Yöntem makalesi

Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/51995

⸱

14 Eylül 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de recherche du CHUM, Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Viral yüzey antijenleri konformasyonlarını anlamak, antikor nötralizasyonunu değerlendirmek ve etkili aşı immünojenlerinin tasarımına rehberlik etmek için gereklidir. Burada, spesifik anti-Env antikorları tarafından transfekte edilmiş hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen trimerik HIV-1 Env'nin tanınmasının çalışmasına izin veren hücre bazlı bir ELISA testini açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HIV-1 zarf glikoproteinleri (Env), hedef hücrelere viral girişe aracılık eder ve bulaşıcı döngü için gereklidir. Bu glikoproteinlerin konformasyonel değişiklikleri yoluyla füzyon sürecini nasıl besleyebildiğini anlamak, aşı stratejileri için daha iyi, daha etkili immünojenlerin tasarlanmasına yol açabilir. Burada, trimerik HIV-1 Env'nin monoklonal antikorlar tarafından tanınmasının incelenmesine izin veren hücre bazlı bir ELISA testini açıklıyoruz. Transfekte edilmiş hücrelerin yüzeyinde HIV-1 trimerik Env'nin ekspresyonunu takiben, konformasyona özgü anti-Env antikorları hücrelerle inkübe edilir. Daha sonra bağlı antikorları tespit etmek için bir yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikoru ve basit bir kemilüminesans reaksiyonu kullanılır. Bu sistem oldukça esnektir ve çözünür CD4 veya hücresel proteinler tarafından indüklenen Env konformasyonel değişikliklerini tespit edebilir. Minimum miktarda malzeme gerektirir ve son derece özel ekipman veya bilgi birikimi gerektirmez. Bu nedenle, bu teknik, yeni izole edilmiş antikorlar gibi antijenlerin ve antikorların orta ila yüksek verimli taraması için oluşturulabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trimerik viral zarf glikoproteinleri (env) aracılık ettiği insan bağışıklık eksikliği virüsü tip 1 (HIV-1) girişi, bulaşıcı döngüsünün ilk adımdır. Virionlar yüzeyinde sunulan yalnızca açıkta kalan, viral antijen olarak, Env trimer, nötralize edici antikorlar ve nonneutralizing ortaya çıkarmaktadır. Bu nedenle, bu aşı tasarımının immünojen olarak ilginç bir adaydır temsil eder. Ancak, çözünebilir veya rekombinant formlar Env ile aşılama denemeleri primer HIV-1 1-3 izolatlar karşısında sadece minimal etkinliği ile tepkilere yol açtı. Bununla birlikte, kısmi bir imünojen etkinliği bir aday olarak, HIV-1 Env RV144 aşı deneme 4 yeniden ilgi görülmektedir. Bu aşı-ortaya, anti-Zarf antikorlar SIV karşı koruma belirli bir ölçüde oluşturmak için yeterli ve HIV 5 zorlukları olduğunu açıklayan yeni bir çalışmada doğrulanmıştır.

Endoplazmik retikulum sentezlenen olan, Env glycoprote sonraön, gp160 içindeki, viral füzyon prosesinin yakıt kabiliyeti için kritik olan çeşitli dönüşüm sonrası değişikliğe uğrar. Zarf öncü gp120-gp41 irtibatın muhafaza kovalent olmayan etkileşimlerin ile, ekstra-sitoplazmik gp120'yi transmembran gp41'i alt birimden 6-10 bölünmüştür önce trimerleri düzgün ve ortak kat gerekir. Enfekte hücre mekanizması, yoğun bir toplam kütlesi 11,12 yaklaşık% 50 ihtiva eden, Env glikosilasyonunu sorumludur. Daha iyi anlamak için, farklı konformasyonlara önemini vurgulamaktadır, Env uyum sağlamak ve aksi 15-19 maruz kalacağı kesin olarak oldukça imünojenik epitopların gizlemek için izin vermek için düşünülen bir metastability sağlarken elde edilen kompleks yapısı, Env 13,14 şekilsel olarak esnek olmasını sağlar yerli Zarf trimer ile örneklenmiş.

Bugüne kadar, çeşitli teknikler geliştirilmiş ve başarıyla Zarf şekilsel ch incelemek için kullanılmıştıranges. Ancak, genellikle belirli Zarf bağlamlarda sınırlı olduğunu, kendi sınırlamaları değişir. Örneğin, yüzey plazmon rezonans veya konformasyonunun, spesifik monoklonal antikorlar kullanılarak immünopresipitasyon (mAb 'ler), ya da trimerik formları 20,21 ikinci immunogenetically farklı olduğu bilinmektedir monomerik çözünür ya da çözündürülmüş Zarf moleküller dayanmaktadır. Son çalışmalar da bölünme esas antikorlar 14,22,23 nonneutralizing tarafından tanınan epitoplann maruz kalma sonucunda Zarf konformasyonlar etkilediğini düşündürmektedir.

Burada ayrıntılı olarak hücreli olarak eksprese Zarf trimerler 18,24-26 konformasyonunun hızlı ve kolay belirlenmesine olanak sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. , Bir insan hücre hattında yapışık Env geçici transfeksiyonu takiben env-özgü antikorların bağlanma basit bir kimya ışıma tepkimesi kullanılarak tespit edilir. Bu teknik, aynı zamanda, aşağıdaki yapısal tercih karakterize etmek için kullanılabilir konformasyon-vingöçük antikorlar yer alır. Bu durumda, bu deney, bir sağlam ve esnek bir tespit etme yöntemi sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Gün 1 - Hücre Kültürü

  1. Plaka 4, 2 x 10 insan osteosarkoma (HOS) ışık yayılması okuma için uygun olan bir opak, 96-iyi hücre kültür plakası içerisinde oyuk başına hücreler. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U / ml penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kullanınız. 37 ° C,% 5 CO2 de ertesi güne kadar inkübe edin.

2. Gün 2 - Polietileniminin (PEI) Transfeksivon

  1. Sonraki aşamalara göre transfeksiyon karışımı hazırlayın. Aynı Env ile transfekte edilecek kuyu sayısı uygun reaktifler ve DNA miktarını ayarlayın.
  2. Tüp A: 25 mM HEPES ile desteklenmiş 5 ul DMEM Env kodlayan plazmid ng 10 ng TAT şifreleyici (örneğin pTat-III 27 gibi) plasmid ve 150 ekleyin.
  3. Bu gibi pSVIII Tat-bağımlı env kodlayan plazmidlerin kullanıldığı zaman TAT şifreleyici plasmitin gereklidir.
  4. Tüp B: 1 450 ng PEI (ekle5 ul DMEM ug / ml çözelti) eklenmiştir.
  5. İyice 10 saniye boyunca girdaplanarak boru C. Mix tüp B içerik ekleyin ve karıştırın transfeksiyon, oda sıcaklığında (22 ° C) 'de 10 dakika inkübe edilir.
  6. 96 çukurlu levha başına transfeksiyon karışımı 10 ul. 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde 48 saat süre ile inkübe edilir.

3. Gün 4 - ELISA

  1. Zarf / antikorlar komplekslerinin olası endositoz en aza indirmek için oda sıcaklığında en tüm deneyleri gerçekleştirin.
  2. Aynı zamanda kullanılmakta olan, plaka başına Yıkama Tamponu 250 ml hazırlayın. Yıkama Tampon 1x Tris tamponlu tuz (TBS), pH 7.5 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCI), 1 mM MgCl2 ve 1.8 mM CaCl2 ile desteklenen,.
  3. % 1 yağsız kuru süt ve Yıkama Tamponu ile 5 mM Tris, pH 8.0 ilave edilerek plaka başına Bloklama Tamponu 125 ml hazırlayın.
  4. 96 oyuklu bir plaka elde edilen hücre kültür ortamı ve transfeksiyon karışımı (süpernatant) çıkarın.
  5. 100 μ eklemeGözenek başına Bloklama Tamponu ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe l.
  6. Süpernatantı ve Bloklama Tamponu içinde uygun konsantrasyona seyreltildi oyuk başına antikor (ya da serum) 50 ul, ekleyin. Tipik olarak, 1 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda kullanılır. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  7. 100 ul Engelleme Tampon ve sonra 100 ul Yıkama Tampon ile yıkama işlemi 3 kere tekrarlayın ile 3x yıkayın.
  8. , Süpernatantı 100 ul Bloklama Tamponu ilave ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
  9. Süpernatantı ve Bloklama Tamponu içinde 1/3000 seyreltilmiş sekonder antikor, 50 ul ekle. Üretici farklılıklara göre optimal bir antikor seyreltme Vary. Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.
  10. 100 ul Engelleme Tampon ve sonra 100 ul Yıkama Tampon ile yıkama işlemi 3 kere tekrarlayın ile 3x yıkayın.

4. Veri Toplama

  1. Plaka süpernatantı ve iyi başına 30 ul 1x chemiluminescence (ECL) substrat ekleyin.
  2. Kimya Edinme1 saniye iluminescence sinyal / göz ile üretici talimatlarına göre uygun bir plaka okuyucu. Okuma zamanı donanım açısından farklılıklar olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda tarif edilen genel prosedür kullanılarak, yabani tip (wt) veya mutasyon geçirmiş ya da üzerinde Env CD4i epitoplarının maruz kaldığında, çözülebilir CD4 (sCD4) ile birlikte eksprese edilen, hücresel CD4 etkisini analiz etmek için adapte edilmiş bir protokol, 18,24, daha önce tarif edildiği gibi, 25,28. Şekil 1, genel prosedür uygulanarak ve sCD4 veya hücresel CD4 18 birlikte sentezlenmesiyle, tedaviden sonra CD4i epitoplarının maruz kalmasını gösterir Şe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deney, HIV-1 Env trimerik hücre yüzeyinde eksprese olan spesifik mAbler etkileşimini tespit etmek için optimize edilir. Protokol bir kez kurulduktan sonra, düşük toplam malzeme maliyeti ve antikor küçük miktarda yüksek çıktılar için orta kullanılabilir. Bu deney, transfeksiyon bazlı olduğundan, kolayca Env yapısı üzerindeki etkilerini incelemek için, CD4 gibi hücresel proteinlerin ekspresyonuna için adapte edilebilir.

Ancak, bu protokolün transfeksiyon tabanı da onun en önemli tuzaklar bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz onun cömert A32, 17b, 48d armağan ve C11 mAb'leri için Dr James Robinson teşekkür ederim. PGT 121 NIH AIDS Reaktif Programı, AIDS, NIAID, NIH (Kedi # 12343) Bölümü ile elde edilmiştir. Bu çalışma Scientist AF ve bir CRCHUM süreklilik hibe ile yanı sıra CIHR katalizör hibe # 126630 tarafından # 24639 hibe Young bir FRQS Kuruluş tarafından, CIHR işletim # 257792 tarafından, Yenilik Programı Lider # 29866 için Kanada Vakfı tarafından desteklenen AF ve MR. AF bir FRSQ chercheur Boursier isimli 1 bursu # 24639 alıcı olduğunu. MV CIHR Doktora Araştırma Ödülü # 291485 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HOS hücreleriATCCCRL-1543
Beyaz Opak Doku Kültürü Plakası, 96 oyuklu, Düz TabanlıBD353296
Polietilenimin, doğrusal, 25.000 MWPolysciences239661 mg / ml çözelti içinde hazırlanır
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)İnvitrojen11995
Keçi Anti-insan IgG, Peroksidaz KonjugePierce31413
Gelişmiş Kemilüminesans SubstratıPerkinElmerNEL105001EA
TriStar LB 941, Plaka OkuyucuBerthold Technologies

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bures, R., et al. Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).
  2. Koff, W. C. HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem. Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).
  3. Mascola, J. R., et al. Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1. The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).
  4. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  5. Roederer, M., et al. Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV. Nature. 505, 502-508 (2014).
  6. Fennie, C., Lasky, L. A. Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120. J. Virol. 63, 639-646 (1989).
  7. Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).
  8. Bosch, V., Pawlita, M. Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site. J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).
  9. Hallenberger, S., et al. Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160. Nature. 360, 358-361 (1038).
  10. Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding. Virology. 272, 417-428 (2000).
  11. Leonard, C. K., et al. Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).
  12. Wang, W., et al. A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization. Retrovirology. 10 (14), (2013).
  13. Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein. J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).
  14. Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility. J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).
  15. Chen, L., et al. Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120. Science. 326, 1123-1127 (2009).
  16. Kwong, P. D., et al. HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites. Nature. 420, 678-682 (2002).
  17. Sakai, K., Takiguchi, M. Toward an effective AIDS vaccine development. Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).
  18. Veillette, M., et al. Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).
  19. Wibmer, C. K., et al. Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes. PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).
  20. Kovacs, J. M., et al. HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).
  21. Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker. J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).
  22. Guttman, M., Lee, K. K. A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140. J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).
  23. Ringe, R. P., et al. Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).
  24. Desormeaux, A., et al. The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions. J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).
  25. Haim, H., et al. Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state. PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).
  26. Haim, H., et al. Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity. PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).
  27. Thali, M., et al. Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity. J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).
  28. Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation. J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).
  29. Thali, M., et al. Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding. J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).
  30. Finzi, A., et al. Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions. Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).
  31. Kassa, A., et al. Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain. J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).
  32. Xiang, S. H., et al. Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein. J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).
  33. Mouquet, H., et al. Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).
  34. Julien, J. P., et al. Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans. PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).
  35. Walker, L. M., et al. Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies. Nature. 477, 466-470 (2011).
  36. Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).
  37. Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies. J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).
  38. Bonsignori, M., et al. Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity-Mediating Antibodies from an HIV-1 Vaccine Efficacy Trial Target Multiple Epitopes and Preferentially Use the VH1 Gene Family. J. Virol. 86, 11521-11532 (2012).
  39. Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein. J. Virol. 69, 166-171 (1995).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

HIV 1 Envelope GlycoproteinsConformational ChangesMonoclonal AntibodiesChemiluminescence DetectionSoluble CD4Transfected CellsHorseradish PeroxidaseEpitope ExposureHigh Throughput Screening

İlgili makaleler