İnsan İskelet Kası İlköğretim andMyogenic Hücreleri ve Fibroblast İzolasyon ve Kantitatif İmmünositokimyasal Karakterizasyonu

Summary

İnsan kasından türetilen ana yapışık hücre tipleri miyojenik hücreler ve fibroblastlardır. Burada, hücre popülasyonları, CD56 antijenine dayalı olarak manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması kullanılarak zenginleştirilir. Spesifik antikorlarla müteakip immüno-etiketleme ve görüntü analiz tekniklerinin kullanılması, tek tek hücrelerde sitoplazmik ve nükleer özelliklerin miktar tayinine izin verir.

Abstract

onarım ve iskelet kası rejenerasyon ikamet kas kök hücreleri uydu hücrelerinin eylem gerektirir. Bu kültürde okudu insan kas biyopsisi enzimatik sindirim kullanılarak örnekler ve onların Miyojenik özelliklerinden izole edilebilir. Kantitatif olarak, enzimatik sindiriminden elde edilen iki ana yapışık hücre tipleri şunlardır: (i) uydu CD56 ⁺ başlangıçta tanımlanan hücreler (bunlara miyojenik hücre ya da kas öncü hücreleri), daha sonra, CD56 ⁺ / ⁺ hücrelerinin desmin ve (ii) kaslarını ve TE-7 ^{+ -} CD56 olarak tanımlanan türetilmiş fibroblastlar,. Fibroblastlar kültüründe çok verimli çoğalır ve karışık hücre popülasyonlarının bu hücrelerin kültürü hakim Miyojenik hücreleri istila edebilir. İnsan kas farklı hücre tiplerinin izolasyonu ve saflaştırılması, böylece kültür ya hücre tipi doğuştan davranışını araştırmak için çalışan önemli bir metodolojik bir husustur. Burada açıklanmayanher ikisi de, yüksek saflıkta (>% 95 miyojenik hücre) ve iyi bir verim (~ veren kolajenaz kullanarak hücrelerin yumuşak enzimatik sindirimiyle göre ayrılması ve manyetik aktive hücre sınıflandırma (MACS) takip dispaz bir sistem ibe 2.8 x 10 ⁶ ± 8.87 kültür deneyleri için in vitro 7 gün sonra) x 10 ⁵ hücre / g doku. Bu yaklaşım, CD56 karşı bir antikora konjuge manyetik mikro-boncuklar ile karışık kas kaynaklı hücre sicimli fragmanlar popülasyonu, ve daha sonra, bir manyetik alan da hücrelerin geçen dayanmaktadır. Mikro bağlı CD56 ⁺ hücreler CD56 ise alan tarafından korunur ^- hücreler sütununda boyunca engellenmeden geçen. Ayırma sürecinin herhangi bir aşamasında elde edilen hücre süspansiyonları kaplama ve kültüre edilebilir. Belirli bir müdahale, hücre morfolojisi, ifadesi ve nükleer transkripsiyon faktörleri de dahil olmak üzere protein lokalizasyonu izlenerek özel antikorlar ve bir görüntü p immünofloresan etiketleme kullanılarak belirlenebilirrocessing ve analiz paketi.

Introduction

iskelet kası onarımı ve yenilenmesi uydu hücreleri ^1, miyojenik kök hücreler ^2,3. eylemini gerektirir in vivo bu hücreler, her myofibre ve sarcolemma ve bazal lamina arasında yer alan tersine çevrilebilir pasif durumda var, ama çoğalırlar aktif hale, sigorta ve kas dokusu gibi ayırt, hasar tamir ve ³ rejenere edilir. Uydu hücreleri enzimatik sindirim ⁴ kullanılarak genç ve yaşlı insan kas biyopsi örneklerinde ve onların Miyojenik özelliklerinden izole edilebilir sonradan primer kültür ⁵ incelenebilir. hücre popülasyonunun iki verim ve saflık açısından, bu izolasyon sürecinin verimliliği kullanılan yöntemler bağlıdır ve örnekten örneğe değişebilir. enzimatik sindiriminden elde edilen iki ana yapışık hücre tipi, CD56 ⁺ / desmin hücreleri ve mu başlangıçta tanımlanan uydu hücreler (şimdi olarak adlandırılan miyojenik hücre ya da kas ön-madde hücreleri) vardırSistemik lupus türetilmiş CD56 olarak tanımlanan fibroblastlar, ^- ve TE7 ⁺ hücreleri ^5. Fibroblastlar hızlı çoğalma oranı ve kas hücreleri gibi, hücre-hücre temas üzerine geri dönüşü olmayan büyüme durmasını ve nihai farklılaşmasını uğramazlar; Böylece karışık toplumlarda, fibroblastlar kültürü hakim Miyojenik hücreleri istila edebilir.

Fibroblastlar genellikle Ancak, kendi başlarına incelenmeye değer hücreleri gibi fibroblastlar artan bir ilgi onlar kas tamir ⁶ sırasında myojenik hücreleri ile bir kooperatif bir role sahip olduğu gösterilmiştir özellikle de, şimdi var, kas biyologlar için bir tahriş olarak incelendi var . insan kas farklı hücre tiplerinin izolasyonu ve saflaştırılması, böylece kültür hem de hücre tipleri doğal davranışını incelemek için çalışan bir metodolojik bir husustur. Flüoresanslı etkinleştirilmiş hücre tasnif (FACS) hücreleri, ayrıca çalışma için kriteri için kullanılabilecek bir yöntemdir ve / veya sayılarakanaliz edilmiştir. FACS güvenilir insan miyojenik hücrelerini zenginleştirmek için gösterilmiştir, ancak sonraki kültür için hücrelerin verimi bugüne kadar ⁷ yüksek olmamıştır. Böyle yaşlılığında ⁴ ile ilişkili uydu hücre kökenli myojenik hücreler ve çok kötü çoğalması ve farklılaşması gibi somatik hücre sınırlı çoğaltma potansiyeli göz önüne alındığında, daha yumuşak yaklaşımlar gereklidir. Tek kas lifi kültürleri başka, daha az agresif, onların sublaminal niş ve kültür ^8,9 onların aktivasyon sonrasında hala ikamet kemirgen uydu hücreleri elde anlamına gelir sunuyoruz. Ancak, bu tekniğin insan kas-türetilmiş hücrelerin okuyan ilgilenen birçok araştırma laboratuarları için erişilebilir olmayabilir anlamına (lifler nadiren tendon tendon elde edilebilir çünkü) insan kas biyopsisi malzemeden genellikle mümkün değildir. Ayrıca, tek lif tekniği sadece çok sınırlı hücre sayıları sağlar.

Burada gen göre ayrılması bir sistemi tarifTLE enzimatik kolajenaz kullanarak hücrelerin sindirim ve manyetik aktif hücrenin iki ardışık mermi sıralama yüksek saflıkta (>% 95 miyojenik hücre) ve verimle (~ hem de verir (MACS) takip dispaz 2.8 x 10 ⁶ ± 8.87 x 10 ⁵ hücre / Kültürde gerçekleştirilen deneyler g doku). CD56 in situ ¹⁰ ve in vitro ¹¹ insan uydu hücrelerin tanımlanması için altın standart yüzey işaretleyici olarak ve boncuk bağlanması için ideal bir yüzey işaretleyici aday sağlamaktadır. Bu yaklaşımda, CD56 antikorları, demir oksit ve polisakarit içeren süperparamanyetik boncuk güçlü bir manyetik alan ^12,13 yerleştirilen bir yüksek değişim dereceli manyetik bir hücre ayırma kolonu boyunca hücrelere bağlanan ve geçirilir birleştirilir. ayırma kolonları güçlü manyetik alan eğimleri (~ 4tesla) üreten kendi yüzeyine doğru manyetik alan çizgileri odaklanmak hizmet ferromanyetik çelik yün veya demir küre bir matris ile doldurulur ¹⁴. Bu sütunlarda hatta biraz manyetik hücreler çekti ve bunların yüzeye ¹⁴ adsorbe. Ilişkisiz (CD56 ^-) manyetik mikro etiketli CD56 ⁺ hücreleri manyetik alanın ^12,15 çıkarıldıktan kadar korunur ise hücreler sütununda geçer.

Ayırma sürecinin herhangi bir aşamasında elde edilen hücre süspansiyonları ayrıca deney için istenen yoğunluğa kaplama olabilir. Hücresel bileşenler imünosito kullanılarak tespit edilebilir, belirli bir girişim sonra, geniş bir alan veya konfokal floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi ve herhangi bir görüntünün tüm etiketli hücrelerin hızlı amacı ölçümü sağlayan bir görüntü analiz yaklaşımı kullanılarak kantitatif olarak analiz edildi. Miyojenik hücreye iken, insan fibroblastlar kolayca adipositlere transdifferentiate ^- Laboratuarımızda o CD56 göstermek için görüntü analizi ¹⁶ tarafından takip bu çifte immünomanyetik sıralama yaklaşımı kullanmışUydu kökenli lar bu adipojenik dönüşüm ⁵ derece dirençlidir.

Protocol

NOT: laboratuarımızda yapılan çalışmalar için tüm konular katılmak için yazılı bilgilendirilmiş onam verdi ve tüm deneyler İngiltere Ulusal Sağlık Servisi Etik Kurul onayı ile yapıldı (Londra Araştırma Etik Kurulu; referansı: 10 / H0718 / 10) ve uygun İnsan Doku Yasası ve Helsinki Bildirgesi.

1. İlk Hazırlık Kas biyopsisi önce (15 dk)

1. Insan iskelet kası büyüme ortamı olun. Dereceli bir steril 50 ml konik bir tüp daha sonra, iskelet kası, bazal ile 50 ml'ye boruyu dolduracak ek karışımı, 2.5 ml, 10 ml, doğru son konsantrasyonlara cenin dana serumu, antibiyotikler (penisilin / streptomisin) ve glutamin (Tablo 1) ekleyin ortamı.
2. Steril 20 ml konik tüp iskelet kası bazal ortam 15 ml koyun ve tartın. Bir kez yerde buz üzerinde bu tüp tartılır. İnsan kas örneği almak için bunu kullanın.
3. Başka bir 20 ml tüp içinde 10 m hazırlamak2 mg nihai bir konsantrasyona kadar bir kollajenaz Ge ve Dispase II enzim solüsyonu ilave edin / ml iskelet kası bazal ortamda bu enzimlerin stok alikotları çözülmesiyle her. 0.22 um'lik bir filtre boyunca geçirerek, bu çözelti filtre-sterilize edin. 15 dakika ısınması için 37 ° C'de inkübatör ya da su banyosu içinde, bu steril enzim karışımı yerleştirin.
   NOT: Bu enzim karışımı hafifçe tripsin daha nazik ve iyi hücre canlılığı ¹⁷ korur.
4. Bir Petri kabı ve steril neşter bir çift koyun.

2. Kas Biyopsi Prosedürü (45 dk-1 saat)

1. Katılımcıların işe önce, (örneğin, etik, kurumsal, hükümet vb) ilgili tüm yönetim organları, komiteleri ve sağlık sağlayıcıları tam etik boşluk ve (deneyselciler hakkında aşılar dahil) prosedürel onayını.
2. (Steril cerrahi levhalar ile, örneğin) bacak etrafında steril bir alan oluşturun birBir antiseptik antibakteriyel ajan (klorheksidin) ile iyice biyopsi sitenin çevresini temizlemek d.
3. Vastus ve fasya örten deri altı bölgesinde% 2 lidokain lokal enjeksiyonu ile gönüllünün bacağına önerilen biyopsi sitesini uyuşturan kas lateralis.
4. Deri ve fasya ile steril cerrahi bıçak kullanarak ~ 5 mm genişliğinde kesi yapmak ve ek emme ile Bergström iğne biyopsisi işlemi ¹⁸ gerçekleştirin.
5. Steril forseps kullanarak iğne lumeninden kas çıkarın ve buz üzerinde bazal ortamda batırmayın. Canlı miyojenik hücre dönemleri 24 saat veya daha fazla sonra elde edilebilir, ancak en kısa sürede daha fazla işlem için laboratuara doku taşıyın.
6. , Konuyu debrief temizlemek ve bir dış su geçirmez kaplama ile birden steril yapışkan deri-kapama şeritleri ve aseptik elbise ile kesi yerinin kapatılması.

3. Kas-türetilmiş Öncü Ce Ayırmarf (1 saat, 30 dakika)

1. Kas örneği içeren tüp çıkarın ve (emin tüp dokusu ile silerek kuru olduğundan emin olun) tartın. Tek başına ortam ihtiva eden tüp orta ve numuneyi ihtiva eden tüp ağırlığı çıkartılarak kas numunenin ağırlığı hesaplanır.
2. Kan kas örneği yıkamak için çözüme birkaç kez girdap. 30-60 saniye boyunca oda sıcaklığında kas tortu olsun.
   1. İlk elektronik pipet yardımı veya aspiratör kullanılarak, tüpten orta neredeyse tüm hacmi çıkartın ama tüp yaklaşık 2-3 ml bırakın.
   2. Çanak kas örneği taşımak için kalan sıvıyı sağlayan bir steril petri üzerine tüp ters çevirin; Kalan kas yağ veya bağ dokusu görünür bir adet kalan sıvıyı harekete ve bir pipette.Remove ile kaldırmak için çanak fragments.Rotate ayıklamak için steril neşter kullanın.
3. 100-400 mg ağırlığında biyopsi için, ılık 3 ml ekleyinenzim solüsyonu kullanarak steril neşter çok küçük parçalara (<1-2 mm ³⁾ içine kas örneği kesti.
4. Steril 10 ml konik tüp kas parçaları ve enzim çözüm ve transfer hazırlamak geniş bir delik 25 ml pipet kullanarak. Kolajenaz ve dispaz enzim solüsyonu ve daha küçük, 10 ml bir pipet bir tüp içinde kalan kas fragmanları ve yeri toplama kullanılarak bir başka 3-5 ml petri yıkayın. Kesin hacmin önemli değildir.
5. Toz haline getirilir ve 60 dakika boyunca (10 mi pipet) 15 dakika boyunca 37 ° C inkübatör (ya da su banyosu) 'de şişe yerleştirin.
6. 1 saat sonra, taze, önceden ısıtılmış bir büyüme ortamının eşdeğer bir hacmi eklenmiştir enzimatik ayrılma sona erdirmek ve herhangi bir büyük myofibre artıkları çıkarmak için 100 um filtre ile bir hücre süspansiyonu geçmektedir. Oda sıcaklığına (20-25 ° C) 6 dakika boyunca 657 xg'de süzüldü hücre çözümü santrifüjleyin.
7. Kaplanmamış bir büyüme ortamı ve plakanın 5-7 ml hücre pelletini, T-25doku kültürü şişesi. 7 gün boyunca% 5 _CO2 ile 37 ° C'de kuluçka, bu plaka aktarın. Ortam her 48 saat değiştirin. Bu aşamada miyojenik hücre dışı miyojenik hücrelerden ayırt etmek çok küçük, yuvarlak ve zordur.
   1. Birinci ortam değişikliği üzerinde, herhangi bir bitişik olmayan hücreler pellet haline getirmek için yüzer santrifüj. Taze orta ve yeniden plaka bu yeniden askıya.
8. Kültür içinde 7 günden sonra miyojenik (ve fibroblast) en azından çoğu hücrelerinde eklenmiş ama hücrelerin henüz bir araya gelerek konfluens değil emin olun. Myojenik öncüleri arındırmak ve başlangıçta Gherardi ve Chazaud ^19,20 laboratuarlarında geliştirilen ve daha bize ⁵ modifiye bir protokole göre MACS gerçekleştirin.

CD56 İfade dayanarak Hücre 4. İmmunomanyetik Boncuk Sıralama (1.5 saat)

1. Üç değişim ile (genellikle% 50-60 Miyojenik hücreler ⁵ içerecektir) hücre tek tabaka durulama 7 gün sonraOda sıcaklığında fosfat tampon solüsyonu (PBS) ile izolasyon kalan yapışkan olmayan hücreler ile döküntüleri gidermek için.
   1. Hücreler Trypinize (% 0.04 tripsin: Ca 0.73 mM EDTA ile ^{2 +} -serbest PBS) 3 dakika boyunca karıştırınız. Hücreler müstakil sonra, aşırı sindirim önlemek için iskelet kas büyüme ortamının 5-10 ml ekleyin. Sayımı tam ortamda uygun bir hacim içinde, oda sıcaklığında (20-25 ° C) ve tekrar süspansiyon 6 dakika boyunca 657 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri.
   2. İstenen bir yöntem kullanılarak, hücre süspansiyonunun küçük bir örnek Sayısı (örneğin, bir hemasitometre veya otomatik bir sayım cihazı kullanılarak) ve hücre sayısı ve canlılığı başlangıç ​​hesaplar.
2. Immunositokimyasal için bir 96 plaka (gerekirse veya daha büyük kapta) birkaç kuyu Plate ya da öncesinde sıralama nüfusun sitometri tabanlı karakterizasyonu akış (fibroblastlar ve kas hücreleri mevcut en bol hücre tipleri olacak).
3. Hücre süspansiyonu reklamlasteril PBS d 15 mi hücreleri ve orta sulandırmak. Hücrelerin tekrar santrifüj ve tampon ayırma, oda sıcaklığında 170 ul bunları tekrar süspansiyon (bir MACS durulama çözeltisi içinde% 1 BSA, bir 0.22 um filtre içinden geçen yoluyla sterilize edilmiş).
   1. Hücre çözeltisi içine bir CD56 birincil antikor (klon AF12-7H3, 130-050-401) konjuge iyi karıştırılmış manyetik mikro boncuklar 35 ul ekle, pipet karıştırın ve en hafif çalkalama ile 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübasyona bırakmak yarım noktası.
4. Inkübasyondan sonra, MACS 10 ml 6 dakika boyunca 657 xg'de tampon ve santrifüj sıralama hücre ve boncuk çözümü sulandırmak. Tampon sıralama 1 ml hücrelerin tekrar.
5. Standı tutan MACS için MACs ayırıcı (mıknatıs) ekleyin. Nedeniyle güçlü manyetik alana stand mıknatıs eklerken dikkatli olun. Sütununda Yuvası ve ön ayırma filtre takın. Pipet yağlama için ön ayırma filtresi ve sütun üzerinden tampon sıralama 1 ml.
6. Immediately bundan sonra, yavaşça hücre süspansiyonu karıştırın ve Ön-ayırma filtresi aracılığıyla ve kolona tüm 1 ml damla.
7. Tampon sıralama 1 ml (veya 500 ul) ile sütun üç kez yıkayın. Büyüme ortamı küçük bir miktarını ihtiva eden bir steril 50 ml konik bir tüp içinde birinci tür üzerinde sütun içinden geçirmek olmayan tutulan hücreler toplanır. Kesir ve son derece bağ dokusu fibroblastlar için zenginleştirilmiş olacak ^- Bu hücreler ilk sıralama CD56 vardır. Sütun yıkar arasında kurumasına izin vermeyin.
8. Yıkandıktan sonra ön ayırma filtreyi kaldırmak ve kolona MACS tamponu 2.5 ml ekleyin. Sonra hemen mıknatıs sütunu kaldırmak ve sütunun tepesine pistonu basılarak ayrı 50 ml konik tüp ilk sıralama CD56 ⁺ fraksiyonu toplamak.
   NOT: Piston sütunun tepesine çok sıkı oturur ve işletmek için oldukça zor olabilir; sütun hala f iken Ancak, bu yapılmalıdırtampon çekmeyin, bu yüzden hız gereklidir. Piston çok sert ve hızlı karartıcı kaçının.
9. Örneğin kullanılarak hücrelerin canlılığı değerlendirmek kaplama öncesinde, tripan mavisi deneyi. 8 x 1 mm ² sayım alanlarından canlı hücrelerin yüzdesini (hemasitometre iki odaları) belirleyin.
   Not: hücreler gerekli saflığına bağlı olarak kriteri tek veya çift olabilir. Dikkatle yapılırsa bu hücreler çok iyi çift sıralama işlemi tolere ve canlılığı% 95> çok yüksektir. Çift sıralama için, tampon sıralama 1 ml yağlayın ve adım 4.6 yola, başka bir sütun kurmak.
   1. Görüntüleme, 24 gözlü tabaklar ²¹ yer alır ve hücre eki (örneğin, kolajen veya laminin) ECM molekülün seçimi ile kaplı cam lameller doğrudan doğruya levha hücreler gerçekleştirilecek gerekebilir. Burada, 0.1-0.5 mg / ml kolajen I (Tablo 3) kullanın.

Hum 5. SıralamaHemen İzolasyon sonra bir kas kaynaklı Fibroblastlar.

1. Hemen izolasyondan sonra, fibroblast atalarıdır arındırmak aşağıdaki değişiklikler ile yukarıdaki gibi protokolü istihdam için:
   1. Hemen bir kez 100 mikron hücre süzgecinden olsa ve sonra tekrar bir 40 mikron süzgeç olsa tam orta ve filtre izolasyon tekrar süspansiyon hücre sonra. 6 dakika boyunca 657 xg'de PBS ve spin 5 ml.
   2. Tampon sıralama MACS hücrelerin yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 15-30 dakika için Anti-insan fibroblast mikro-içinde inkübe edilir.
   3. LS sütun ve Midi-MACS ayırıcı (Tablo 3) kullanın ve 40 mikron ön ayırma filtresi yükleyin.
   4. Gerekli saflığına bağlı olarak bir ya da iki türlü gerçekleştirmek serum içeren ortama kısa sürede hücreleri aktarmak, bir sayımı gerçekleştirmek ve istenilen yoğunlukta dışarı plaka

6. İmmünositokimyasal Boyama (1 gün ve gece).

1. DüzeltmekHafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca buz gibi soğuk PBS içinde% 8 paraformaldehit eşit hacimde eklenmesiyle kuyulardan hücreler. Ve 10 dakika aspire sabitleyici sonra PBS ile iki kez yıkanır.
2. PBS içinde% 1 sığır serum albümini (BSA), en az 1 saat süre ile hücre yüzey antijenini, hemen blok hücreleri immunostain ve ilgili birincil antikor (Tablo 4) ile prob için.
   1. Hücre içi antijenlere, daha sonra blok ve primer antikorlar ile inkübe,% 1 BSA ve 10 dakika boyunca _NaN3 (% 0.01) PBS içinde% 0.2 Triton-X-100 eklenmesi ile tespit sonra hücrelerin geçirgen. Sallanan bir platform üzerinde yavaşça sallanarak bütün birincil antikor inkubasyon oda sıcaklığında gece boyunca (ya da 4 ° C 'de) gerçekleştirir.
3. Bağlanmamış birinci antikorları ayıklamak ve soğuk PBS ile hücreler üç kez yıkayın. Oda sıcaklığında türe özgü floresan etiketli sekonder antikor ile 1 saat inkübe edildikten (Tablo 4) için inkübe edilir.
4. Çıkarılmasından sonraBağlanmamış ikinci antikorları, PBS üç değişim ile hücrelerin yıkayın ve daha sonra fluoresan DNA boyası Hoechst 33342 (1 ug / ml), bir sallama platformu üzerinde 10 dakika için çözelti ile counterstain.
5. Hücre yüzey antijenleri ve hücre içi antijenlere hem de eş zamanlı olarak görüntülenmesi için, ilk primer antikorlar ile sistemi hücreleri, uygun ikincil antikorlar izledi hücre yüzey antijenlerine. Daha sonra, soğuk PFA, geçirgenliği, blok hücrelerin yeniden çözmek ve uygun ikincil antikorlar izledi sitoplazmik ya da nükleer antijenlere yönelik primer antikorlar ile inkübe edilir.
6. Boyama sonra, kavisli bir forseps kullanarak kuyulardan lamelleri kaldırmak ve distile su kullanılarak lamel arkasını durulayın. Lamel hücresi cam mikroskop lamı üzerine orta ²² set montaj, anti-fade bir damla aşağı doğru kaydırın yatırın.

Hücrelerin immünofloresan boyama ile bağlantılı 7. Yağ Kırmızı O boyamasıyla (2 saat)

1. Açığa vurmak^5,23 - hücrelerin lipid içeriği Yağlı Kırmızı O (([4- (Xylylazo) ksilil] azo) -2-naftol 1) ile boyanarak, 24 hazneli kaplara yerleştirilir. İlk olarak (ağ / hac), Yağ Kırmızı O 60% 99 trietil-fosfatın ml damıtılmış su, 40 ml Yağlı Kırmızı O 500 mg eritilmesi% 0.5 bir stok solüsyonu hazırlanır. Kullanılana kadar karanlıkta, oda sıcaklığında, bu çözüm koruyun.
2. Kullanım gününde,% 36 yapmak 12, Yağ Kırmızı O stok çözeltisi ml damıtılmış su, 8 ml ihtiva eden trietil fosfat çalışma çözeltisi (w / v). Tüm kristalize Oil Red O (hangi görüntü kalitesini bozar) kaldırmak için filtre kağıdı numarası 42 ile bu çözüm Filtre.
3. Yavaşça çözelti, 6 dakika boyunca 1,200 x g hızında döndürüldü, bundan sonra, 1 saat için bir su banyosu içinde, bu çalışma çözeltisi ısıtın. Süpernatantı ve taze 20 ml tüp filtre kağıdı (sayı 42) ve devir yoluyla tekrar süzün.
4. Hücreler, sabit geçirgen ve immunohistokimyasal edildikten sonra, PBS kaldırmak ve Yağ Kırmızı O / Triethyl-Fos 500 ul ekleyin60 dakika boyunca oyuklara phate çözeltisi. Hücre membran geçirgen burada kullanılan konsantrasyonda Triton-X hücre dışı lipit içeriği ²³ etkilemez.
   Not: Yağ Kırmızı O 540 ve 580 nm ve böylece Texas Kırmızı filtre dalga boyu tarafından eksitasyona tabi tutulur ve floresan mikroskobu ^23, Yağ Kırmızı O emisyonu tespit etmek için kullanılabilir. Hücreler çok güçlü (yani, çok yüksek yağ içeriği) lekeli ise Oil Red O floresan emisyon bazen çok kırmızı kanal içine sızıntı olabilir unutmayın.
5. Inkübasyondan sonra, aşırı Oil Red O kaldırmak ve PBS 500 ul hücreleri beş kez yıkayın. Bölümünde hem aydınlık / faz kontrast mikroskobu veya Texas Red filtre kullanarak Epifloresans mikroskobu ile Oil Red O boya Algılama 6. açıklandığı gibi immün gibi lamelleri monte (EX BP 560/40, BS FT 585, EM BP 630 ücretsiz geçiş / 75, Carl Zeiss).

8. sonraki An için Floresan Mikroskopi gelen mikrograflannı alınmasıalysis

NOT: emin olun kantitatif karşılaştırılmasına slaytlar özdeş koşullar (örneğin, maruziyet, kamera ve satın alma ayarları vs.) fotoğraflandı ve aynı mikroskopi oturumunda yakalanan, aynı çözümleri ile boyanır. Tüm alım sonrası biçimlendirme de aynı olması ve dijital görüntüler ²⁴ önerilen kurallara sıkı uygun olmalıdır.

1. Görüntü elde etme (Widefield mikroskopi) için, mikroskop ve floresan ışık kaynağı açmak ve floresan ışık kaynağı ısınmak ve stabilize etmek için izin zaman önerilen miktarda bekletin.
2. Kameraya ışık yolu engelleyerek kamera için karanlık akımı ayarlayın; maksimum çözünürlükte bir görüntü elde etmek ve sonradan edinilmiş görüntüleri düzeltmek için kullanabilirsiniz.
3. Sıvı ışık kılavuzları a (fenilmetil silikon yağı ile dolu floroplastik esnek tüp) tarafından teslim Epifloresans tarafından immunofluorescent probları aydınlatınnd sinyaller, (filtre 45 HQ Texas kırmızı vardiya ücretsiz, yeşil (filtre 44 FITC özel vardiya ücretsiz) ve mavi (filtre ters epi-floresan mikroskop 49 DAPI kayması ücretsiz) bant geçiren filtreler ayarlayın (10X, 20X set kırmızı ile görüntülendi 40X, 0.25, 0.75, 0.95 sayısal delikler sırasıyla) ile apochromatic hedeflerini planlamak.
4. Piksel doygunluk görüntü elde etme yazılımı 'Aşırı pozlama' özelliğini kullanarak her floresan işaretleyici için dedektör lineer aralığında optimum pozlama bulmak önlemek için. Her floresan etiket için standart maruz not edin.
5. Bireysel kanalları Yakalama ve gri tonlama veya yalancı tiff (etiketli görüntü dosyası biçimi) yüksek bit derinliğinde görüntü dosyalarını kaydetmek (tercihen 16 bit - 65.536 gri değerler) kayıt cihazı tarafından sağlanan (örn CCD (şarj birleştiğinde cihaz) mikroskop monte soğutulmuş) . 1388 x 1,040 veya daha yüksek görüntü çözünürlüğü ayarlayın. Bilinen di bir ölçek çubuğu veya nesneyi dahil emin olunResimde Konakları.
6. Mümkün bilgilerin ²⁵ kaybını önlemek için .jpeg formatında 16 bit etiketli görüntü dosyası biçimi (.tiff) dosyaları ve kaydedin.
7. (Bunun için otomatik düzeltme olabilir mikroskop ile birlikte yazılım) aydınlatma düzgünlüğü üzerinde herhangi bir endişeniz varsa hücreleri olmadan lamel bir 'düz alan' görüntü almak ama lekeli ve aynı şekilde deney slaytlar monte; Bu görüntü analizi yazılımı aydınlatma kusurları alım sonrası düzeltmek için de kullanılabilir.
8. Görüntü elde etme (konfokal mikroskopi) için, her görüntüleme deney (doygunluk önlemek) için dedektör kazanç ve lazer gücünü optimize. Genel olarak, ölçülen floresan, lazer gücü seviyesi ile orantılıdır. En iyi sinyal-gürültü oranı elde etmek '1 havadar' ayarlayın iğne deliği boyutu (geliştirilmiş çözünürlük özellikle güçlü sinyaller için 0.5 havadar elde edilebilir). Karınca ile z ekseni boyunca farklı düzeylerde optik bölümleri alınhücreler ibody-etiketlenmiş ve görüntü analizi için, her bir kanal için 16 bitlik bir maksimum çıkıntı kaydedin.

Floresan 9. Sahne Ölçümler Görüntü İşleme ve Analiz Yazılımı (görüş alanı başına 5 dakika) kullanarak Nükleer Transkripsiyon Faktörleri Etiketli.

1. Erişim bireysel tiff görüntü dosyaları ve tıklayarak ve içine başka bir görüntü sürükleyerek bindirme gelen kanalları. Her kanal sonra katmanlar panelinde ayrı bir katman olarak görünecektir.
2. Altında aynı anda görüntülenmiştir için katmanları izin filtre menüsünden hafifletmek seçin. Seçenek olarak ise,% 50, üst tabakalarının opaklığını ayarlayın.
   NOT: Tiff görüntüleri bilgi kaybı olmadan dosya boyutlarını azaltmak için 'kayıpsız' Lempel-Ziv-Welch (LZW) veri sıkıştırma ile kaydedilebilir.
3. Analiz penceresinden (Analiz> seçin Veri Noktaları> Özel) olarak, Densit ortalama Analiz seçin ve ölçümlerinin gerekli (örneğin, Entegre yoğunluğu seçiny dairesellik, histogram vb). Yanlarında kutunun işaretini kaldırarak gereksiz ölçümler atın. Alan ölçümleri Analiz> Ölçüm Ölçeği mikron tıklamayla gerekiyorsa. cetvel aracı otomatik olarak görünecektir - ölçek çubuğunun uzunluğu iz ve mikrometre onun bilinen uzunluğunu girin. Yazılım daha sonra kare mikron içine alan ölçümleri dönüştürür.
   NOT: histogram analizi seçilirse, ölçümler kaydedilir zaman bir ek klasör (bu mikrografta her seçim alanı yanı sıra tüm bireysel seçimleri toplamı 8 bitlik histogramlar ile (seçilebilir olan yerini) görünecektir Birden seçimler yapılırsa her zaman) Histogram-1 olarak görünür. Bu analiz, 16 bit biçiminde yazılım tarafından yapılan, ancak ilgi nesne boyunca piksel yoğunluğunun dağılımının incelenmesi için çok yararlıdır edilemez.
4. Nükleer floresan yoğunluğunun analizi için ilk önce bir Repre oluşturmakHoechst veya DAPI lekeli DNA için vekili 'Renk Yelpazesi Seçimi Maske' (CRSM) nükleer alanı tanımlamak için. Diğer tüm katmanları olmalı iken istenilen kanal görüntüleri üst üste sonra, sadece Hoechst kanal tabakası seçilir katmanları sekmesinde ona bitişik 'göz simgesini' sağlayarak görünümünde bırakılmalıdır ve sonra katman vurgulanır, (maviye döner) seçilmemiştir. Karıştırma açılan katmanları sekmesinde 'Normal' erkene emin olun.
5. Renk Aralığı iletişim kutusunu açın (> Renk Aralığı Seç) ve 'Örneklenmiş renklere' Seçim seçeneği açılan ayarlayın. 'Hızlı maske' (kırmızı arka plan) olarak ayarlanmış seçim önizleme ile ('+' işareti belirir) shift tuşuna basılı tutarak ve görünen göz damlası aracını kullanarak çekirdeklerin içinde tıklayarak çekirdeklerin içindeki tüm mavi renk tonlarını seçin.
   1. İstenmeyen sesleri seçilirse, Alt tuşuna ('─'sign görünür) basarak ve tıklayarak bunları kaldırmakonlara. Sadece elle seçilen renk tonları ölçümüne dahil edilir ve 'yerelleştirilmiş renk kümeleri' denetlenmeyen bırakılması gerektiğini, böylece sıfır bulanıklık ölçeği koruyun.
6. Bir program özgü özü dosyası (.AXT dosyası) olarak bilgisayarın sabit diske bu CRSM kaydedin. Başka bir rasgele çekirdeklerin, yük, güncelleme alanında ve CRSM (Seç, Renk Yelpazesi, Yük) tasarruf ile. Nükleer seçimleri temsilcisi olmasını sağlamak için en az beş rastgele alanlar için bunu yapın.
   1. İnsan gözü gri ²⁶ tonları arasındaki daha rengin farklı tonları ayırt etmek daha mümkün, çünkü özellikleri izole etmek için bir maske oluşturulması için bir gri tonlu görüntünün renkli sürümünü kullanın.
7. Boyama için kademeli bir nükleer bölgelerde nükleer CRSM kullanın. Çekirdekler Görüntü> Ayarlama> Threshold tıklayın seçilir ve sağ kaydırıcıyı tüm yol taşımak edildikten sonra, çekirdekler, siyah gibi döndüğünü. Seçenek olarak ise,sağ tıklayın ve 'Dolgu' sonra seçim 'için doldurun: siyah' seçeneğini seçin. Sonra tüm arka planı kaldırmak için silin şimdi basın Seç> Ters üzerine tıklayın ve (opsiyon seçin görünürse, 'dolgu: Beyaz'). Bu aslında sizin seçiminize dayalı görüntüyü binarizes. Sonra üst üste çekirdekleri (Filter> İkili görüntü> Havza özelliği ayırma) ayırmak için filtreler sekmesinden Havza eklentisi yüklenemedi.
   1. Birçok çekirdekleri ağır örtüşen varsa, bunları seçimini kaldırarak analiz çekirdekleri çıkarın (Alt tuşunu basılı tutun ve gevşek kement aracı ile çevrelerindeki çizin).
8. Şimdi ikili nükleer katmanda, bireysel çekirdekleri seçmek için, Renk Yelpazesi ve> Gölgeler> seçin gidin. Herhangi bir siyah çekirdeğin içinde alternatif tutma vardiya ve tıklatın. Tüm çekirdekler hemen seçilecektir. Sonra bu katman seçerek ve tüm seçimini kaldırarak (örneğin myogenin) nükleer transkripsiyon faktörü boyama içeren tabakasına bu seçimi aktarmakDiğer tabakalar. Yürüyoruz hatları artık myogenin kanalında çekirdeklerin pozisyonunu gösterecektir.
9. Yalancı görüntüleri ile çalışmak Eğer sadece (katmanlar sekmesinin sağ) Kanallar paletinde tıklayın ve sadece yeşil kanal (görüntü artık gri görünecektir) seçin. Sonra Görüntü> Mod> Gri tıklayın. Görünür 'Görünür katmanları düzleştirin ve gizli katmanları atmak' tıklama Tamam olacak bir uyarı, sonra başka bir uyarı diyecekler tekrar OK tıklayın 'diğer kanalların atın'. Gri tonlama seçilen çekirdeklerin Sadece bir tek katmanlı şimdi katmanları paletinde mevcut olacaktır.
   1. Seçilen çekirdekleri için veri elde etmek Ölçü Günlüğü'ne Kayıt Ölçümleri tıklayın. Tabaka analiz edilecek olursa (örn myogenin boyama) zaten o zaman sadece Tutanak Ölçümleri basın ham 16 bit gri tonlama görüntü.
   2. TXT olarak ihracat seçilen ölçümler seçtiğiniz konuma dosya. Bunlar daha sonra daha da işlenir ve diğer veri işleme programı p analiz edilebilirackages
      NOT: Gerekirse Düzen> adım geriye komutu (aynı anda basın Alt, Ctrl ve Z tuşları tümü) önceki tüm katmanları geri yükler.
   3. Spesifik olmayan arka plan floresanı sonuçlar nicel ve floresan yoğunluğu ölçümleri gibi karşılaştırılabilir olması için ²⁷ için doğru zaman sinyal ve arka plan bir karışımıdır.
      1. Kare seçim aracı seçin ve (arzu ve görüntünün hücrelerin confluency bağlı ise veya daha büyük) 20 20 tarafından piksel seçim 'sabit boyutu' kontrol edin. Vardiya görüş alanı boyunca yayılmış on veya daha fazla arka plan alanları seçmek tutarken. Ölçü Günlüğü'ne Basın 'Kayıt Ölçümler'.
      2. (Ölçüm günlüğüne 'demek gri değeri' olarak verilen) 10 Seçilen arka plan bölgelerin piksel başına ortalama entegre yoğunluğu (tüm piksel gri değerleri toplamı) hesaplayın. (Hedef nesnenin piksel sayısına göre piksel başına ortalama arka plan yoğunluğu çarpın Yani, her çekirdek) nesne başına ortalama arka plan vermek.
      3. Nihai arka plan düzeltilmiş değeri elde etmek nesneler, orijinal entegre yoğunluk gelen Çıkar arka plan floresan. Bu yaklaşım, non-spesifik eşiğe alan değişimi potansiyel alan oluşturmaktadır.
         NOT: Bu düzeltme nihai değerler üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu tek iyi niyetli plan bölgeleri seçmek için büyük önem taşımaktadır. Seçimlerinizi yaparken büyüteç kullanarak yakınlaştırma tavsiye edilir.
      4. Ayrıca genel arka plan düzeltilmiş (nükleus başına ortalama gri seviyesi / yoğunluk alarak aynı) piksel çekirdeğin alanına göre değerini entegre yoğunluğu daha fazla katkıda nükleer lokalize arka plan sinyali herhangi bir potansiyel etkisini en aza indirmek için bölmek için yararlı olabilir Nükleer boyutunu (Şekil 3C) artan değeri.

Results

Saflaştırılmış miyojenik hücreleri ve fibroblastlar adipojenez potansiyellerini değerlendirmek için herhangi bir yerde 7-30 arasında gün adipojenik beslenme ortamı, ardından üç gün adipojenik farklılaşma ortam içinde kültive edilebilir. Saflaştırılmış hücre popülasyonu kullanarak, adipojenik ve miyojenik soy belirteçleri için immün ile birlikte Oil Red O boyama sadece fibroblast fraksiyonu adipojenik farklılaşma (Şekil 2) yeteneğine sahip olduğunu gösterdi. fibroblastlar tarafından yağ birikimi büyük çı...

Discussion

Biz kas biyopsi materyalinin küçük örneklerinden insan kas-türetilmiş öncülerinin seçici zenginleştirilmesi için bir immunomagentic sıralama prosedürü tarif var. Bu teknik, fibroblastlar insan kas-türetilmiş kültürlerin kaybı üstesinden gelmek için bizim laboratuvarda çok değerli, ama aynı zamanda kas kaynaklı atalarıdır farklı toplumlarda eşsiz davranışını anlamak için vardır. Bir kez saflaştırılmış miyojenik hücre proteini ve / veya gen ekspresyonunda değişiklikler incelenmiştir ya da alt akış deneyleri için de kullan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kollajenaz  D	Roche
Dispase II	Sigma	D4693-1G	Kullanmadan önce filtreyle sterilize edilmelidir
Tripsin/EDTA(	Gibco) Invitrogen	15400-054
100 &# 956; m hücre süzgeci	BD Biosciences	352360
Kollajen çözeltisi (% 0.1 asetik asit içinde 3 mg / ml)	Sigma, Dorset, UK	C8919
Minisart SRP15 şırınga filtresi (0.2 μ m)	Sartorius	17573ACK	Politetrafloretilen (PTFE) membran
CD56 insan Mikro boncukları	Miltenyi Biotech	130-050-401	Mikro boncukların sınırlı raf ömrünün farkında olun
Anti-fibroblast Mikro boncuklar, insan	Miltenyi Biotech	130-050-601
40 &; m Ön ayırma filtreleri	Miltenyi Biotech	130-041-407
Büyük Hücreli Sütunlar	Miltenyi Biotech	130-042-202	Bu sütunlar bir akış direnci ile birlikte gelir. Burada açıklanan yüksek miyojenik saflıkları elde etmek için akış direncinin kullanılması gerekli değildir.
LS sütunları	Miltenyi Biotech	130-042-401
MiniMacs Ayırıcı	Miltenyi Biotech	130-042-102	Bu ayırıcı büyük hücre sütununa uyar ancak LS sütununa uymaz.
MidiMACS	Miltenyi Biyoteknoloji ve Bilişim Teknolojileri;	130-042-302
MACS multistand	Miltenyi Biotech	130-042-303
BSA	Sigma		Kullanmadan önce filtre sterilize edilmelidir
Yağ Kırmızı O	Sigma	O0625
Trietil fosfat	Sigma	538728
Whatman Kağıt	Sigma	Z241121-1PAK	No. 42, Külsüz. Filtreyi hazırlamak için dairesel filtre kağıdını yarım daire yapacak şekilde katlayın, ardından bir koni şekli oluşturmak için yarım daireyi tekrar ikiye katlayın. Filtrelemek için koniyi bir huniye yerleştirin.
ProLong Altın Antifade Reaktifi	Moleküler Problar, Invitrogen	P36930	Bu, DAPI ile veya DAPI olmadan satın alınabilir ve ilk floresanı söndürmez.
AxioVision	Carl Zeiss	İletişim Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Genişletilmiş	Adobe (Pugh Computers'tan satın alındı)	ADPH16982*