Yöntem makalesi

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/52010

⸱

23 Eylül 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Medical College of Wisconsin, 2Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 3Department of Anesthesiology, Medical College of Wisconsin, 4Stem Cell and Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, Hong Kong University, 5Division of Cardiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Cardiovascular Research Center, Biotechnology and Bioengineering Center, Medical College of Wisconsin

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

, Hasarlı kalp tamir kalp üzerinde toksik etkileri yoktur yeni tedavi ilaçlar keşfetmek ve doğru kalp hastalığı modellemek için stratejiler geliştirmek için yaklaşımlar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. Bu uygulamalar için "bir tabak içinde" kalp kası oluşturmak amacıyla insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisini istismar potansiyeli yüksek coşku oluşturmak için devam ediyor. Son yıllarda, verimli insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) den cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde aksi erişilebilir değil, insan kardiyak gelişiminin çok erken aşamalarında modellemek için bize yeni fırsatlar sunan geliştirdi. Birçok önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü hücresi toplanmasını ya da A ya da aktivin BMP4 eklenmesini gerektirmeyen, burada açıklanan ve güçlü bir kardiyak troponin için yüksek seviyede pozitif olan hücre kültürleri üretir I ve T (TNNI3, TNNT2), iroquois- sınıf Homeodomain proteiniIRX-4 (Irx4), miyozin düzenleyici hafif zincir 2, ventriküler / kalp kası izoformu (MLC2v) ve miyozin düzenleyici hafif zincir 2, tüm insan embriyonik kök hücre (HESC) ve hiPSC hatları üzerinden 10 günde atriyal izoformu (MLC2a) için test tarihi. Hücreler geçirildi ve kültür içinde en fazla 90 gün muhafaza edilebilir. Strateji teknik uygulamak için basit ve maliyet-etkin. Pluripotent hücreler türetilen kardiyomiyositlerin karakterizasyonu genellikle mRNA ve protein seviyesinde, her ikisi de referans işaretlerinin analizini içermektedir. Protein analizi için, akış sitometrisi, kültürdeki hücre kalitesinin ve alt popülasyonu homojenliğinin saptanması için güçlü bir analitik araç olduğunu. Ancak, numune hazırlama teknik varyasyon anlamlı veri akış sitometri kalitesini etkileyebilir. Böylece, boyama protokolleri standardizasyon çeşitli farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırmalar kolaylaştırmalıdır. Bu duruma göre, Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 ve TNN analizi için boyama protokolleri optimizeAkış sitometri T2 açıklanmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HESC ve hiPSC dahil hPSCs, ikinci kardiyomiyositlerde oluşmasından mekanik çalışmalar için başka şekilde erişilemez aşamalarında fikir veren çok erken insan kardiak gelişimsel süreçlerinin bir in vitro model olarak işlev görebilir. Bu model sistem kalp soy bağlılığı ve hücre kaderinin şartname kontrol moleküler yolları incelemek için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. Son yıllarda, etkili hPSCs ikinci cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde 1-15 iyileşmiştir. Bununla birlikte, protokolleri arasında hücreler oda özgü belirteçleri (örneğin, ventrikül ve kulakçıklar) ifade eden hücreler de cardiomyogenic ve zamanlama üreten verimliliğine göre hücre çizgisi farklılıklar vardır. İdeal olarak, bu model sisteminin gelecek uygulamalar için, fonksiyonel olarak tanımlanmış hücrelerin daha homojen popülasyonları arzu edilir. Önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü ce gerektirmez, burada açıklananII toplanmasını ya da sağlam bir aktivin veya Kemik morfogenetik protein 4 (BMP4) ve ekleme gün TNNI3, TNNT2, Irx4, MLC2v ve MLC2a için kültürlerinden pozitif bugüne kadar test edilen bütün HESC ve hiPSC hatları üzerinden 10 hücreleri oluşturur. Bu strateji, özellikle üç boyutlu kültürler, kitle kültürü veya vücut embriyoit bazlı stratejilerin 4-9 ile karşılaştırıldığında, uygulamaya teknik olarak basittir ve son hPSCs seçici toksisite ile küçük bir molekülü tarif etmektedir bir çalışmada (Boheler ve ark tanımlandı. ) 65. Bu protokolün özellikleri, küçük molekülleri kullanarak tam olarak tanımlanmış bir ortam (fakat farklı 1,2,7,13, benzer bir şekilde,), Wnt sinyal modüle etmek üzere bir yetkili HESC matrisi (Matrigel) oluşan tek bir tabaka kullanılarak tek katmanlı kültürü içinde hPSCs farklılaşmasını içermektedir ve farklılaşma verimlilik ve hücre kimliğinin değerlendirilmesi için boyama yöntemleri sitometri optimize edilmiş akış. Önceki raporlar maliyet-etkiliğin dahil Özetle, bu protokolün avantajları karşılaştırıldıeness, tekrarlanabilirlik ve HESC ve hiPSC hatları dahil olmak üzere birden hPSC hatları arasında yer kardiyomiyositlerin üretmek için yüksek verimlilik.

Flow sitometri kültür hücrelerin kalitesini değerlendirmek ve subpopülasyonu homojenlik belirlenmesi için güçlü bir analitik araçtır, ve uygun deneysel tasarım, kantitatif ölçümler sağlayabilir. Tüm antikor bazlı stratejiler gibi, deneysel sonuçların doğru yorumlanması alt-optimal koşulları belirgin antikor verimini etkileyen gibi antikor konsantrasyonunun ve tespit ve permeabilizasyon koşulları (hücre içi antijenler hedefleme dahil) tahlil tasarım unsurları dikkatle her antikor için test gerektirir , sonuçların yorumlanması bağlanması ve bu nedenle. Niceleme gerekli ise, poliklonal antikorlar, çok epitopu tanıyan ve partiden partiye değişkenlik eğilimli gibi Önemli olarak, monoklonal antikorlar, gereklidir. Şu anda, çeşitli antikorlar, (POlyclonal ve monoklonal) ve boyama protokolleri zor protokoller arasında 1,2,9,11 cardiomyogenesis verimliliğini karşılaştırmak çok in vitro farklılaşma değerlendirilmesi için tarif edilmiştir. Tüm akış sitometresi analizleri için kullanılabilir Bu nedenle monoklonal antikorlar kullanılır. İleriye, daha iyi farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırma izin vermelidir, özellikle kantitatif getirmedi, bu boyama protokollerin standartlaştırılması bekleniyor.

In vitro olarak cardiomyogenesis saflığını değerlendirmek için kullanılan belirteçler seçimi ve bunlara karşılık gelen antikorlar, raporlar arasında değişir. TNNT2 cardiomyogenic kaderine işlenen hücrelerin bir göstergesi olarak kabul edilmiş ve rutin olarak kalp farklılaşma protokolleri etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Bununla birlikte, aynı zamanda, erken TNNT2 piliç ve sıçan gelişim 16,17 sırasında iskelet kası olarak ifade edilir ve insan düz kas 18 içinde mevcut olmaktadır . Böylece, TNNT2 zorunlu in vitro olarak insan cardiomyogenesis özel bir molekül değildir. MLC2v ve MLC2a rutin olarak, sırasıyla, ventriküler ve atriyal alt tiplerinin temsili gösterge olarak kullanılır. Bununla birlikte in vitro farklılaşma bağlamında kardiyomiyosit alt-tipini belirlemek ve MLC2v MLC2a güvenerek zorluklar bu gen ürünleri, yetişkin yoluyla kalp tüp, kalp gelişimi boyunca belirli bir bölmeye sınırlı olmayabilir gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Kemirgen kalp döngüye yılında MLC2a mRNA atriyal / içeakımın alanda baskın ve MLC2v mRNA ventrikül / çıkış yolu bölgelerde yaygındır. Ilmekli kalbinde, MLC2a ve MLC2v mRNA'larının birlikte ifadesi giriş yolu, atriyoventriküler kanal ve çıkış yoluna 19,20 görülmektedir. Doğumdan sonra 3 gün boyunca, MLC2v mRNA ventriküle sınırlıdır ve doğumdan sonra 10 gün, MLC2a neonatal sıçan kalbinde kulakçıklar 19 ile sınırlandırılmıştır. Bu nedenle, yorumlamacardiomyogenesis etkinlik ve alt-tipi kimlik sadece referans markeri seviyelerinin varlığını ve miktarını dikkate gerekir, ancak incelendiğinde farklılaşma edilen zaman noktalarından karşılık gelişimsel aşama (lar) dikkate almalıdır ilişkin verilerin. Bu hPSCs in vitro farklılaşma tarafından üretilen cardiomyogenic hücrelerin olgunlaşma aşaması en yakın, embriyonik / fetal gelişim 21-25 benzer olanlar göz önüne alındığında özellikle önemlidir. Bu nedenle, doğum sonrası kalp bir işaretin mekansal ifade dayanarak, en azından bazı durumlarda hPSC türetilen hücrelerin değerlendirilmesi için uygun olmayabilir.

In vitro kardiyomyosit kimliklerini tanımlamak için daha spesifik kriterler geliştirilmesini kolaylaştırmak için bir çaba, TNNI3 o civciv ve Zebra balığı 15,20 embriyogenezis boyunca kalp kasının sınırlı olarak in vitro cardiomyogenesis değerlendirmek için değerli bir belirteç olarak kabul edilirve insan fetusu iskelet kası 26 yoktur. TNNI1 insan cenin kalbi mevcut iken, TNNI3 normal yetişkin kalp 27,28 tek TNNI izoformu mevcuttur. Kardiyomyosit alt tip kimliğine ilişkin, Irx4 29-31 ventriküler kaderi ile hücrelerin bilgilendirici bir belirtecidir. Protein düzeyinde, Irx4 son fare 32, neonatal aşamalardan doğrusal kalp tüpten ventriküle sınırlı olduğu gösterilmiştir. Bu duruma göre, akış sitometrisi ile analiz TNNI3 ve Irx4 için optimize boyama protokolleri açıklanmıştır. Bildiğimiz kadarıyla, bu akış sitometrisi ile etkin bir biçimde antikor bazlı boyama ve insan kardiyomiyositlerde Irx4 seviyesini ölçmek için bir yöntem, ilk tanımlamasıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Çözüm ve Medya Hazırlık

  1. HESC Nitelikli Matrix Kaplama Stok Çözüm
    1. Yavaşça bir gece boyunca 4 ° C'de HESC buz üzerinde nitelikli matrisi (5 mi) eritin. 1.5 ml steril, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpler içine hacimde dağıtın ve hemen -20 ° C'de saklayın.
      Not: tüm bölenin hacmi çok dayanmaktadır ve tipik haliyle 270-350 ul aralığında değişir. İmalatçı Adım 2.1 'de tarif edildiği gibi 25 ml seyrelmesi üzerine 1x konsantrasyon elde etmek için gerekli olan tüm bölenin hacmi ile ilgili bilgi sağlar.
  2. hPSC Medya Hazır Çözümler
    1. Aksi belirtilmedikçe, bir seyreltici olarak ultra saf su kullanın. 0.22 mikron filtre kullanılarak tüm bileşenleri sterilize. 4 ° C'de toplu çözeltiler gibi, aşağıdaki muhafaza edin: sodyum bikarbonat (75 mg / ml); sitrik asit (10 mM, pH = 3).
    2. 0.2 mikron şırınga filtre kullanarak tüm bileşenleri sterilize ve -20 ° C'de hacimde olarak her saklamak: Rho kinaz (ROCK) inhibitörü Y-27632 (10DPBS mM, 100 ul tümbölen); L-askorbik asit 2-fosfat (64 mg / ml 500 ul tümbölen); sodyum selenit (70 ug / ml, 100 ul tümbölen); transferin (50 mg / ml 107 ul tümbölen); fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2 200 ng / DPBS ul, 250 ul tümbölen); büyüme faktörü beta 1 transforme (soğuk 10 mM sitrik asit içinde TGFβ1, 100 ng / ml, 10 ul tümbölen).
  3. hPSC Medya E8 Çözüm Kompozisyon
    1. , L-askorbik asit 2-fosfat (500 ul; nihai; (: 500 ml L-glutamin ve HEPES), sodyum bikarbonat (543 mg / ml 3.62 ml nihai), DMEM / F12: Aşama 1.2 'de elde alikot ile ortam hazırlayın : 64 ug / ml), sodyum selenit (100 ul, nihai 140 ng / ml), transferin (107 ul; nihai: 10.7 ug / ml), insülin (1 mi; son 20 ug / ml), FGF2 (250 ul, nihai 100 ng / ml), TGFβ1 (10 ul, nihai: 2 ng / ml).
    2. Kadar 2 hafta boyunca 4 ° C'de tüm bileşenleri, filtre sterilize ve mağaza birleştirin.
  4. KAYA inhibitörü ile hPSC Ortam E8
    1. Yukarıda anlatıldığı gibi hazırlanmış E8 ortam, 12 ml, 15 ul ROCK inhibitörü ekleyin ve iyice karıştırın. Nihai konsantrasyon adım 3.7 / ortam hücreleri ilave edildikten sonra 10 uM olduğundan emin olun.
  5. Wnt Modülatörlü stok Çözümleri
    1. -20 ° C'de aşağıdaki alikotları saklayın. CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5​-methyl-1 H -imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethy​l]amino]-3-pyridinecarbonitrile; DMSO içinde 10 mM, 15 ul tümbölen). IWR-1 (4-(1,3,3a, 4,7,7a-Heksahidro-1,3-diokso-4,7-metano-2H-izoindol-2-il)-N-8-kinolinil-benzamid; DMSO içinde 10 mM 6 ul tümbölen).
  6. Farklılaşma Medya
    1. % 2 B27 eksi insülin takviyesi ile (L-glutamin ile) RPMI 1640 farklılaşma medya # 1 hazırlayın.
    2. % 2 B27 artı insülin takviyesi ve% 2 FBS ile (L-glutamin ile) RPMI 1640 ortamı ile farklılaşma 2. hazırlayın.
  7. Hücre Yıkama Çözeltisi fveya Hücre Kültürü
    1. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) içinde kullanın.
  8. Akış Sitometrinin Hücre Yıkama Çözeltisi
    1. % 1 FBS (kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS) fosfat tamponlu tuzlu su kullanın. 4 ° C'de saklayın.
  9. Akış Sitometrinin Hücre Bakım Çözüm
    1. % 5 FBS (kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS) Hank Dengeli Tuz Çözeltisi kullanın. 4 ° C'de saklayın.
  10. Akış Sitometrinin için tespit Çözümler
    1. TNNI3 ve Irx4 antikorlar için sabitleme çözeltisi olarak Cytofix tampon kullanabilir.
    2. TNNT2 ve MLC2a antikorlar için sabitleme çözeltisi olarak 1 x PBS içinde% 4 paraformaldehid (taze olun) kullanınız.
    3. MLC2v antikor için sabitleme çözeltisi olarak% 70 metanol /% 30 aseton kullanılabilir.
    4. 4 ° C'de tüm çözümleri saklayın.
  11. Akış Sitometrinin için Permeabilizasyon Çözümler
    1. Geçirgenleştirme çözeltisi f olarak Phosflow Perm Tampon KULLANILMASIveya TNNI3 ve Irx4 antikorlar yer alır. Oda sıcaklığında (25 ° C) saklayınız.
    2. TNNT2, MLC2v ve MLC2a antikorlar için özellikle geçirgenleştirme çözeltisi olarak 1 x PBS içinde% 0.2 Triton X-100 kullanarak. 4 ° C'de saklayın.
  12. Bloklama çözeltisini
    1. 1x PBS içinde% 10 keçi serumu kullanın. Taze yapmak ve kullanılıncaya kadar 4 ° C'de saklayın.

2. Plakası Kaplama

  1. Yavaşça, 30 dakika boyunca 4 ° C'de HESC kalifiye matris 1 kısım Çözülme soğutulmuş DMEM / F12, 25 ml eklenir ve hemen 6 oyuklu tabaklar önce steril doku kültürü kaputu iyice karıştırın.
  2. Steril doku kültürü başlık altında 6-çukurlu levha başına 1 ml ilave edilir (HESC kalifiye matrisin 1 kısım kat dört 6-yuvalı plakalar için yeterlidir).
  3. HESC kalifiye matris başlık altında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ayarlamak için olanak sağlar. Aşırı HESC nitelikli matrisi aspire ve her iyi ROCK inhibitörü ile E8 medyanın 2 ml ekleyin. Kullanım plakaları hemen varsa veya desIRED, 4 ° C'de saklama hemen sonra en fazla 1 hafta kaplama ve kullanılmadan önce 30 dakika süre ile oda sıcaklığına kadar dengeye C.

3. Pasajlanması ve Tek tabakalı Kültür ayrım hPSCs Bakım

  1. 6-yuvalı plakalar içinde tek tabakalı bir kültür olarak muhafaza hPSCs ve steril doku kültürü başlık altında tüm adımları gerçekleştirmek.
  2. HPSC iyi kurulmuş hatları (> p20) kullanın ve bir sinir, epithelial- veya fibroblast-benzeri morfolojisi olan hücrelerin varlığı olmadan homojen bir morfoloji. Kuyu başına 0,75 x 10 6 tohumlandıklarında hücreleri% 75 izdiham her üç gün sağlam çoğalırlar ve ortalama, geçit üzerinde emin olun.
  3. Tek hücre düzeyinde ayrışma ile Passage hPSCs en az 5x önce maksimum farklılaşma verimliliği sağlamak için farklılaşma başlatın. Geçit hPSCs için, aspirat E8 ortam ve 1x DPBS (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış) 4 ml ile iki kez yıkama hücreleri. Hücre kopmakta 1 ml ekleyinment her bir oyuğa çözeltisi (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış) ve hücre sınırları boyunca-up başlayana kadar, 3-7 dakika için de rahatsız bırakın.
  4. Hücreleri çıkarmak ve DMEM / F12 ortam 1 ml içeren 15 ml'lik konik bir tüp içine transfer etmek için bir ampul ile pamuk takılı cam pipet kullanın (ki bu hücre ayırma çözeltisi inaktive etmek için).
  5. Hücre çözeltisi, 10 ul bir kısım çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüpü içinde, tripan mavisi 10 ul ile karıştırılır. Hücrelerin geri kalanı, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 130 x g'de santrifüj ile toplanır sırasında hücreler (örneğin, otomatik ya da elle hemositometre) sayılır. Bu protokolü kullanarak,% 70-80 canlılığı otomatik Hemasitometre kullanarak ve toplam hücre sayımı baz tüm cep numaraları, ileriye bekliyoruz.
  6. Ortam aspire 500 ul, 0.75 x 10 6 hücre nihai bir konsantrasyona kadar DMEM / F12 hücre pelletini ve.
  7. 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, hücre süspansiyonu 500 ul her bir göze burada contaiROCK inhibitörü ile ns 2 ml E8 medya, adım 2.3 hazırladı. Tezgahı üzerinde plaka bırakarak, yavaşça arasında genel bir önden arkaya ve yandan yana bir hareket homojen bir şekilde dağılmalıdır hücre hareket eder. % 5 CO 2, 37 ° C'ye kadar inkübatör hücreleri dönün.
  8. Pasajlayarak 24 saat sonra başlayan, günlük ROCK inhibitörü olmadan 2 ml / da E8 kullanarak ortamı değiştirin. Farklılaşma başlatmak için önce% 100 izdiham ulaşmak için ekim yoğunluğunu optimize eder. 0.75 x 10 6 hücre Tohum / de dört gün farklılaşma başlar, ama gerektiğinde her hücre hattı için optimize önce.

Wnt yola¤ Seçici Modülasyon tarafından hPSCs 4. kardiyomiyosit İndüksiyon

  1. Gün 0-7 süresince günlük (2 ml / da) medya Refresh, ve 8. günde sonra her gün.
  2. Gün 0, farklılaşma medya # 1 ile E8 medya değiştirerek farklılaşma süreci başlar. Her iyi 1.2 ul CHIR (6 mcM final) ekleyin. 1. günde tekrarlayın.
  3. Günlerde 2-3, taze ayırıcı ile değiştirinbarındırdığı medya # 1.
  4. 4. günde, taze farklılaşma medya # 1 ile değiştirin. Her bir oyuğa, 1 ul IWR-1 (nihai 5 uM) eklenir. Günde 5 tekrarlayın.
  5. Günlerde 6-7, taze farklılaşma medya # 1 ile değiştirin.
  6. 8. günde, taze ortam farklılaşma # 2 ile değiştirin.
  7. Farklılaşma medya # 2 kültürünün arzu edilen süre boyunca her gün değiştirin devam edin.
  8. İstenirse, 3,3-3,6 özetlenen adımları izleyerek, ama farklılaşma medya # 2 ile medyayı ikame hücre dekolmanı çözüm kullanarak geçit kardiyomiyositler. Pasajlayarak sırasında, ~ 3-10 hücrelerin küçük kümeler halinde kardiyomiyositlerin ayırmak. Iyi kullanarak HESC nitelikli matris kaplı çukurlara ve farklılaşma medya # 2 başına ~ 6 x 10 5 hücre Tohum.

Akış Sitometrinin için Hücrelerin 5. Koleksiyonu

  1. Laboratuar tezgahının (steril değildir) 5-9 adımları kalan tüm yönlerini gerçekleştirir.
  2. Aspire büyüme ortamı ve 1x PBS ile iki kez hücreleri yıkayın.Hücre sınırları boyunca-up başlayana kadar (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış), her bir hücre ayırma çözeltisi 1 ml de ilave edin ve 3-7 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Hücreleri çıkarmak ve buz üzerinde bir 15 ml konik tüp içine aktarmak için ampul ile bir pamuk takılı borosilikat cam atılabilir 9 "pipet kullanın.
  3. Protokol kalanı boyunca buz üzerinde hücreleri korumak ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de santrüfüj yapar.
  4. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Hücre kümeleri sağlamak için tekrar tekrar toz haline getirilir ve 10 ml'lik bir pipet kullanılarak serolojik 10 ml hücre yıkama çözeltisi içinde süspanse hücreler tek hücreler içine dağıtılır. Hücreler santrifüjleme ile toplanmış geri kalan ise adım 3.5 olarak hücre sayımı.
  5. Hücre yıkama çözeltisi özen göstererek yeniden süspanse hücreler tamamen hücre pelet ve kısım yuvarlak dipli tüp başına 1 x 10 6 hücre parçalamak için. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır.

6. Tespit veHücre içi antijen boyanması için Hücrelerin geçirgenliği

  1. Hücre pelletine 100 ul sabitleme çözeltisi ekleyin. Çözeltisi damla damla sürekli Yumuşak bir girdaplamadan ile ve daha sonra 15 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir ekleyin.
  2. 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır.
  3. Hücre pelletine 100 ul permeabilizasyon solüsyonu ekleyin. Çözeltisi damla damla, daha sonra 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir sürekli Yumuşak bir girdaplamadan ile ekleyin. Tablo 1 'de her bir antikor için belirtildiği gibi tespit ve geçirgenliği arttıran koşullar kullanın.
  4. 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Geçirgenleştirmeden sonra iki yıkama arasında bir toplam için tekrarlayın.
Birincil antikoru (klon) İmmunogen / Epitop Tanınan Kontrol Istotype 100 ul içinde 1 x 10 6 hücre başına birincil antikor miktarı Sabitleme Çözüm Geçirgenliği arttıran çözeltiyi İkincil antikor 100 ul ikincil antikor miktarı / 1 x 10 6 hücre
Pozitif yüzde ölçümleri için Antijen kantitasyonu için
TNNI3 (284 (19C7) ISASRKLQL (insan) Fare IgG2b 1,0 mikrogram 3.0 ug BD Cytofix BD Phosflow perma III Keçi anti-fare IgG2b-Alexa488 600 ng
TNNT2 (1C11) Tam boy saflaştırılmış doğal insan troponin T proteini. Fare IgG1 1,0 mikrogram 2.0 ug % 4 PFA% 1 PBS % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 Keçi anti-fare IgG1 - Alexa 488 600 ng
MLC2v (330G5) FDPEGKG Fare IgG2a 2.0 ug 3.0 ug % 70 metanol /% 30 aseton % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 Keçi anti-fare IgG2a - Alexa 647 600 ng
MLC2a (4E7) E. üretilmiş, insana ait MYL7 tam uzunlukta insan yeniden birleştirici proteinin coli Fare IgG1 0.5 ug 3.0 ug % 1 PBS içinde% 4 PFA % 1 PBS içinde% 0.2 Triton X-100 Keçi anti-fare IgG1 - Alexa 488 600 ng
Irx4 LQEHRKNP
YPTKGEKI
MLAIITKM
TLTQVST 		Tavşan IgG 0.5 ug 0.5 ug BD Cytofix BD Phosflow perma III Keçi anti-raIgG PE BBIT 600 ng

Her birincil ve ikincil antikor için optimize konsantrasyonları ve fiksasyon ve permeabilizasyon koşulları akışı için kullanılan (monoklonal varsa) Table 1. Antikor konsantrasyonlar. Listelenen birincil antikor olan, klon sitometri analizleri. Antikor stok konsantrasyonları aynı klonun sağlayıcıları arasında değişebilir olarak, son sabit bir tahlil hacmi içinde 1 x 10 6 hücre başına her antikor konsantrasyonu, seyreltme yerine sağlanmıştır. İmmünojen, antikorun üretilmesi için kullanılan, ya da imalatçı tarafından temin edildiği gibi epitop, antikor tarafından tanınan, listede ancak deneysel burada doğrulanmadı.

7. Antikor Boyama

  1. Her deney için, bir sabitleme / permeabilizasyon durumuna göre kontrol ve boyanmamış kullanılan her bir primer antikor için uygun izotip kontrolü içerir. (Negatif kontroller gibi non-kardiyomyosit hücre türlerini içerirörneğin, pluripotent kök hücreleri ya da fibroblastları). Primer antikor tekabül eden aynı konsantrasyonda izotip kontrolleri kullanarak (Tablo 1 e bakınız).
  2. Hücreleri parçalamak için P200 pipet kullanarak çözümü engelleme 100 ul süspanse hücreler. Hafif sallama ile 25 dakika boyunca buz üzerinde bekletilir örnekleri.
  3. Engelleme çözümü çıkarmadan,. Birincil antikor veya Tablo 1'de kurallarımıza göre izotop kontrolü eklemek hafif hafif sallanarak buz üzerinde 45 dakika inkübe edin.
  4. 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. Primer Antikor etiketleme işleminden sonra, iki yıkama toplam tekrarlayın.
  5. Bir florofor ile konjüge edilmiş birincil antikor kullanıldığında, 8.1 'e geçin. Bir konjüge edilmemiş birincil antikor (örneğin, burada tarif edilen tüm belirteçleri için olduğu gibi) kullanıldığında, aşağıdaki gibi bir florofor konjuge edilmiş ikincil antikor ile etiketlenmesi.
  6. DISA bir P200 pipet kullanarak çözümü engelleme 100 ul süspanse hücrelerggregate hücreleri.
  7. . Tablo 1'de ilkelerine uygun olarak, ikincil antikor ekleyin hafif sallama ile buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
  8. 3 ml hücre yıkama solüsyonu ekleyin. Santrifüj ve aspirasyon çözeltisi hücreler toplanır. İkincil antikor etiketleme sonra iki yıkama arasında bir toplam için tekrarlayın.

Akış Sitometrinin için Hücrelerin 8. hazırlanması

  1. Hücreleri parçalamak için P1000 pipet kullanarak 400 ul hücre bakım çözeltisi içinde süspanse hücreler.
  2. 50 ul hücre bakım çözeltisi ile ön-ıslatma ile bir yuvarlak tabanlı tüp üzerindeki bir hücre süzgecinden kapağı hazırlayın. Buz üzerinde tüp ayarlayın. Sitometresi akışını tıkamasını hücre agrega önlemek için hücre süzgecinden kapağı kullanın.
  3. Süzgeç kapağı hücre ve hücre süspansiyon yerçekimi boşalmasını sağlamak için hücre çözümü aktarın. Hücreler tüp içine toplandı ve mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tekrar buz üzerinde bekletilir, böylece gerekli tezgah üstüne hafifçe tüpün alt dokunun. 250 ul hücre bakım böylece ile durulayın süzgeçdökülmesinden hücrelerinin maksimal iyileşme sağlamak için.
  4. Hücreleri buz üzerinde muhafaza etmek ve akış sitometrisi ile analiz edilene kadar ışıktan koruyunuz.

9. Sitometrisi Analizi

Ayrıntılı kazanım ayarlarını araçların arasında değişmektedir. Optimal veri toplama dikkate temel parametreler aşağıda açıklanmıştır.

  1. Optimal akışı istikrar için, meme boyutu, hücrenin çapı analiz edilen 5-6x aşmasını sağlamak.
    NOT: Bu aletler arasında değişir ama analizörleri ve hücre sıralama için uygun meme boyutunu seçerek hem önemli bir husustur olabilir. Gün 10 kardiyomiyositlerin ortalama çapı (8-14 mikron arasında değişen) 11 mikron olduğu; Bu şekilde, bir analiz standart bir 150 um numune enjeksiyon borusu iyi çalışır.
  2. Hemen önce veri analizi için, kısa bir süre için her bir tüp vorteks hücre agregatlarının dağıtılması.
  3. Ileri Optimize ve her hücre tipi için yan dağılım gerilim ayarları dayalıilgilenilen popülasyonları ölçektedir ve (Şekil 2A) merkez şekilde Deneyde kullanılan her bir sabitleme / permeabilizasyon durumu için boyanmadan kontrolü.
    1. Anlamlı kaymalar sitometresiyle akış veya numune hazırlama ile olası sorunlara işaret edebilir gibi, tek bir deney boyunca bu ayarları korumak ve aynı cihaz üzerinde deney yapmak deneyden tutarlı olması.
  4. Her fluorofor için izotip kontrolü analiz etmek ve tepe sol ve sağ kenarları görüntüleyen bir fluoresans histogramının elde etmek için gerekli en düşük yoğunluğunu belirlemek için uygun bir lazer gerilimini ayarlamak. Antikor lekeli örnekleri gelen verileri satın alırken her bir izotop kontrol için lazer ayarları koruyun.
    NOT: Sinyal sık sık kayması aynı cihazda zamanla oluşur. Bu uygun bir izotip kontrolü ile ilgili olarak, her bir deneyin başlangıcında lazer ayarları için çok önemlidir.
  5. En az toplayın10.000 olaylar. 50.000 olaylar tercih edilir.
  6. İstatistiksel analizler için, kapı canlı hücre popülasyonu enkaz (Şekil 2A) dışlamak için. Şekil 2B'de, C'de gösterildiği gibi, ikinci bir izotip kontrolü ≤2% katkı sağlar işaretleyici yerleşimine göre kapı nüfus içinde yüzde pozitif hücrelerin belirlenmesi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

0. günde, hücreler, kompakt morfolojisi ve hücre döküntüleri en az% 100 birleşik bulunmaktadır. Günlerde 1-2, anlamlı hücre ölümünü (% 40-50) gözlemlemek için ortak, ancak ekli hücreleri kompakt morfoloji (Şekil 1A) muhafaza edecektir. Bu süre boyunca, medya portakal ve bulanıktır. Pembe ortam aşırı hücre ölümünü göstermektedir ve bu durumda, tripan mavisi ile teyit Hücre ölümü ve% 70 aşarsa bırakmaktadır. Hücreler gün 3-4 esnasında kurtarmak ve yoğunluk artacak. 5-6 gün boyunca, en az sayıda hücre ölüm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklılaşma protokolün başarısına için kritik farklılaşma başlamadan önce en az beş geçişler için tek hücre düzeyinde pasajlanmışlardır edilmiştir hPSCs kaliteli kültürlerinin kullanılmasıdır. Bunlar hücre hattı bağımsız farklılaşma başlangıcında% 100 konfluent, eğer benzer farklılaşma verimleri bilinen muhtelif hPSC hatlar arasında görülmektedir. Farklılaşma başlangıcında hücre kaynaşması ≤95 veya%>% 100 ise, optimumun altında verimliliği görülmektedir. Bu yüzden, tohum yoğunluğu ve pasaj zamanlaması farklılaşma baş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma NIH 4R00HL094708-03 tarafından desteklenen, AİG'nin Araştırma İşler Komitesi Yeni Fakülte Ödülü, ve Wisconsin Medical College (RLG) de Kern vakıf (başlangıç ​​fonları); Hong Kong Tema tabanlı Araştırma Şema T13-706 / 11 (KRB) Araştırma Hibeler Konseyi; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, ve AHA Araştırmacı Ödülü (JCW) Kuruldu; AHA Doktora Sonrası Araştırma Bursu 12POST12050254 (PWB). Biz veri toplama ve yazının dikkatli inceleme ile yardım için Wisconsin Kan Araştırma Enstitüsü Sitometrisi Çekirdeği Umut Campbell teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cell Culture
BD Matrigel, hESC nitelikli matrisBD Biosciences354277
Accutase hücre dekolmanı çözümüKök Hücre Teknolojileri7920
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS), kalsiyum yok, magnezyum yokYaşam Teknolojileri14190-136
Dimetil sülfoksit (DMSO, Hybri-Max, steril filtreli)Sigma AldrichD2650
Sodyum bikarbonatSigma Aldrich53817
Sitrik asitSigma AldrichC2404-100G
Y-27632 dihidroklorür seçici p160ROCK inhibitörüR& D Systems1254
L-Askorbik asit-2-fosfat seskimagnezyum tuzu hidratSigma AldrichA8960-5G
Sodyum selenitSigma AldrichS5261-10G
Transferrin (Optiferrin – Tanımlı, Hayvansız, Rekombinant İnsan)Invitria777TRF029
Fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2)R& D Systems4144-TC-01M
Dönüştürücü büyüme faktörü beta 1 (TGF ve beta; 1)Peprotech100-21
DMEM/F12, L-Glutamin ve 15 mM HEPESYaşam Teknolojileriile 11330-032
İnsülinSigma AldrichI9278-5ML
CHIR-99021 HClSellekchemS2924
IWR-1Sigma AldrichI0161
RPMI 1640, L-GlutaminYaşam Teknolojileriile 11875-093
B-27 Takviyesi Eksi İnsülinYaşam TeknolojileriA1895601
B-27 Takviyesi (İnsülinli)Yaşam Teknolojileri17504-044
Fetal sığır serumuYaşam Teknolojileri10437
Akış Sitometrisi Reaktifleri
Fosfat tamponlu salin (10x)Quality Biological Inc.119-069-151
Hank'in Ca2+ ve Mg2+Life Technologies içermeyen dengeli tuz çözeltisi14175-095
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Fosflow perma tamponu IIIBD Biosciences558050
%16 ParaformaldehitThermo Scientific28906
MetanolSigma Aldrich179957-4L
AsetonMallenckrodt Kimyasalları 2440-16
Triton X-100AmrescoM236-10ML
Keçi serumuYaşam Teknolojileri16210-064
Tripan mavisi çözeltisi, %0.4YaşamTeknolojileri15250-061
Materials
>5 ml Yuvarlak tabanlı polistiren tüp (kapaksız)Corning352008Hazırlanması için akış sitometrisi için hücreler
5 ml Yuvarlak tabanlı polistiren tüp (35 & M hücre süzgeci geçmeli kapak)Corning352235Akış sitometrisi için hücrelerin hazırlanması için
2 ml kauçuk ampullerFischer Scientific03-448-24
9" borosilikat fişe takılmamış cam Pasteur pipetleriBioExpressP-2904-2
0,65 ml Mikrosantrifüj tüpleri, dereceli, yeşilGeneMateC-3259-G
1,5 ml Mikrosantrifüj tüpleri, dereceli, kırmızıGeneMateC-3260-R
TC20 otomatik hücre sayacıBioRad145-0102
TC20 için sayma slaytlarıBioRad145-0011
6 kuyulu Düz tabanlı doku kültürü ile muamele edilmiş plakaCorning353046
20 ml ŞırıngalarBD Plastipak300613Alikotların
filtre sterilizasyonu içinSteril şırınga filtreleri, 0.2 & m polietersülfonVWR28145-501Alikotların filtre sterilizasyonu için
250 ml Filtre sistemi, 0.22 &mikro; m polietersülfon, sterilizasyon, düşük bağlayıcıCorning431096Dökme ortamların filtre sterilizasyonu için 
500 ml filtre sistemi, 0.22 & m polietersülfon, sterilizasyon, düşük bağlayıcıDökme ortamın
Antikorlar ve İzotip Kontrolleri
Anti-TNNI3 (klon: 284 (19C7))Abcamab19615Primer antikor
Anti-TNNT2 (klon: 1C11)Thermo ScientificMA1-16687Primer antikor
Anti-MYL2 (MLC2v, klon: 330G5)Sinaptik Sistemler310111Primer antikor
Anti-MYL7 (MLC2a, klon: 4E7)AbcamAB131661Primer antikor
Anti-IRX4   BiossBS-9464RBirincil antikor
Alexa Fluor 488 Keçi anti-fare IgG1 Yaşam TeknolojileriA21121İkincil antikor
Alexa Fluor 647 Keçi anti-fare IgG2aYaşam TeknolojileriA21241İkincil antikor
Alexa Fluor 488 Keçi anti-fare IgG2bYaşam TeknolojileriA21141İkincil antikor
Fikoeritrin (PE) Keçi anti-tavşan IgG R& D SistemleriF0110İkincil antikor
Fare IgG1BD Biosciences557273İzotip Kontrol
Faresi IgG2aeBiosciences16-4724-81İzotip
Kontrolü Tavşan IgG-PER& D SystemsIC105Pİzotip Kontrolü
< >ACTB Yaşam Teknolojileri için TaqMan Probları
Hs01060665
Brachyury TYaşam TeknolojileriHs00610080
CASQ2Yaşam TeknolojileriHs00154286
IRX4Yaşam TeknolojileriHs01100809
ISL1Yaşam TeknolojileriHs00158126
MESP1Yaşam TeknolojileriHs01001283
MYH11 (SMMHC)Yaşam TeknolojileriHs00224610
MYH6Yaşam TeknolojileriHs01101425
MYL2 (MLC2v)Yaşam TeknolojileriHs00166405
MYL7 (MLC2a)Yaşam TeknolojileriHS01085598
MYOGYaşam TeknolojileriHS01072232
NKX2.5Yaşam TeknolojileriHS00231763
NPPAYaşam TeknolojileriHS01081097
POU5F1Yaşam TeknolojileriHS04260367
SOX17YaşamTeknolojileri HS00751752
TNNI1Yaşam TeknolojileriHS00913333
TNNI2Yaşam TeknolojileriHS00268536
TNNI3Yaşam TeknolojileriHS00165957
TNNT2Yaşam TeknolojileriHS00165960
filtre sterilizasyonu için Corning 431097

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
  2. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8, 162-175 (2013).
  3. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  4. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293(2011).
  5. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  6. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8, 228-240 (2011).
  7. Willems, E., et al. Small-molecule inhibitors of the Wnt pathway potently promote cardiomyocytes from human embryonic stem cell-derived mesoderm. Circ Res. 109, 360-364 (2011).
  8. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  9. Elliott, D. A., et al. NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes. Nat Methods. 8, 1037-1040 (2011).
  10. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  11. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Res. 21, 579-587 (2011).
  12. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, e23657(2011).
  13. Hudson, J., Titmarsh, D., Hidalgo, A., Wolvetang, E., Cooper-White, J. Primitive Cardiac Cells from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells Dev. 21, 1513-1523 (2011).
  14. Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circ Res. 111, 1125-1136 (2012).
  15. Ban, K., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons that target cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128, 1897-1909 (2013).
  16. Toyota, N., Shimada, Y. Differentiation of troponin in cardiac and skeletal muscles in chicken embryos as studied by immunofluorescence microscopy. J Cell Biol. 91, 497-504 (1981).
  17. Saggin, L., Gorza, L., Ausoni, S., Schiaffino, S. Cardiac troponin T in developing, regenerating and denervated rat skeletal muscle. Development. 110, 547-554 (1990).
  18. Kajioka, S., et al. Endogenous cardiac troponin T modulates Ca(2+)-mediated smooth muscle contraction. Sci Rep. 2, 979(2012).
  19. Franco, D., et al. Myosin light chain 2a and 2v identifies the embryonic outflow tract myocardium in the developing rodent heart. Anat Rec. 254, 135-146 (1999).
  20. Franco, D., Lamers, W. H., Moorman, A. F. Patterns of expression in the developing myocardium: towards a morphologically integrated transcriptional model. Cardiovasc Res. 38, 25-53 (1998).
  21. Poon, E., et al. Transcriptome-guided functional analyses reveal novel biological properties and regulatory hierarchy of human embryonic stem cell-derived ventricular cardiomyocytes crucial for maturation. PLoS One. 8, e77784(2013).
  22. Lieu, D. K., et al. Absence of transverse tubules contributes to non-uniform Ca(2+) wavefronts in mouse and human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 18, 1493-1500 (2009).
  23. Cao, F., et al. Transcriptional and functional profiling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. PLoS One. 3, e3474(2008).
  24. Satin, J., et al. Calcium handling in human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 26, 1961-1972 (2008).
  25. Itzhaki, I., et al. Calcium handling in human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. PLoS One. 6, e18037(2011).
  26. Bodor, G. S., Porterfield, D., Voss, E. M., Smith, S., Apple, F. S. Cardiac troponin-I is not expressed in fetal and healthy or diseased adult human skeletal muscle tissue. Clin Chem. 41, 1710-1715 (1995).
  27. Hunkeler, N. M., Kullman, J., Murphy, A. M. Troponin I isoform expression in human heart. Circ Res. 69, 1409-1414 (1991).
  28. Bhavsar, P. K., et al. Developmental expression of troponin I isoforms in fetal human heart. FEBS Lett. 292, 5-8 (1991).
  29. Christoffels, V. M., Keijser, A. G., Houweling, A. C., Clout, D. E., Moorman, A. F. Patterning the embryonic heart: identification of five mouse Iroquois homeobox genes in the developing heart. Dev Biol. 224, 263-274 (2000).
  30. Bruneau, B. G., et al. Cardiac expression of the ventricle-specific homeobox gene Irx4 is modulated by Nkx2-5 and dHand. Dev Biol. 217, 266-277 (2000).
  31. Bao, Z. Z., Bruneau, B. G., Seidman, J. G., Seidman, C. E., Cepko, C. L. Regulation of chamber-specific gene expression in the developing heart by Irx4. Science. 283, 1161-1164 (1999).
  32. Nelson, D. O., Jin, D., Downs, K., Kamp, T. J., Lyons, G. E. Irx4 identifies a chamber-specific cell population that contributes to ventricular myocardium development. Dev Dyn. 243, 381-392 (2013).
  33. Martin, A. F. Turnover of cardiac troponin subunits. Kinetic evidence for a precursor pool of troponin-I. J Biol Chem. 256, 964-968 (1981).
  34. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22, 1991-2002 (2013).
  35. Farrell, H. M., et al. Nomenclature of the proteins of cows" milk--sixth revision. Journal of dairy science. 87, 1641-1674 (2004).
  36. Micusan, V. V., Borduas, A. G. Biological properties of goat immunoglobulins. G. Immunology. 32, 373-381 (1977).
  37. Lyons, G. E. In situ analysis of the cardiac muscle gene program during embryogenesis. Trends Cardiovasc Med. 4, 70-77 (1994).
  38. Nakagawa, O., Nakagawa, M., Richardson, J. A., Olson, E. N., Srivastava, D. H. R. T. 1 HRT2, and HRT3: a new subclass of bHLH transcription factors marking specific cardiac, somitic, and pharyngeal arch segments. Dev Biol. 216, 72-84 (1999).
  39. Xin, M., et al. Essential roles of the bHLH transcription factor Hrt2 in repression of atrial gene expression and maintenance of postnatal cardiac function. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7975-7980 (2007).
  40. Davis, L. M., Rodefeld, M. E., Green, K., Beyer, E. C., Saffitz, J. E. Gap junction protein phenotypes of the human heart and conduction system. J Cardiovasc Electrophysiol. 6, 813-822 (1995).
  41. Minamisawa, S., et al. Atrial chamber-specific expression of sarcolipin is regulated during development and hypertrophic remodeling. J Biol Chem. 278, 9570-9575 (2003).
  42. Larsen, T. H. Atrial natriuretic factor in the heart of the human embryo. Acta Anat (Basel. 138, 132-136 (1990).
  43. Claycomb, W. C. Atrial-natriuretic-factor mRNA is developmentally regulated in heart ventricles and actively expressed in cultured ventricular cardiac muscle cells of rat and human). Biochem J. 255, 617-620 (1988).
  44. Franco, D., et al. Divergent expression of delayed rectifier K(+) channel subunits during mouse heart development. Cardiovasc Res. 52, 65-75 (2001).
  45. Hoogaars, W. M., et al. The transcriptional repressor Tbx3 delineates the developing central conduction system of the heart. Cardiovasc Res. 62, 489-499 (2004).
  46. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15, 3813-3822 (1995).
  47. Srivastava, D., Cserjesi, P., Olson, E. N. A subclass of bHLH proteins required for cardiac morphogenesis. Science. 270, 1995-1999 (1995).
  48. Firulli, A. B., McFadden, D. G., Lin, Q., Srivastava, D., Olson, E. N. Heart and extra-embryonic mesodermal defects in mouse embryos lacking the bHLH transcription factor Hand1. Nat Genet. 18, 266-270 (1998).
  49. Calejo, A. I., et al. Differences in the expression pattern of HCN isoforms among mammalian tissues: sources and implications. Mol Biol Rep. 41, 297-307 (2013).
  50. Stevens, S. M., Pu, W. T. HCN4 charges up the first heart field. Circ Res. 113, 350-351 (2013).
  51. Spater, D., et al. A HCN4+ cardiomyogenic progenitor derived from the first heart field and human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 15, 1098-1106 (2013).
  52. Davis, R. P., vanden Berg, C. W., Casini, S., Braam, S. R., Mummery, C. L. Pluripotent stem cell models of cardiac disease and their implication for drug discovery and development. Trends Mol Med. 17, 475-484 (2011).
  53. Mummery, C., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation. , 107-2733 (2003).
  54. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  55. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29, 1011-1018 (2011).
  56. Samal, R., et al. OMICS-based exploration of the molecular phenotype of resident cardiac progenitor cells from adult murine heart. J Proteomics. 75, 5304-5315 (2012).
  57. Van Hoof, D., et al. Identification of cell surface proteins for antibody-based selection of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. J Proteome Res. 9, 1610-1618 (2010).
  58. Gundry, R. L., Boheler, K. R., Van Eyk, J. E., Wollscheid, B. A novel role for proteomics in the discovery of cell-surface markers on stem cells: Scratching the surface. Proteomics Clin Appl. 2, 892-903 (2008).
  59. Gundry, R. L., Burridge, P. W., Boheler, K. R. Pluripotent Stem Cell Heterogeneity and the Evolving Role of Proteomic Technologies in Stem Cell Biology. Proteomics. 11, 3947-3961 (2011).
  60. Gundry, R. L., et al. A Cell Surfaceome Map for Immunophenotyping and Sorting Pluripotent Stem Cells. Mol Cell Proteomics. , 303-316 (2012).
  61. Bryder, D., Rossi, D. J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cells: the paradigmatic tissue-specific stem cell. Am J Pathol. 169, 338-346 (2006).
  62. Kondo, M., et al. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol. 21, 759-806 (2003).
  63. Shizuru, J. A., Negrin, R. S., Weissman, I. L. Hematopoietic stem and progenitor cells: clinical and preclinical regeneration of the hematolymphoid system. Annu Rev Med. 56, 509-538 (2005).
  64. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112, 3543-3553 (2008).
  65. Boheler, K. R., Bhattacharya, S., Chuppa, S., Riordon, D. R., Kropp, E., Burridge, P. W., Wu, J. C., Wersto, R. P., Wollscheid Rao,, Gundry, B., L, R. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals New Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Reports. , 185-203 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cardiomyocyte DifferentiationCardiac Troponin IIRX4 MarkerMLC2v MarkerMLC2a MarkerTNNT2 MarkerStem Cell CultureAntibody Staining

İlgili makaleler