaman noktasında 10-20 hücrelerinin (x, y) konumu etiket.kuzey-güney doğrultusunda göre göç mesafeleri ve açıları, elektrik alanının aynı yönelimi, hücre izleme yazılımı (Şekil 4C) olarak hesaplanacaktır.
   NOT: Ortalama göç hızı, toplam göç mesafesi ve toplam filme zaman dönüştürülür. yön kosinüs değeri açılardan dönüştürülür. Hücreler rastgele yönlülük ile geçirirseniz, net kosinüs ortalaması sıfıra yakın olacaktır. Hücreler katot doğru doğrudan geçirirseniz, kosinüs değeri +1 olacaktır. Hücreler anot doğru doğrudan geçirirseniz, kosinüs değeri -1 olur.

Şekil 4: Hücre izleme yönünü ölçmek için hücre görüntüleri ile izleme hatlarının A) Kaplama.. Hücrelerin (x, y) konumu manua olanLly zaman atlamalı filmleri izlenir. . Hücreler rastgele göç varsa, ortalama kosinüs sıfıra yakın B) Ancak, hücreler katot veya anot doğru göç halinde, ortalama kosinüs değeri + (katot) ya da yakın -. (Anot) 1.0 ° C ) yön göç açıları (θ) dönüştürülür kosinüs değeri, tarafından sunulmaktadır. kosinüs (θ) mesafe b (elektrik alanının yönüne öngörülen mesafe) uzaklığa bir (göç mesafe) oranına eşittir.

3. Ölçümleri kaydedin. Kombine sonuçları hesaplamak için bir veritabanı uygulaması veri almak.
4. Çubuk grafikler (Şekil 5) çizmek için bir tablo ortalama göç hızı ve ortalama kosinüs değerinin kombine İhracat verileri.

Results

Prostat hücreleri (prns-1-1 ve PNT2) iki satır, bu yöntemle araştırılmıştır. Her iki hatta hücreler 2 saate (Şekil 5A) boyunca 1.0 +/- 0.3 mikron / dakika arasında benzer hızlarda göç ederler. Bununla birlikte, elektrik alanına yön prns-1-1 hattı için 0.7 +/- 0.3 ve PNT2 hattı (Şekil 5B) 0.2 +/- 0.8. Sonuçlar, pozisyonel ipuçları farklı yön yanıtlarına neden farklı hücresel sinyal mekanizmalarına sahip olduğunu düşündüren, (100 hücre izlendi p <0.01), bu iki hücre hatları galvanotaks...

Discussion

Bir hücrenin galvanotaksis tepki analizi pek çok hücresel göçmen veya büyüme için önemli bir fonksiyonel gösterge ^{27, 28} süreçleri olmuştur. Burada iki prostat hücre hatları film cam yüzeyi ile bir ısmarlama odasına kullanın. Bu hücre hatları galvanotaksis farklı derecelerde gösterdi, ve hücre içi lokalizasyonu veya galvanotaksis-sağlayan proteinlerin aktivasyonu galvanotaksis karşılık olarak gözlenen farkın neden ölümsüz hücre sıraları oluşturma işlemi sırasında müdahale olabilir düşünmekteyiz.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells
>pRNS-1-1 prostat hücreleri			Lee, et al. (1994)
PNT2 prostat hücreleri	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon, et al. (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	37 °C'ye kadar ısınma; Fetal
Sığır Serumu	Atlanta Biologicals	S11150	PBS'de %10, 37 ° C'ye kadar ısıtın; C kullanmadan önce
Antibiyotik-Antimikotik (100x)	Life Technologies	15240	500 ml ortama 5 ml
ekleyin 2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	-		137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2< / sub>HPO4< / sub> ve 1.000 ml H içinde KH2< / sub>PO 4< / sub> 1.000 ml H 2< / sub> O, pH 7.4'e kadar ve otoklavlanmış, 37 °C'ye kadar ısıtın; C kullanmadan önce
% 0.25 Tripsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	37 °C'ye kadar ısınma; C kullanmadan önce, hücreleri 37 ° C'de 3-5 dakika tedavi edin; C
Galvanotoksi cihazı
Galvanotoksi odaları	Precision Plastics Inc, CA		Özel tasarım (1/4" x 2" x 3.5"), toksik olmayan, şeffaf PVC odalar. Tasarım özellikleri için lütfen yazarlarla iletişime geçin.
Galvanotaksis elektrotları	UCD elektrik dükkanı		esnek kordonlu platin sarmal elektrotlar
Galvanotaxis güç kutusu	Yüzey Mühendisliği, CA		voltmetre ile özel tasarlanmış DC güç çıkışı
Mikroskop Kapak Camı, Büyük, 45 x 50 mm, No. 1.5	Fisher	12-544-F
Mikroskop Kapak Camı, küçük, 25 x 25 mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Elmas nokta işaretleyici	ThermoScientific	750
Denizcilik sınıfı silikon sızdırmazlık maddesi, şeffaf	3M	051135-08019
Yüksek vakumlu gres	Dow Corning	2021846-0807
6 ml şırınga	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Şırınga, 1.5 ml	Nichiryo	SG-M
Pamuk aplikatörleri	Purtian Medikal Ürünler	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC boru	Nalgene	8000-9030	503/16 Kimlik x 5/16 OD x 1/16 Duvar
Bacto-Agar	Difco	0140-01	2 agar çözeltisi yapın
Tıraş Bıçağı	Personna	74-0001
Ekipmanlar ve Yazılım
Tezgah Üstü Santrifüj	Eppendorf	5810R	A-4-62 rotorlu
Cellometer Auto T4	Nexcelom ile çalıştırılır	Otomatik T4
Hücreölçer sayma odaları	Nexcelom	CHT4-SD100-002	yük 20 & # 956;
Kültür Sıcaklığı Isıtma plakası	Bel-Art Scienceware	370150000'i	; C
Eclipse TE-2000 mikroskobu, motorlu tabla ve çevre haznesi ile	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objektif len	Nikon
Retiga EX CCD fotoğraf makinesi	Qimaging		Soğutmalı CCD camara, tek renkli, 12-bit
Basınçlı hava, %5 CO2	Airgas		özel sipariş
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image edinme yazılımı
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell izleme yazılımı ve migrasyon açılarını ölçmek için özelleştirilmiş
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 Mac için	Microsoft Microsoft