Bir Hücre temelli bir ELISA testi kullanarak, HIV-1 zarf trimerik Glikoproteinler konformasyonel Değerlendirilmesi

Trimerik viral zarf glikoproteinleri (env) aracılık ettiği insan bağışıklık eksikliği virüsü tip 1 (HIV-1) girişi, bulaşıcı döngüsünün ilk adımdır. Virionlar yüzeyinde sunulan yalnızca açıkta kalan, viral antijen olarak, Env trimer, nötralize edici antikorlar ve nonneutralizing ortaya çıkarmaktadır. Bu nedenle, bu aşı tasarımının immünojen olarak ilginç bir adaydır temsil eder. Ancak, çözünebilir veya rekombinant formlar Env ile aşılama denemeleri primer HIV-1 ^1-3 izolatlar karşısında sadece minimal etkinliği ile tepkilere yol açtı. Bununla birlikte, kısmi bir imünojen etkinliği bir aday olarak, HIV-1 Env RV144 aşı deneme ⁴ yeniden ilgi görülmektedir. Bu aşı-ortaya, anti-Zarf antikorlar SIV karşı koruma belirli bir ölçüde oluşturmak için yeterli ve HIV ⁵ zorlukları olduğunu açıklayan yeni bir çalışmada doğrulanmıştır.

Endoplazmik retikulum sentezlenen olan, Env glycoprote sonraön, gp160 içindeki, viral füzyon prosesinin yakıt kabiliyeti için kritik olan çeşitli dönüşüm sonrası değişikliğe uğrar. Zarf öncü gp120-gp41 irtibatın muhafaza kovalent olmayan etkileşimlerin ile, ekstra-sitoplazmik gp120'yi transmembran gp41'i alt birimden ^6-10 bölünmüştür önce trimerleri düzgün ve ortak kat gerekir. Enfekte hücre mekanizması, yoğun bir toplam kütlesi ^11,12 yaklaşık% 50 ihtiva eden, Env glikosilasyonunu sorumludur. Daha iyi anlamak için, farklı konformasyonlara önemini vurgulamaktadır, Env uyum sağlamak ve aksi ^15-19 maruz kalacağı kesin olarak oldukça imünojenik epitopların gizlemek için izin vermek için düşünülen bir metastability sağlarken elde edilen kompleks yapısı, Env ^13,14 şekilsel olarak esnek olmasını sağlar yerli Zarf trimer ile örneklenmiş.

Bugüne kadar, çeşitli teknikler geliştirilmiş ve başarıyla Zarf şekilsel ch incelemek için kullanılmıştıranges. Ancak, genellikle belirli Zarf bağlamlarda sınırlı olduğunu, kendi sınırlamaları değişir. Örneğin, yüzey plazmon rezonans veya konformasyonunun, spesifik monoklonal antikorlar kullanılarak immünopresipitasyon (mAb 'ler), ya da trimerik formları ^20,21 ikinci immunogenetically farklı olduğu bilinmektedir monomerik çözünür ya da çözündürülmüş Zarf moleküller dayanmaktadır. Son çalışmalar da bölünme esas antikorlar ^14,22,23 nonneutralizing tarafından tanınan epitoplann maruz kalma sonucunda Zarf konformasyonlar etkilediğini düşündürmektedir.

Burada ayrıntılı olarak hücreli olarak eksprese Zarf trimerler ^18,24-26 konformasyonunun hızlı ve kolay belirlenmesine olanak sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. , Bir insan hücre hattında yapışık Env geçici transfeksiyonu takiben env-özgü antikorların bağlanma basit bir kimya ışıma tepkimesi kullanılarak tespit edilir. Bu teknik, aynı zamanda, aşağıdaki yapısal tercih karakterize etmek için kullanılabilir konformasyon-vingöçük antikorlar yer alır. Bu durumda, bu deney, bir sağlam ve esnek bir tespit etme yöntemi sağlar.

1. Gün 1 - Hücre Kültürü

1. Plaka ^4, 2 x 10 insan osteosarkoma (HOS) ışık yayılması okuma için uygun olan bir opak, 96-iyi hücre kültür plakası içerisinde oyuk başına hücreler. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U / ml penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) kullanınız. 37 ° C,% 5 _CO2 de ertesi güne kadar inkübe edin.

2. Gün 2 - Polietileniminin (PEI) Transfeksivon

1. Sonraki aşamalara göre transfeksiyon karışımı hazırlayın. Aynı Env ile transfekte edilecek kuyu sayısı uygun reaktifler ve DNA miktarını ayarlayın.
2. Tüp A: 25 mM HEPES ile desteklenmiş 5 ul DMEM Env kodlayan plazmid ng 10 ng TAT şifreleyici (örneğin pTat-III ²⁷ gibi) plasmid ve 150 ekleyin.
3. Bu gibi pSVIII Tat-bağımlı env kodlayan plazmidlerin kullanıldığı zaman TAT şifreleyici plasmitin gereklidir.
4. Tüp B: 1 450 ng PEI (ekle5 ul DMEM ug / ml çözelti) eklenmiştir.
5. İyice 10 saniye boyunca girdaplanarak boru C. Mix tüp B içerik ekleyin ve karıştırın transfeksiyon, oda sıcaklığında (22 ° C) 'de 10 dakika inkübe edilir.
6. 96 çukurlu levha başına transfeksiyon karışımı 10 ul. 37 ° C,% 5 _CO2 seviyesinde 48 saat süre ile inkübe edilir.

3. Gün 4 - ELISA

1. Zarf / antikorlar komplekslerinin olası endositoz en aza indirmek için oda sıcaklığında en tüm deneyleri gerçekleştirin.
2. Aynı zamanda kullanılmakta olan, plaka başına Yıkama Tamponu 250 ml hazırlayın. Yıkama Tampon 1x Tris tamponlu tuz (TBS), pH 7.5 (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCI), 1 mM _MgCl2 ve 1.8 mM _CaCl2 ile desteklenen,.
3. % 1 yağsız kuru süt ve Yıkama Tamponu ile 5 mM Tris, pH 8.0 ilave edilerek plaka başına Bloklama Tamponu 125 ml hazırlayın.
4. 96 oyuklu bir plaka elde edilen hücre kültür ortamı ve transfeksiyon karışımı (süpernatant) çıkarın.
5. 100 μ eklemeGözenek başına Bloklama Tamponu ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe l.
6. Süpernatantı ve Bloklama Tamponu içinde uygun konsantrasyona seyreltildi oyuk başına antikor (ya da serum) 50 ul, ekleyin. Tipik olarak, 1 ug / ml 'lik bir konsantrasyonda kullanılır. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
7. 100 ul Engelleme Tampon ve sonra 100 ul Yıkama Tampon ile yıkama işlemi 3 kere tekrarlayın ile 3x yıkayın.
8. , Süpernatantı 100 ul Bloklama Tamponu ilave ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir.
9. Süpernatantı ve Bloklama Tamponu içinde 1/3000 seyreltilmiş sekonder antikor, 50 ul ekle. Üretici farklılıklara göre optimal bir antikor seyreltme Vary. Oda sıcaklığında 40 dakika inkübe edin.
10. 100 ul Engelleme Tampon ve sonra 100 ul Yıkama Tampon ile yıkama işlemi 3 kere tekrarlayın ile 3x yıkayın.

4. Veri Toplama

1. Plaka süpernatantı ve iyi başına 30 ul 1x chemiluminescence (ECL) substrat ekleyin.
2. Kimya Edinme1 saniye iluminescence sinyal / göz ile üretici talimatlarına göre uygun bir plaka okuyucu. Okuma zamanı donanım açısından farklılıklar olabilir.

Yukarıda tarif edilen genel prosedür kullanılarak, yabani tip (wt) veya mutasyon geçirmiş ya da üzerinde Env CD4i epitoplarının maruz kaldığında, çözülebilir CD4 (sCD4) ile birlikte eksprese edilen, hücresel CD4 etkisini analiz etmek için adapte edilmiş bir protokol, 18,24, daha önce tarif edildiği gibi, 25,28. Şekil 1, genel prosedür uygulanarak ve sCD4 veya hücresel CD4 18 birlikte sentezlenmesiyle, tedaviden sonra CD4i epitoplarının maruz kalmasını gösterir Şekil. 18,24, beklendiği gibi, mAb 2G12 tanıyan dış alan bu muamele ile etkilenmez ise Şekil 2'de,, CD4i mAb'ler 17b ve koreseptörünün bağlanma bölgesini üst üste 24,29 48d epitoplarının ortaya Zarf uygun değişikliklere neden sCD4 kullanılır.

Şekil 3'te gösterildiği gibi Zarf konformasyonunda mutasyonun etkisi de Burada. Bu tahlil kullanılarak tayin edilebilir biz ya da azalma olduğu bilinmektedir tabaka 1 Env mutant H66A, eld eğilimi kendiliğinden CD4-bağlı yapısını 18,24,30,31 veya CD4-bağlı duruma 32 Env yatkınlık ve uygun sonuçlar (Şekil 3A) elde edilen bir mutant (S375W) örneklemek. Farklı Env expressors kullanıldığı durumlarda, bu ekspresyon seviyelerine göre, göreceli ışık birimleri (RLU) olarak ifade edilen ham veriyi normalleştirmek için çoğunlukla gereklidir. Bu durumda, normalleştirme antikor (Şekil 3B) gibi, PGT121, Env glıkan kalkan 33-35 bir mAb kabul parçası kullanılır.

Yakın zamanda tarif edildiği gibi 18, aynı hücrede Env ve CD4 etkileşimi CD4i epitoplarının açığa uygun değişikliklere ENV yol açar. Şekil 4 olarak, hücre bazlı bir ELISA tahlilinde Env ile birlikte, bir CD4 ekspresörü artan miktarları ile birlikte transfekte GP12 iç alanında sürekli epitopları tanıyan CD4i mAb A32, C11 ve 18,36-38, artan için sinyaller elde0, yapısal bağımsız 2G12 antikoru ile Zarf tanıma (Şekil 4A) etkilenmedi ise. Koşullar arasında transfeksiyon etkinliği için kontrol etmek amacıyla, ham veriler 2G12 (Şekil 4B) göre normalize edildi. Artan sinyaller için elde edilen A32 ve C11 antikorlar, Env Env 39 ile etkileşim azalma yeteneğine sahip bir CD4 mutant (F43H) ile birlikte transfekte edildi zaman A32 ve C11 modülasyon yokluğu ile gösterildiği gibi env-CD4 etkileşime bağlıdır.

HOS hücreler, hücre yüzeyinde trimerik Zarf ifade etmek üzere transfekte edildiği prosedürün anti-env hücre bazlı bir ELISA (A). Genel şeması Şekil 1 şematik olarak gösterir. Zarf konformasyon daha sonra özel tanıma farklı antikorları kullanılarak örnek olabilir(örneğin mAbs CD4i gibi) yapıları. Sinyaller HRP ile konjüge edilmiş anti-insan mAb'ler ile boyandıktan sonra, kemiluminesans ile tespit edilir. sCD4 (B) veya hücresel CD4 (C) 'nin birlikte ekspresyonu CD4i epitoplarının maruz kalmasına yol Zarf uygun değişikliklere neden olduğu için kullanılabilir.

Şekil 2. sCD4 CD4i epitoplarla sCD4 arasında. Etkileşimi maruziyetine yol Zarf yapısal değişikliklere neden olur, HIV-1-CO JRFL ACt Zarf CD4i epitopların (17b, 48d) hedefleyen antikorlar tarafından tanınma değil, gp120 dış alanı da antikoru tarafından artırır 2G12. , HIV-1 Env CO-JRFLΔCT kodlayan bir plazmid ile transfekte edildi ve daha sonra her bir oyuğa hücreler cont önce, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca varlığında veya 4 ug / ml sCD4 yokluğunda yıkandı ve 48 saat inkübe edildistandart protokol ile inuing (Gün 4 - ELISA). Zarf konformasyon daha sonra oda sıcaklığında 1 saat süre ile 0.25 mg / ml 2G12, 1 ug / ml ya da 17b 48d anti Zarf mAbs ile yapılan kuluçkalama ile problanmıştır. Sinyaller, oda sıcaklığında 45 dakika boyunca bir HRP bağlı anti-insan antikor ile kuluçkadan sonra, kemiluminesans ile tespit edilmiştir. Ilgisiz bir plazmid ile transfekte kuyulardan elde edilen sinyal ile altı çoğaltır ± SD ortalama RLU değerleri gösterilmiştir (hayır Zarf) çıkarılır. Önemi iki yönlü ANOVA ile test veri, üç bağımsız deneyde elde edilen sonuçların temsilcisi (ns, anlamlı değil; ****, p <0.0001).

Zarf konformasyon Şekil 3. modülasyonu. HİV-1 YU2 ACt tabaka 1 Env mutantı (H66A) S375W varyant sergilerler, oysa CD4i 17b tanıma azalırs 17b sinyali artarak tabaka 1 mutant fenotipinin geri yeterlidir. (a) anti-env PGT121 ve 17b, mAb kullanılarak elde edilen sinyallerin RLU değerleri verilmektedir. (B) ya da sCD4, tedaviyi takip eden CD4i mAb 17b PGT121 normalleştirilmiş sinyaller. Ilgisiz bir plasmid ile transfekte edilmiş kuyu elde edilen sinyal ile üç kez ± SD ortalama değerler gösterilmiştir (Resim Zarf) çıkartılır. Önemi iki yönlü ANOVA ile test veri, üç bağımsız deneyde elde edilen sonuçların temsilcisi (**, p <0.01; *** p <0.001; ****, p <0.0001).

Hücresel CD4 Şekil 4 Koekspresyon CD4i antikorları tarafından tanıma özelliğini güçlendirir. Bir CD4 kodlayan plazmid yararlanmak için, HIV1 YU2 ACt Env ile birlikte transfekte edildiCD4 bağlı konformasyon 18. (A), bir anti-env 2G12, A32 ya da C11 mAb ve anti-CD4 mAb OkT4 kullanılarak elde edilen sinyallerin RLU değerleri verilmektedir. (B) 'CD4i mAb A32, C11 ve 2G12 normalleştirilmiş sinyaller. Ilgisiz bir plasmid ile transfekte edilmiş kuyu elde edilen sinyal ile üç kez ± SD ortalama değerler gösterilmiştir (Resim Zarf) çıkartılır. Veriler, üç bağımsız deneyde elde edilen sonuçlar temsil etmektedir. Mavi çubuk artan CD4 miktarında aşamalı bir artışı ifade eder expressor (1.7 ng, 3.5 ng ve 7 ng) transfekte edilmiş ve kırmızı çubuk (F43H CD4 mutant transfeksiyonunu gösterir ise gri çubuk, CD4 yokluğunda gösterir gp120 etkileşim azalma kapasiteli, 7 ng).

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan.