Embriyonik Kök Hücreleri Kardiyak Progenitör Hücrelerinin türetilmesi

Özet

Bu protokolde, hem fare hem de insan embriyonik kök hücrelerinden kardiyak progenitör hücrelerin türetilmesi gösterilecektir. Bu protokoldeki ana strateji, embriyonik kök hücre hatlarına tasarlanmış floresan raportörler kullanarak kardiyak progenitör hücreleri akış sitometrisi ile zenginleştirmektir.

Özet

Kardiyak progenitör hücreler (CPC'ler), kardiyomiyositlere, düz kas hücrelerine (SMC) ve endotel hücrelerine farklılaşma kapasitesine sahiptir ve kalp hastalığına karşı hücre tedavisinde büyük umut vaat eder. KKG'leri izole etmek için çeşitli yöntemler arasında, embriyonik kök hücrenin (ESC) KKG'lere farklılaşması, ESC'lerin sınırsız hücre kaynağı sağlayabilmesi nedeniyle bu alanda büyük ilgi görmektedir. Sonuç olarak, ESC'lerden TBM'ler türetmek için çok sayıda strateji geliştirilmiştir. Bu protokolde, embriyonik KKG'lerin hem fare hem de insan ESC'lerinden farklılaşması ve saflaştırılması anlatılmaktadır. Embriyonik KKG'leri izole etmek için hücre yüzeyi belirteçlerini kullanmanın zorluğu nedeniyle, ESC'ler, KKG'ye özgü kre rekombinaz ekspresyonu ile aktive edilen floresan raportörlerle tasarlanmıştır. Böylece, TBM'ler floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile zenginleştirilebilir. Bu protokol, CPC spesifikasyonu ve zenginleştirme için ESC'lerden embriyoid cisimleri (EB'ler) oluşturma prosedürlerini gösterir. İzole edilen CPC'ler daha sonra kardiyak soy farklılaşması ve diğer biyolojik testler için kültürlenebilir. Bu protokol, hem fare hem de insan ESC'lerinden CPC'lerin sağlam ve verimli bir şekilde türetilmesi için optimize edilmiştir.

Giriş

Kalp hastalığı dünyanın önde gelen nedeni, bugün kalır ve ölüm oranları son iki yılda (Amerikan Kalp Derneği) hemen hemen değişmeden kalmıştır. Etkili bir şekilde engellemek veya kalp yetmezliği ters yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir ihtiyaç vardır. Bir umut verici bir strateji kök hücre biyolojisi ¹ hızlı gelişimi aşağıdaki hücre tabanlı tedavi yöntemidir. Bu bağlamda, multipotent TBM bağlı olarak çoğalır, ancak sadece kalp dizi farklılaşma kararlı etme kabiliyetleri tedavisi için mükemmel bir hücre kaynağı olabilir. Bu nedenle, verimli ve sağlam bir yöntem oluşturmak ve kalp hücre tedavisi çalışmaları için büyük önem taşımaktadır TBM'lerini izole etmek.

Bu protokol, erken embriyogenezin ve nasıl EKH kendi üretim sırasında belirlenen embriyonik TBM'lerle üzerinde duruluyor. Çeşitli TBM da kemik iliği ^2, embriyonik ve yetişkin kalplerinden izole edilmiştir. Embriyo gelişimi sırasında, kemik morphogemanyetik proteinleri (BMP), kanatsız-tipi MMTV entegrasyon sitesi aile üyeleri (Wnts) ve Düğüm sinyaller Mesp1 ⁺ Multipotent mezoderm ³ bağlılığını neden. Mesp1 ⁺ hücreleri, daha sonra embriyonik TBM ⁴ içinde farklılık gösterir. Bu TBMler genellikle NK2 homeobox 5 (Nkx2-5), Isl LIM homeobox 1 (Isl1), T-box 5 (Tbx5), ve miyosit arttırıcı faktör 2C (Mef2c), birincil ve ikinci kalp alanları oluşturmak, HCN4 tarafından işaretlendiği ve cardiogenesis ^5-10 sırasında kalbin ana bölümden katkıda bulunur. Nkx2-5 ⁺ ve Isl1 ⁺ / Mef2c ⁺ Her iki TBM kardiyomiyositlere ayırt edebiliyoruz, düz kas hücreleri (SMC'lere) ve endotel hücreleri ^5-8. Bu nedenle, bu TBM kalp damar yanı sıra kardiyak dokulara doğuran ve hücre bazlı kalp tedavisi için ideal bir hücre kaynağıdır olacaktır. Sonuç olarak, in vitro TBM'leri üreten kardiyovasküler çalışmalarda önemli bir araştırma odağı olmuştur. EKH sınırsız genişleme kapasitesi a sahip olduğundannd blastosist aşamasında ICM hücreleri temsil doğal embriyogenez aşağıdaki embriyonik TBM'lerle içine EKH farklılaşması TBM'lerini elde etmek mantıklı ve etkili bir yaklaşım olarak kabul edilir.

EKH gelen TBM'ler elde etmek için bir çok uygulamalı bir yaklaşım EBS ¹¹ içine EKH bir araya etmektir. Farklılaşma verimliliğini artırmak için, kardiyak gelişme bilgiye dayalı tanımlanmış kimyasal ve büyüme faktörleri ^12-14 kullanılmıştır. Ancak, yaygın olarak alanda kabul edilen kesin TBM belirteçler, özellikle de herhangi bir hücre yüzeyi işaretleri vardır. Bu sorunu gidermek için, EKH Isl1 ⁺ veya Mef2c ⁺ TBM ve Cre / loxP sistemi kullanılarak floresan gazetecilere türevleri işaretlemek için tasarlanmıştır. CRE rekombinaz Isl1 / Mef2c promotör / güçlendirici kontrolü altında çaldı. Bir kurucu promoteri tarafından tahrik edilen modifiye floresan protein RFP veya YFP gen CRE rekombinaz ile flox durdurma kodonu çıkarılması ile aktive edilebilir(Isl1: CRE;-pCAG-flox-STOP-flox GFP veya RFP / Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; Rosa26YFP) ^5,6. EKH ikinci kalp alan TBM'ler ayrılırlar sonra, Isl1 / Mef2c promotör / güçlendirici tahrik CRE floresan gazetecilere aktive edecek ve TBM FACS-saflaştırma ile zenginleştirilmiş olabilir. Kısaca, EB toplama yöntemi ESC farklılaşma başlatmak için kullanılır. Farklılaşma verimliliğini artırmak için, farklılaşmış hücreler, askorbik asit (AA) ve BMP4, aktivin A ve VEGF ^13,15 gibi büyüme faktörleri ile muamele edilir. Bu protokol fare ve insan EKH her ikisini de kullanarak sağlam ve verimli TBM farklılaşmasını sağlar.

Protokol

Fare EKH adlı Fare Embriyonik TBMlerin 1. türetilmesi

1. Fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) besleyici tabakası hazırlayın.
   1. Sıcak MEF ortam 37 ° C'ye kadar (DMEM içinde% 10 FBS).
   2. Jelatin kaplı tabak hazırlayın.
      1. 10 cm'lik bir tabak içine bir 6-yuvalı plaka arasında bir çukur veya 5 ml su içinde,% 0.1 Jelatin 1 ml ilave edilir.
      2. En az 30 dakika boyunca plakaları ya da yemekler, 37 ° C'de ya da oda sıcaklığı bırakın. Kullanmadan önce jelatin talip.
   3. Çözülme hafifçe çalkalanarak, 37 ° C su banyosu içinde hızla MEFS maruz bırakıldı.
   4. 15 ml veya 50 ml konik bir tüp yavaşça hücreler aktarın. Önceden ısıtılmış MEF ortam 5 ml. Yavaşça hücreler girdap ve 5 dakika için 200 x g'de santrifüj.
   5. MEF ortamda hücrelerin tekrar ve canlı hücreleri saymak. 10 cm'lik bir tabak hücreleri 2 ml 6 yuvalı plakadan gelen başına hücre ve 10 ml: Aşağıdaki MEF ortam hacimleri kullanın.
   6. 6-delikli plakalara Levha hücreleri veya 1-2 en az 10 cm yemeklerPlaka / tabak başına x 10 ^6.
   7. 37 ° C'de, MEF plakalar / tabaklar inkübe,% 5 _CO2, en az 24 saat önce kullanımı.
      NOT: Bir haftadan daha eski MEF plakaları / yemekler atın.
2. Fare EKH hazırlayın
   1. Kültür Isl1-CRE; Rosa26YFP / Mef2c-CRE; % 90 konfluent kadar MEF'ler üzerinde Rosa26YFP fare EKH. Kullanım ES hücre ortamı 410 ml DMEM, 75 ml FBS, 0.1 mM MEM NEAA, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM piruvat, 100 E Pen / Strep, ve 0.1 mM β-merkaptoetanol içermektedir.
   2. 1.1.2 tarif edildiği gibi, jelatin kaplı 6 oyuklu plakalar hazırlamak.
   3. Plakalardan aspire orta ve DPBS hücreleri durulayın.
      1. Aspire DPBS ve 6 oyuklu plakanın bir kuyuya 0.4 mi% 0.25 tripsin ekleyin. 5 dakika için 37 ° C,% 5 _CO2 seviyesinde hücreleri inkübe edin. Tripsin reaksiyonu durdurmak için 1 ml önceden ısıtılmış ES ortamı ekleyin.
   4. Hasat hücreleri ve santrifüj hücreleri 200 xg ve aspire orta az. Süspanse 1 ml ES hücre ortamında hücre ve hücreleri saymak.
   5. 3 x 10 ⁴ / ^cm2 yoğunlukta, jelatin-kaplanmış plakalar üzerinde plaka EKH. EKH yaklaşık% 90 konfluent ulaştığında yaklaşık 2 gün boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe edin. Orta gün değiştirin.
   6. EKH% 90 konfluent olduğunda, tekrar tamamen MEF besleyiciler kaldırmak için 1.2.2-1.2.5 adımları.
3. EB formasyonu TBM farklılaşmasını teşvik
   1. Ardından farklılaştırma ortamı hazırlayın: 36 ml IMDM, 12 mi Ham F12, 2 mM L-glutamin, 0.34 ml BSA (% 7.5), 0.25 mi, N2, 0.5 mi B27, 50 ug / ml AA, ve 0.45 mM 1-tiogliserol.
   2. Aspire hücrelerinden orta ve DPBS ile durulayın. Aspire DPBS ve 6 oyuklu plakanın bir kuyuya 0.4 mi% 0.25 tripsin ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
   3. Tek hücre içine hücre kümeleri dağıtmak için aşağı reaksiyon ve pipet yukarı durdurma ve 1 ml farklılaşma orta ekleyin.
   4. Santrifüj EKH 5 dakika için 200 xg'de ve orta atın.
      1. Süspanse 1 x 10 ^{6 <}/ Sup> 1 mi farklılaşma ortamında EKH. İlk EB toplama için 37 ° C 'de ayırt ortamında 1 x 10 ⁵ hücre / ml' lik bir konsantrasyonda, düşük sıyrılma Petri kabındaki hücrelere hücre sayımı ve kültür.
   5. İki gün EB oluşumundan sonra, 50 ml'lik tüplere yemekleri EBS aktarmak. 1 dakika için 200 xg'de Spin. Orta çıkarın ve Ca ²⁺ ve Mg ²⁺ olmadan 10 ml DPBS ile EBS durulayın.
   6. Aspire DPBS ve 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Reaksiyonu durdurmak için 4.5 mi farklılaşma orta ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı tek hücre içine EBS ayırmak.
   7. 5 dakika süreyle 200 x g'de hücreleri santrifüjleyin. 1 ml farklılaşma ortamda aspire orta ve tekrar süspansiyon hücreleri.
   8. Hücre sayımı ve farklılaşma ortamında 1 x 10 ⁵ hücre / ml, 2 x 10 ⁶ hücre seyreltin. 5 ng / ml, 0.8 ng / ml'lik nihai konsantrasyonda ortama VEGF BMP4 ve aktivin A ilave edin ve 5 ng / ml idi. Cultu37 ° C 'de, ikinci EB formasyonu için Petri kabındaki hücrelere yeniden.
   9. İkinci EB oluşumundan sonra 40 saat, 50 ml'lik tüplere EBS aktarmak. 5 dakika için 37 ° C 'de, 1 ml% 0.25 tripsin ile EBS, ayırma DPBS ile bir kez yıkayın. Pipet yukarı ve aşağı tek hücre içine EBS ayırmak.
   10. 5 ng / ml VEGF, 10 ng / ml bFGF ve 12.5 ng / ml FGF10 ile Stempro-34 ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Jelatin kaplı plakalara, 2 x 10 ⁵ / ^cm2'de, hücreler plaka. TBM izole edilmesinden önce 32 saat süre ile 37 ° C inkübatör içinde kültürü.
4. MCPCs yalıtmak
   1. Aspire orta ve DPBS ile durulayın. 5 dakika için 37 ° C 'de kültür plakalarına 0.5 mi% 0.25 tripsin ekleyin. Reaksiyonu durdurmak için 4.5 mi farklılaşma orta ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı tek hücre içine EBS ayırmak. FACS-saflaştırılması için% 2 FBS / PBS santrifüj ve tekrar süspansiyon hücreleri hücreleri toplayın.
   2. Negatif kontrol olarak sıralayıcı farklılaşmamış EKH çalıştırın. Değişim gerilimi ileri dışkılarını ayarlamak içinter (FSC) ve yan dağılım (SSC) istenen nüfus seçmek için. Enkaz ve dublet dışlamak için yan dağılım ve genişliği karşı ileri dağılım yüksekliği karşı dağılım ileri kullanın. Seçilen alt-popülasyonda, ESC kontrol dağılımına göre, hücre otofloresans ortadan kaldırmak için histogram üzerinde olumlu YFP bir kapı çizin. YFP ⁺ yolluk gelen YFP ⁺ TBM'leri toplayın.
   3. Farklılaştırma ortamının (1.3.1) 'e sahip 6-çukurlu plakalarda saflaştırılmış TBM (YFP ⁺ hücreleri) plaka. Kardiyomiyositler ve SMC'lerin içine TBMlerin farklılaşması için 37 ° C'de Kültür ek 3-5 gün.

İnsan EKH İnsan Embriyonik TBMlerin 2. türetilmesi

1. Yemlikler hazırlayın
   1. 2 x 10 ⁴ / ^cm2 yoğunluğunda, yukarıda tarif edildiği gibi, fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) besleyici tabaka hazırlanır.
2. İnsan EKH koruyun
   1. CRE, M rutin pCAG-flox-STOP-flox-GFP veya RFP EKH: İnsan Isl1 koruyunNormal HESC ortamı (Nakavt DMEM / F-12 385 ml, Nakavt SR 100 mi, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM NEAA, 0.1 mM β-merkaptoetanol, 10 ng / ml temel FGF) kullanılarak EF. Kalp farklılaşma önce, en az 2 pasajlar için besleyici serbest durumda insan EKH aktarmak.
3. Besleyici serbest durumda insan EKH hazırlayın
   1. İnsan EKH kültür için kaplanmış tabak hazırlayın.
      1. Gece boyunca 4 ° C 'de Matrigel çözülme. Buz üzerinde 50 mi tüp koyun ve bir tüp içine, 30 ml soğuk DMEM / F12 ortamı ilave edin.
      2. Soğuk ortama 1 ml Matrigel ekleyin ve iyice karıştırın. 10 cm'lik bir tabak içine bir 6-yuvalı plaka oyuğuna ya da 5 ml 'si içerisine 1 ml soğuk Matrigel, DMEM / 12 orta ekleyin.
      3. 2 saat boyunca levhalar / gece boyunca 4 ° C'de yemekleri veya oda sıcaklığını bırakın. Orta aspire kullanmadan önce.
   2. MEF plaka aspire medya ve DPBS insan EKH durulayın: İnsan plakalar üzerine EKH bölün. Daha sonra 6-çukurlu plaka içinde bir kuyu 1 ml dispaz (1 mg / ml) ilave edilmektedir. 37 ° C de kuluçkaya bırakılırinkübatör kolonilerinin kenarları ayırmak başlayana kadar.
   3. Dispase çözüm çıkarın. Daha sonra 2,5 ml / add iyi mTeSR orta veya MEF-klimalı ortamda başına plaka, iki kez DPBS ile durulayın.
   4. Küçük öbekler halinde insan ESC kolonileri yıkmak için bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kazıyın ve dikkatlice pipetlemeyin ve.
   5. ESC kümeleri aktarın ve 1 sulandırmak: 3 kaplanmış plakalar halinde.
   6. 2 ml / kuyu mTeSR orta veya MEF-klimalı orta ekleyin ve günlük orta değiştirin.
   7. MTeSR ortam veya en az 2 pasaj ile kaplanmış plakalar üzerine, MEF-şartlandırılmış ortam içinde kültür insan EKH.
4. İnsan EKH TBM farklılaşmasını teşvik
   1. Hücreler ~% 90 konfluent olduğunda, orta aspire ve DPBS ile durulayın. Daha sonra 20 dakika boyunca 37 ° C'de 0.5 mg / ml dispaz içinde HESC inkübe edin.
   2. Hücre kaldırıcı plakalardan hücreleri çıkarmak iki kez DPBS HESC durulayın, sonra, DMEM / F12% 18 FBS, 0.1 mM NEAA, 2 mM ihtiva eden (farklılaştırma ortamının hücre kelepçeler tekrar süspansiyonL-glutamin, 0.1 mM β-merkaptoetanol ve 50 ug / ml askorbik asit).
   3. EB oluşumu için 6-kuyu, ultra-düşük bağlantı plakaları içine hücreleri aktarın.
   4. Ertesi gün farklılaşma ortamı değiştirin.
   5. Her 3 günde bir orta takın ve süspansiyon kültürü içinde EBS korumak.
5. HCPCS yalıtmak
   1. Geç insan TBM izolasyonu için farklılaşma 9 gün daha EBS toplayın.
   2. Aspire orta ve iki kez DPBS ile EBS durulayın. 5 dakika için 37 ° C 'de 6-çukurlu kültür plakalarının her bir oyuğuna 0.5 mi% 0.25 tripsin ekleyin.
   3. Reaksiyonu durdurmak için farklılaştırma ortamının eşit hacim. Pipet yukarı ve aşağı tek hücre içine EBS ayırmak. % 2 FBS / DPBS'de 5 dk ve tekrar süspansiyon hücreleri için 200 xg'de santrifüj hücreleri toplayın. 40 mikron hücre süzgeç ve FACS-saflaştırılmış RFP ⁺ TBM hücreleri ile Filtre hücreleri olarak 1.4.3 de anlatıldığı.
   4. Plaka geltin kaplı plakalar üzerine HCPCS sıralanır. 7 için farklılaşma ortam içinde kültür HCPCS-9 Gün kardiyomiyosit ve düz kas hücrelerine ayırt etmek. 7 gün kuluçkadan sonra kültür, DMEM / F12 ortamı içinde% 5 Nakavt SR farklılaşmış hücreleri.

Sonuçlar

Protokol pek çok ES hücre hatları TBM türetilmesini göstermektedir. EKH TBM'leri içine ayırt etmek için EBS oluşturmak için toplanır. EKH rutin MEF besleyiciler (Şekil 1A, F) tutulur ve besleyiciler farklılaşma önce kaldırılır. Farklılaşma ortamında EBS (Şekil 1B, G) içine EKH agregasyonu üzerine, ikinci oluşan EBS fare hücre hatları (Şekil 1C) içinde mezoderm farklılaşmasını geliştirmek için BMP4 ve aktivin A ile işleme tabi tutulur. Floresan proteini YFP / RFP

Tartışma

Bu protokol, mESC'lerin farklılaşmasına ve insan ESC'lerinin CPC'lere kendiliğinden farklılaşmasına rehberlik etmek için büyüme faktörlerini kullanan bir yöntemi birleştirir. Floresan raportör ile işaretlenmiş CPC soyu, CPC'leri FACS tarafından verimli bir şekilde tanımlamak ve izole etmek için kullanılır. FACS ile saflaştırılmış CPC'ler, kardiyomiyositlere, düz kaslara ve endotel hücrelerine farklılaşma kapasitesini korur ve in vivo hücrelerle karşılaştırılabilir bir ekspresyon profiline sahiptir. Bu nedenle, bu CPC'ler...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
FBS	Thermo scentific	SH30070.03E
Knockout SR	Life teknolojisi	10828028
Knockout DMEM	Life teknolojisi	10829018
DMEM	Life teknolojisi	11965118
NEAA	Life teknolojisi	11140050
GlutaMAX	Life teknolojisi	35050061
N2	Life teknolojisi	17502048
B27	Life teknolojisi	12587010
Jambon' s F12	Life teknolojisi	11765062
IMDM	Life teknolojisi	12440061
Pen/Strep	Life teknolojisi	15140122
Pyruvate	Life teknolojisi	11360070
Dispase	Life teknolojisi	17105041
Stempro-34	Life teknolojisi	10639011
DMEM/ F12	Life teknolojisi	11330032
BSA	Yaşam teknolojisi	15260037
Tripsin	Yaşam teknolojisi	25200056
Askolik Asit	Sigma	A5960
1-Tiyogliserol	Sigma	M1753
2-Merkaptoetanol	Sigma	M3148
VEGF	Ar-Ge D	293-VE
Bmp4	Ar-Ge D	314-BP
ActivinA Ar-Ge	D	338-AC
bFgf	Ar-Ge D	233-FB
Fgf10	Ar-Ge D	345-FG
mTeSR	Kök hücre teknolojileri	5850
Matrigel	BD Biosciences	354277