Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
, Hasarlı kalp tamir kalp üzerinde toksik etkileri yoktur yeni tedavi ilaçlar keşfetmek ve doğru kalp hastalığı modellemek için stratejiler geliştirmek için yaklaşımlar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. Bu uygulamalar için "bir tabak içinde" kalp kası oluşturmak amacıyla insan uyarılmış pluripotent kök hücre (hiPSC) teknolojisini istismar potansiyeli yüksek coşku oluşturmak için devam ediyor. Son yıllarda, verimli insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) den cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde aksi erişilebilir değil, insan kardiyak gelişiminin çok erken aşamalarında modellemek için bize yeni fırsatlar sunan geliştirdi. Birçok önceki yöntemlerin tersine, kardiyomiyosit farklılaşma protokolü hücresi toplanmasını ya da A ya da aktivin BMP4 eklenmesini gerektirmeyen, burada açıklanan ve güçlü bir kardiyak troponin için yüksek seviyede pozitif olan hücre kültürleri üretir I ve T (TNNI3, TNNT2), iroquois- sınıf Homeodomain proteiniIRX-4 (Irx4), miyozin düzenleyici hafif zincir 2, ventriküler / kalp kası izoformu (MLC2v) ve miyozin düzenleyici hafif zincir 2, tüm insan embriyonik kök hücre (HESC) ve hiPSC hatları üzerinden 10 günde atriyal izoformu (MLC2a) için test tarihi. Hücreler geçirildi ve kültür içinde en fazla 90 gün muhafaza edilebilir. Strateji teknik uygulamak için basit ve maliyet-etkin. Pluripotent hücreler türetilen kardiyomiyositlerin karakterizasyonu genellikle mRNA ve protein seviyesinde, her ikisi de referans işaretlerinin analizini içermektedir. Protein analizi için, akış sitometrisi, kültürdeki hücre kalitesinin ve alt popülasyonu homojenliğinin saptanması için güçlü bir analitik araç olduğunu. Ancak, numune hazırlama teknik varyasyon anlamlı veri akış sitometri kalitesini etkileyebilir. Böylece, boyama protokolleri standardizasyon çeşitli farklılaşma stratejileri arasında karşılaştırmalar kolaylaştırmalıdır. Bu duruma göre, Irx4, MLC2v, MLC2a, TNNI3 ve TNN analizi için boyama protokolleri optimizeAkış sitometri T2 açıklanmıştır.
Giriş
HESC ve hiPSC dahil hPSCs, ikinci kardiyomiyositlerde oluşmasından mekanik çalışmalar için başka şekilde erişilemez aşamalarında fikir veren çok erken insan kardiak gelişimsel süreçlerinin bir in vitro model olarak işlev görebilir. Bu model sistem kalp soy bağlılığı ve hücre kaderinin şartname kontrol moleküler yolları incelemek için eşsiz fırsatlar sunmaktadır. Son yıllarda, etkili hPSCs ikinci cardiomyogenic hücreleri üretmek için yeteneği büyük ölçüde 1-15 iyileşmiştir. Bununla birlikte, protokolleri arasında hücreler oda özgü belirteçleri (örneğin, ventrikül ve kulakçıklar) ifade eden hücreler de cardiomyogenic ve zamanlama üreten ver....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Çözüm ve Medya Hazırlık
- HESC Nitelikli Matrix Kaplama Stok Çözüm
- Yavaşça bir gece boyunca 4 ° C'de HESC buz üzerinde nitelikli matrisi (5 mi) eritin. 1.5 ml steril, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpler içine hacimde dağıtın ve hemen -20 ° C'de saklayın.
Not: tüm bölenin hacmi çok dayanmaktadır ve tipik haliyle 270-350 ul aralığında değişir. İmalatçı Adım 2.1 'de tarif edildiği gibi 25 ml seyrelmesi üzerine 1x konsantrasyon elde etmek için gerekli olan tüm bölenin hacmi ile ilgili bilgi sağlar.
- Yavaşça bir gece boyunca 4 ° C'de HESC buz üzerinde nitelikli matrisi (5 mi) eritin. 1.5 ml steril, önceden soğutulmuş mikrosantrifüj tüpler içine hacimde dağıtın ve hemen -20 ° C'de saklayın.
- hPSC Medya Hazır Çözümler
- Aksi belirtilmedikçe, bir seyreltici olarak ultra saf su kullanın. 0.22 mik....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
0. günde, hücreler, kompakt morfolojisi ve hücre döküntüleri en az% 100 birleşik bulunmaktadır. Günlerde 1-2, anlamlı hücre ölümünü (% 40-50) gözlemlemek için ortak, ancak ekli hücreleri kompakt morfoloji (Şekil 1A) muhafaza edecektir. Bu süre boyunca, medya portakal ve bulanıktır. Pembe ortam aşırı hücre ölümünü göstermektedir ve bu durumda, tripan mavisi ile teyit Hücre ölümü ve% 70 aşarsa bırakmaktadır. Hücreler gün 3-4 esnasında kurtarmak ve yoğunluk artacak. 5-6 gün boyunca, en az sayıda hücre ölüm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Farklılaşma protokolün başarısına için kritik farklılaşma başlamadan önce en az beş geçişler için tek hücre düzeyinde pasajlanmışlardır edilmiştir hPSCs kaliteli kültürlerinin kullanılmasıdır. Bunlar hücre hattı bağımsız farklılaşma başlangıcında% 100 konfluent, eğer benzer farklılaşma verimleri bilinen muhtelif hPSC hatlar arasında görülmektedir. Farklılaşma başlangıcında hücre kaynaşması ≤95 veya%>% 100 ise, optimumun altında verimliliği görülmektedir. Bu yüzden, tohum yoğunluğu ve pasaj zamanlaması farklılaşma baş.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu araştırma NIH 4R00HL094708-03 tarafından desteklenen, AİG'nin Araştırma İşler Komitesi Yeni Fakülte Ödülü, ve Wisconsin Medical College (RLG) de Kern vakıf (başlangıç fonları); Hong Kong Tema tabanlı Araştırma Şema T13-706 / 11 (KRB) Araştırma Hibeler Konseyi; U01 HL099776, CIRM TR3-05556, CIRM DR2A-05394, ve AHA Araştırmacı Ödülü (JCW) Kuruldu; AHA Doktora Sonrası Araştırma Bursu 12POST12050254 (PWB). Biz veri toplama ve yazının dikkatli inceleme ile yardım için Wisconsin Kan Araştırma Enstitüsü Sitometrisi Çekirdeği Umut Campbell teşekkür ederim.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Cell Culture | |||
| BD Matrigel, hESC nitelikli matris | BD Biosciences | 354277 | |
| Accutase hücre dekolmanı çözümü | Kök Hücre Teknolojileri | 7920 | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS), kalsiyum yok, magnezyum yok | Yaşam Teknolojileri | 14190-136 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO, Hybri-Max, steril filtreli) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Sodyum bikarbonat | Sigma Aldrich | 53817 | |
| Sitrik asit | Sigma Aldrich | C2404-100G | |
| Y-27632 dihidroklorür seçici p160ROCK inhibitörü | R& D Systems | 1254 | |
| L-Askorbik asit-2-fosfat seskimagnezyum tuzu hidrat | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| Sodyum selenit | Sigma Aldrich | S5261-10G | |
| Transferrin (Optiferrin – Tanımlı, Hayvansız, Rekombinant İnsan) | Invitria | 777TRF029 | |
| Fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) | R& D Systems | 4144-TC-01M | |
| Dönüştürücü büyüme faktörü beta 1 (TGF ve beta; 1) | Peprotech | 100-21 | |
| DMEM/F12, L-Glutamin ve 15 mM HEPES | Yaşam Teknolojileri | ile 11330-032 | |
| İnsülin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| CHIR-99021 HCl | Sellekchem | S2924 | |
| IWR-1 | Sigma Aldrich | I0161 | |
| RPMI 1640, L-Glutamin | Yaşam Teknolojileri | ile 11875-093 | |
| B-27 Takviyesi Eksi İnsülin | Yaşam Teknolojileri | A1895601 | |
| B-27 Takviyesi (İnsülinli) | Yaşam Teknolojileri | 17504-044 | |
| Fetal sığır serumu | Yaşam Teknolojileri | 10437 | |
| Akış Sitometrisi Reaktifleri | |||
| Fosfat tamponlu salin (10x) | Quality Biological Inc. | 119-069-151 | |
| Hank'in Ca2+ ve Mg2+Life Technologies içermeyen dengeli tuz çözeltisi | 14175-095 | ||
| BD Cytofix | BD Biosciences | 554655 | |
| BD Fosflow perma tamponu III | BD Biosciences | 558050 | |
| %16 Paraformaldehit | Thermo Scientific | 28906 | |
| Metanol | Sigma Aldrich | 179957-4L | |
| Aseton | Mallenckrodt Kimyasalları | 2440-16 | |
| Triton X-100 | Amresco | M236-10ML | |
| Keçi serumu | Yaşam Teknolojileri | 16210-064 | |
| Tripan mavisi çözeltisi, %0.4Yaşam | Teknolojileri | 15250-061 | |
| Materials | |||
| >5 ml Yuvarlak tabanlı polistiren tüp (kapaksız) | Corning | 352008 | Hazırlanması için akış sitometrisi için hücreler |
| 5 ml Yuvarlak tabanlı polistiren tüp (35 & M hücre süzgeci geçmeli kapak) | Corning | 352235 | Akış sitometrisi için hücrelerin hazırlanması için |
| 2 ml kauçuk ampuller | Fischer Scientific | 03-448-24 | |
| 9" borosilikat fişe takılmamış cam Pasteur pipetleri | BioExpress | P-2904-2 | |
| 0,65 ml Mikrosantrifüj tüpleri, dereceli, yeşil | GeneMate | C-3259-G | |
| 1,5 ml Mikrosantrifüj tüpleri, dereceli, kırmızı | GeneMate | C-3260-R | |
| TC20 otomatik hücre sayacı | BioRad | 145-0102 | |
| TC20 için sayma slaytları | BioRad | 145-0011 | |
| 6 kuyulu Düz tabanlı doku kültürü ile muamele edilmiş plaka | Corning | 353046 | |
| 20 ml Şırıngalar | BD Plastipak | 300613 | Alikotların |
| filtre sterilizasyonu içinSteril şırınga filtreleri, 0.2 & m polietersülfon | VWR | 28145-501 | Alikotların filtre sterilizasyonu için |
| 250 ml Filtre sistemi, 0.22 &mikro; m polietersülfon, sterilizasyon, düşük bağlayıcı | Corning | 431096 | Dökme ortamların filtre sterilizasyonu için |
| 500 ml filtre sistemi, 0.22 & m polietersülfon, sterilizasyon, düşük bağlayıcı | Dökme ortamın | ||
| Antikorlar ve İzotip Kontrolleri | |||
| Anti-TNNI3 (klon: 284 (19C7))Abcam | ab19615 | Primer antikor | |
| Anti-TNNT2 (klon: 1C11) | Thermo Scientific | MA1-16687 | Primer antikor |
| Anti-MYL2 (MLC2v, klon: 330G5) | Sinaptik Sistemler | 310111 | Primer antikor |
| Anti-MYL7 (MLC2a, klon: 4E7) | Abcam | AB131661 | Primer antikor |
| Anti-IRX4 | Bioss | BS-9464R | Birincil antikor |
| Alexa Fluor 488 Keçi anti-fare IgG1 | Yaşam Teknolojileri | A21121 | İkincil antikor |
| Alexa Fluor 647 Keçi anti-fare IgG2a | Yaşam Teknolojileri | A21241 | İkincil antikor |
| Alexa Fluor 488 Keçi anti-fare IgG2b | Yaşam Teknolojileri | A21141 | İkincil antikor |
| Fikoeritrin (PE) Keçi anti-tavşan IgG R | & D Sistemleri | F0110 | İkincil antikor |
| Fare IgG1 | BD Biosciences | 557273 | İzotip Kontrol |
| Faresi IgG2a | eBiosciences | 16-4724-81 | İzotip |
| Kontrolü Tavşan IgG-PE | R& D Systems | IC105P | İzotip Kontrolü |
| < >ACTB Yaşam Teknolojileri için TaqMan Probları | |||
| Hs01060665 | |||
| Brachyury T | Yaşam Teknolojileri | Hs00610080 | |
| CASQ2 | Yaşam Teknolojileri | Hs00154286 | |
| IRX4 | Yaşam Teknolojileri | Hs01100809 | |
| ISL1 | Yaşam Teknolojileri | Hs00158126 | |
| MESP1 | Yaşam Teknolojileri | Hs01001283 | |
| MYH11 (SMMHC) | Yaşam Teknolojileri | Hs00224610 | |
| MYH6 | Yaşam Teknolojileri | Hs01101425 | |
| MYL2 (MLC2v) | Yaşam Teknolojileri | Hs00166405 | |
| MYL7 (MLC2a) | Yaşam Teknolojileri | HS01085598 | |
| MYOG | Yaşam Teknolojileri | HS01072232 | |
| NKX2.5 | Yaşam Teknolojileri | HS00231763 | |
| NPPA | Yaşam Teknolojileri | HS01081097 | |
| POU5F1 | Yaşam Teknolojileri | HS04260367 | |
| SOX17 | Yaşam | Teknolojileri HS00751752 | |
| TNNI1 | Yaşam Teknolojileri | HS00913333 | |
| TNNI2 | Yaşam Teknolojileri | HS00268536 | |
| TNNI3 | Yaşam Teknolojileri | HS00165957 | |
| TNNT2 | Yaşam Teknolojileri | HS00165960 | |
Kaynaklar
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Lian, X., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
