Fare Adrenal Kromafin Cell Hücre bağlı Kapasitans Ölçümler Yöntemleri

Summary

Ekzositozdan sonra, kaynaşmış plazma zarı endositoz olarak bilinen bir işlemle elde edilir. Bu mekanizma, bir sonraki serbest bırakma turu için yeni sinaptik vezikülleri yeniden düzenler. Bireysel endositik olaylar, fare adrenal kromaffin hücrelerinde hücreye bağlı kapasitans kayıtlarının kullanılması yoluyla yakalanır ve analiz edilir.

Abstract

Nöronal iletim, beyindeki hücresel iletişimin ayrılmaz bir parçasıdır. Presinaptik membranın depolarizasyonu, sinaptik iletime aracılık eden ekzositoz olarak bilinen vezikül füzyonuna yol açar. Endositoz olarak tanımlanan bir süreçte yeni nörotransmitter dolu veziküller oluşturmak için sinaptik veziküllerin daha sonra alınması gereklidir. Ekzositoz sırasında, vezikül zarlarının kaynaşması yüzey alanında bir artışa neden olur ve ardından endositoz, yüzey alanında bir azalmaya neden olur. Burada, laboratuvarımız, fare adrenal kromaffin hücresindeki tek endositik olayların hücreye bağlı kapasitans kayıtlarına temel bir giriş göstermektedir. Bu tür elektriksel kayıt, tek vezikül seviyesinde ekzositoz ve endositozun yüksek çözünürlüklü kayıtları için kullanışlıdır. Bu teknik hem vezikül ekzositozunu hem de endositozu tespit edebilirken, laboratuvarımızın odak noktası vezikül endositozudur. Ayrıca, bu teknik, tek endositik olayların kinetiğini analiz etmemizi sağlar. Burada fare adrenal bez dokusu diseksiyonu, kromaffin hücre kültürü, temel hücre bağlı teknikler ve tekil endositik olayı ölçen bireysel izlerin müteakip örnekleri açıklanmaktadır.

Introduction

Sinaptik nörotransmiter içeren sinaptik veziküllerin ekzositozu aracılık eder ve bu veziküller uzun vadede nöronal iletişim sağlamak için sinir terminal içinde yerel endositik geri dönüşüm geçmesi gerekmektedir. Sinaptik vezikül döngüsü, bir bütün olarak, hücresel haberleşme daha iyi bir kavramaya yönelik gerekli bir temel teşkil eden moleküler makine anlaşılması, sinaptik iletim temel rolü göz önüne alındığında. Hücre modeli sistemleri arasında, adrenal kromafin hücre sinaptik vezikül geri dönüşüm altında yatan moleküler makineler içine en kesin içgörü bazı sağlamıştır. Ekzositoz, nörotransmitter açıklamasında son adım, son derece okudu ve adrenal chromaffin hücreni....

Protocol

NOT: Chicago Illinois Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan tüm prosedür, Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Çözümleri ve Kültür Medya Hazırlıklar

1. Altı aya kadar -20 ° C'de tüm çözümleri tutun. 3 aya kadar 4 ° C 'de kültür ortamı tutun.
2. DMEM ile 100 ml ITSX (İnsülin-Transferrin-Selenyum takviyesi-) 1 Pen-strep çözeltisi ve 1 ml kültür ortamı karıştırılarak 100 ml hazırlayın.
3. DMEM, 250 mi, 100 mM _CaCl2, 2.5 ml ve 50 mM EDTA, 2.5 ml enzim çözeltisi karıştırarak hazırlayın.
4. DMEM, 225 ml FBS, 25 ml, 625 mg albumin....

Results

Hücre canlılığı ve gigaohm sızdırmazlık kalitesinin hücre bağlı kapasitans kayıtlarının kalitesini belirlemek için önemlidir. Bu nedenle, önceki elektrofizyolojik kayıtları ve tipik yaşayabilir hücrelerin, Şekil 1 'de gösterilmiştir etkili ve verimli bir hücre kültürünü temin etmek önemlidir. Teori ve zaman yüksek kaliteli bir yalıtım elde edilir gigaohm yararlı olacaktır. Bir açık protokol Aşama 5.3 'te tarif edildiği gibi Patch-Pipeti hücre yaklaşmaktadır hücre deformasyon görüldüğünde, yüksek kalitel.......

Discussion

Hücre bağlı kapasite ölçümleri başarılı bir şekilde yüksek kalitede ses kayıtları elde etmek için bazı kritik adımları gerektirir: böbreküstü bezlerinden hazırlanmış 1) canlı ve sağlıklı hücreleri; Lamelleri 2) PDL kaplama; 3) gigaohm yalıtım oluşturma; 4) sistem gürültü seviyesi; ve 5) faz düzeltme.

Hayvan ameliyatı için bir potansiyel yapabilirsiniz değişiklikler en uygun dirayeti cerrahi yaklaşımı ayarlamak ve diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemektir. Elektrofizyolojik kayıtlar içi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	UV
Dulbecco'dan Uzak Tutun s Modifiye Eagle Medium	Life Technologies
Kapak Camı	Carolina Biological	633029	12 mm
Penisilin Streptomisin	Yaşam Teknolojileri		15140122 100 ml
İnsülin-Trans-Sel-X	Yaşam Teknolojileri	51500056	Sadece ICE üzerinde çözdürün!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus yama amplifikatörü	HEKA
BNC-2090 veri toplama kartı	National Instruments
Igor veri toplama yazılımı	Wavemetrics
P-97 pipet çektirmesi	Sutter Instruments Microforge
	Scientific Instruments
Borosilikat cam kılcal damarlar	Sutter Instruments	B150-110-10	Dış çap: 1,5 mm İç çap: 1,10 mm Uzunluk: 10 cm