Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Summary

Zebra balığı omurgalı gelişimsel süreçleri ve model insan hastalığı araştırmak için mükemmel bir deneysel organizmadır. Burada, bir ile zebra balığı embriyolarının bir manuel yüksek verimli kimyasal ekran gerçekleştirmek için nasıl bir protokol tarif Okuması in situ hibridizasyon (VVISH) içinde tüm montaj.

Abstract

Zebra balığı nedeniyle insanlarda genetik koruma onların önemli ölçüde yaygın olarak kullanılan bir model organizma gelişimsel biyolojiyi altında yatan mekanizmaların araştırılması ve insan hastalığı patoloji çalışma haline gelmiştir. Kimyasal genetik bir biyolojik süreç üzerinde küçük moleküller olduğu etkisini test etmek gerektirir ve tedavi edici bileşiklerin belirlenmesi için popüler bir translasyonel araştırma yöntemi haline gelmektedir. Zebra balığı, özellikle çünkü dışarıdan döllenmiş olan şeffaf embriyolar, büyük debriyajlar üretme yeteneği kimyasal genetik kullanmak için itiraz ediyorlar. Ayrıca, zebra balığı embriyolar kolayca embriyo ortam bir bileşiğin basit Ayrıca, tedavi edilen bir ilaç olabilir. Kullanma situ hibridizasyon (DİLERİZ) içinde tüm montaj, mRNA ifadesi açıkça zebra balığı embriyolarının içinde görülebilir. Birlikte, kimyasal genetik ve İSTEĞİNİ kullanarak, Zebra balığı hücresel ve fizyolojik belirlemek için güçlü bir bütün organizma bağlam olurKüçük moleküllerin etkileri. Yenilikçi gelişmeler ancak bu tür seçenekleri erişilebilir değildir veya maliyet-engelleyici kalması birçok laboratuvar için, makine-tabanlı tarama prosedürleri kullanan teknolojilere yapılmıştır. Burada açıklanan protokol temel kaynak gerektirir ve zaman verimli bir döneminde tek bir kişi veya küçük bir ekip tarafından gerçekleştirilebilir bir manuel yüksek verimli kimyasal genetik ekranı çalıştırmak için nasıl açıklar. Dolayısıyla, bu protokol gelişimsel süreçleri, hastalık mekanizmaları temel anlayışlar kazanmak için yararlı olabilir, ve tıbben ilgili uygulamalar var yeni bileşiklerin ve sinyal yolları belirlemek için zebrabalıkları kimyasal genetik gerçekleştirmek için araştırma grupları tarafından uygulanabilir uygulanabilir strateji sağlar .

Introduction

Insan hastalıkları tedavi etmek ve etkili terapötik ilaçların tanımlanması çok biyomedikal araştırmacılar için oyunun sonu olduğunu. Klinik uygulamalar için potansiyel farmakolojik ajanların tanımlanması ve karakterizasyonu sağlık için bariz değerine sahipken, bu önemli bir sorun olarak kalmıştır. Sonuç olarak, pek çok terapötik bileşiklerin geliştirilmesi, özel hücre tipleri geliştirmek ya da bir fonksiyon ya nasıl bilgi gelir. Zebra balığı, Danio rerio, gelişimsel biyoloji ¹ bir ana model organizma olmuştur Cyprinidae familyasından bir tatlı su teleost olduğunu. Zebra balığı genetik bilimsel çalışmalara ^2,3 için korumak ve işlemek için kolay uysal omurgalı. Zebra balığı embriyo dışarıdan döllenmiş şeffaftır, ve sadece bir hafta ^2,3 tek bir yetişkin birleşme çiftinden yüzlerce üretilebilir. Ayrıca, zebra balığı payı büyük organ sistemleri ve büyük bir d sahipinsanlar ⁴ de dahil olmak üzere, memelilerde, genetik benzerlik egree. Çarpıcı bir şekilde, insan genlerinin% 70 zebra balığı orthologue ⁴ sahiptir. Bu nedenle benzerlik, zebra balığı omurgalı gelişim ve fizyolojinin mekanizmaları çalışmak için son derece alakalı deneysel sistem olmuştur ve insan hastalıklarının ^5-7 çok sayıda özetlemek için istihdam edilmiştir. Bu nedenler, diğerleri arasında, genetik sorgulamalar devam etmesi için Zebra balığı ideal bir aday yaptık ve biyomedikal araştırmalarda ^6,7 zebrafish programı için giderek artan değerlenmesine sebep olmuştur.

Geçtiğimiz yıllarda, genetik araçları bir bolluk zebrabalıkları geliştirilmiştir. Zebra balığı genom mutasyonlara ve transgenesis ³ elverişlidir. Bugüne kadar, bir ön bolluk ve genetik çalışmalar ters 9.000 mutantlar ^3'ün üretimine yolaçan, yapılmıştır. Ayrıca, çok sayıda transgenik doğrular olması gerekirtr özel hücre tipleri ³ etiketleme ve tecrit edilmesine olanak hangi yarattı. Zebra balığı Uluslararası Kaynak Merkezi (Zirc) ⁸ ile oldukça düşük bir maliyetle laboratuarlar için erişilebilir araştırma toplulukları için bu kaynakları, merkezileştirme ve dağıtmak için devam eden önemli çabalar olmuştur. Ayrıca, biyolojik bilgi ve dizileri ve protokolleri moriblino için gen ekspresyonu arasında değişen moleküler araçlar, geniş bir depo, giderek Zebra balığı Bilgi Ağı (ZFIN) ^9-11 şerh edilmiştir. Bu Zebra balığı araştırma altyapılarının önemli NIH destek ve bu hayvan modelinde ⁸ savunuculuğu yoluyla mümkün yapılmıştır. Zebra balığı mutantlar, transgenik hatları ve ilgili bu bilgi önbellek geniş biyolojik araştırma toplulukları için olağanüstü değer olmaya devam ediyor. Zebra balığı şimdi köklü ve seçkin bir model organizma ise, ancak bunlar a la temsilrgely kullanılmayan rezervuar kimyasal genetik ekranlar aracılığıyla gelişimsel biyoloji ve hastalığı araştırmak için.

Kimyasal genetik bir canlı sistem ¹² içinde biyolojik bir süreci etkiler Bu tür ilaçlar veya diğer bileşikler, küçük moleküller, kullanılmasıdır. Kimyasal genetik aktörlerin bu kurtarma tanımlamak veya belirli bir genetik defekt ¹² azdırmak gibi, gen fonksiyonu moleküler mekanizmalarını anlamak için uygulanabilir. Ayrıca, kimyasal genetiği öteleme araştırma ¹² yapmak için bir büyük yolu temsil eder. Hayvan modellerinde geleneksel ileri genetik ekranlar hastalıklara özgü genleri birbirine bağlayan son derece güçlü olmuştur, onlar zor veya bazen imkansız erken embriyogenezde sonra ortaya çıkacak fenotipleri gözlemlemek için yapım, zamansal bir boyut eksikliği. Ayrıca, gen fazlalık yorumlamak için ileri genetik gözlenen sonuçlar zorlaştırabilir. Alternatif olarak, kimyasal bir genetik ekranlarince zamansal kontrolünü sağlamak ve aynı anda ilaç keşfi ^12,13 için değerli bir başlangıç ​​noktası sağlar.

Kimyasal genetik Bir bütün bir organizma olarak (örneğin, hücre hatları, proteinler), nitro sistemleri kullanılarak ya da bir in vivo sistemi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Kimyasal genetik için in vitro bir sistem kullanılarak, daha az maliyetli olarak büyük ölçekli, üzerinde çalışmak için daha kolay ve bir bütün olarak organizmanın sistemin daha kolay olduğu için yararlı olabilir ve daha az zaman yoğun bir işlemdir. Bunun bir sonucu olarak, in vitro sistemler yüksek verimli tarama (HTS) ve yüksek içeriği tarama (HCS) her ikisi için de izin verir. Ayrıca kimyasal genetiğini yaklaşırken dikkat edilmesi gereken bir in vitro sistemi kullanarak avantajları sayısı, ama önemli sınırlamalar vardır. Bir hücre soyunun kullanılmasını sağladığı en büyük sınırlama küçük moleküller, belli bir hücre soyu içinde, etkili ve toksik-olmayan, ancak yine de tüm organizma içine sokulduğu zaman toksik olabilir olmasıdır. Böylece, dönüm noktasıKonunun in vitro sistemler bir organizmanın geniş bağlamını yakalamak değil ve bu nedenle her zaman doğru, tüm bir organizmanın ne taklit etmek mümkün değildir yönündedir. Bütün organizmalarda bileşik test bu sorunları aşmak mümkün olmakla birlikte, memeli bütün organizma modellerin kullanımı fiziksel ve etik kısıtlamalar bir dizi oluşturmaktadır. Örneğin, fare ilaç tarama lojistik açıdan yeterli örneklem büyüklüğü test etmek için gerekli alanı ve gider tarafından engellenmektedir. Buna ek olarak, gelişimsel sorular nedeniyle memeliler rahimde geliştirmek Aslında, çalışma zor olabilir. Biyomedikal araştırmanın yürütülmesi büyük toplumsal değeri vardır iken Sonunda, yine de yoğun çalışmalar sınırlayıcı ve ağrının hafifletilmesi ve araştırma için kullanılan hayvanların acı ile hayvan refahını korumak için önemli ihtiyaçları vardır. Zebra balığı memeliler gibi yüksek omurgalılar ile çalışan bir canlı ikamesi sağlamak ve ayrıca, birçok konu kimyasal genetiği kullanarak incelenebilirembriyonik ve larva dönemleri nörolojik işleme düşük bir seviyede ^12,13 de absent ya da ameliyat olduğunda.

Terkip bırakma ilgi ^12-15 ilaç içeren ortamda embriyolar daldırılması ile gerçekleştirilebilir Bugüne kadar, kimyasal genetik ekranlar sayısız özellikle zebra balığı embriyoları kullanılarak yapılmıştır. Ayrıca, kimyasal, genetik ekranlar mümkün ve ^16-20 yönetilebilir yapmak için çok sayıda bilimsel ve teknolojik gelişmeleri olmuştur. Peterson ve arkadaşları 2000 yılında bir kimyasal genetik ekranında Zebra balığı kullanmak için ilk olduğunu, daha sonra 2004 yılında Zebra balığı ^21,22 bir aort koarktasyonu mutasyonu bastırılmış bir bileşik tespit edilmiştir. Kimyasal ekranlar beri birçok gelişmekte olan dokuları (örneğin, kalp, kan, damarlar) ^23-25, fizyolojik fonksiyonları (örn, davranış nörolojik temeli), ²⁶ yetişkin rejenerasyon ^27,28, ve hastalığı etkeni incelemek için uygulanmıştır e modelleri (örneğin, kas distrofisi ve kanser) ^29,30. Bu Zebrafish kimyasal ekranlar arasından, prostaglandinler hematopoetik kök hücrelerini düzenleyen keşif "başucunda tanktan" hareket gücünü gösteren, insanlarda klinik çalışmalara alınmıştır ^23,31-33 (NIH, Klinik Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Bu klinik denemelere taşımak yapılmamış olmasına rağmen Daha yakın zamanda, umut veren bir adaydır tedavi, polikistik böbrek hastalığı (PKD), ³⁴ ve akut böbrek hasarı ^27,35 hücresel patoloji düzeltmek böbrek gibi karmaşık organları için ortaya çıkmıştır. Bu kimyasal, genetik ekranlar geniş gelişmekte Zebra balığı ve yetişkin doku işlevini sorgulamak için kimyasal genetik uygulamak için yeteneği küçük bileşenleri test programını göstermektedir. Ayrıca, akademik çalışmalara ¹⁹ için mevcuttur piyasada mevcut farmakoloji koleksiyonları büyüyen bir liste vardır.

Son birkaç yılda ove_content ">, otomatik görüntüleme sistemleri ^36-38 ile birlikte, ilaç dağıtımı ve kullanım için robotların otomatik sistemlerin kullanımı da dahil kimyasal genetik tarama teknolojisi belirgin gelişmeler, olmuştur. Böyle sistemler olasılığına izin bileşiklerin binlerce test hem HTS ve HCS ^36-38 ulaşmak için. Ne yazık ki, bu yenilikçi robotik işletmelerin kimyasal genetik ekranlar taahhüt tipik önemli kaynak gerektirir. kaynakların Bu tür elde etmek için sermaye eksikliği birçok kurum için önemli bir engel vardır plakaları dizilmiş embriyo transferi dahil kimyasal kütüphanelerin robot kullanımı için altyapının oluşturulması ederken, işletmek ve bu tür enstrümantasyon korumak., birçok laboratuvar, otomatik görüntüleme ve analiz için engelleyici maliyeti genellikle daha erişilebilir kalır ^12. Otomatik resim tarama belirlenmesini sağlayan floresan transgenik yenidenTaşıyıcı ve spesifik fenotipik analizi ^12,15 kolaylaştırır.

Otomatik sistemler kullanışlı teknolojik gelişmeleri temsil etse, pek çok soru gibi in situ hibridizasyon (DİLERİZ) okuma ³⁹ bir bütün-mount bir gelişim süreci birkaç bin biyolojik olarak aktif bileşiklerin sorgusu gibi, daha odaklı manuel ekranlar ele alınabilir. Laboratuarları giderek artan sayıda araştırma sorusunu araştırmak için Zebrafish kimyasal ekranlar çağrılan varken Dahası, birkaç çabalar ulaştınız (varsa) doygunluk ve birçok konu kimyasal genetiği kullanarak ihlal edilmesi henüz. Kimyasal ekranları sadece bir kaç vahşi tip veya transgenik tanktan oluşan küçük bir Zebra balığı koloni kullanarak idam edilebilir. Bu nedenle, genetik sorgulama bu formu / genişleyen bu arenaya çeşitlendirilmesi ilgilenen çoğu Zebra balığı araştırma grupları tarafından ulaşılabilir olmalıdır. Değişen boyutlarda kimyasal kütüphaneleri ticari distribütör ve / veya col temin edilebilirlaborators. Bu nedenlerden dolayı, kimyasal genetik de sert fon iklimlerde ekonomik olarak mümkün olabilmektedir. Örneğin, başarılı bir ekran için gerekli personel sayısı, birlikte özel zaman ve ekleme ve tahsis fiziksel protokol manuel işlem örnekleri: Ancak, bu tür ekranın lojistik yönlerini planı nasıl gibi bir kimyasal genetik ekran başlamadan engeller vardır birkaç bin yüzlerce bu rakam. Burada, biz detay manuel yüksek verim protokolü okuma olarak VVISH ile zebrafish embriyo kimyasal genetik gerçekleştirmek için. Bu yöntem, mRNA transkriptlerinin riboprob bulunması ile takip zebra balığı embriyolarının ilaç tedavisi, içerir. Makul süzebilen bu protokolü, küçük bir ekip hatta tek bireysel kullanma ve 9 hafta süre içinde mütevazı bir kimyasal kütüphaneye yaklaşık 600 bileşikleri analiz.

Protocol

Burada anlatılan Zebra balığı ile çalışmak için prosedürler Notre Dame Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Zebra balığı bu kılavuzu küçük molekül ekran için araştırma tasarımı için bir rehber (Şekil 1) sağlanır. Bu protokol açıklanan metodolojileri bir bakış akış şeması (Şekil 2) olarak verilmiştir. Parçaları 4-10 açıklanan embriyo işlem adımlarını planlamak için örnek etiketleme sistemi (Şekil 3) bakınız. Embriyoların evreleme için, Zebra balığı evreleme serisi ⁴⁰ bakın ve Parçaları 9-10 kullanılan DİLERİZ antisens riboprobes hazırlanması için, son zamanlarda yayınlanan yöntemlere ⁴¹ bakın.

Zebra balığı Çiftleşme Odaları 1. Hazırlık

1. Odası bölücü O / N ile ayrılan bir yetişkin erkek Zebra balığı ve bir çiftleşme odasına bir yetişkin dişi Zebra balığı, yerleştirin.
   Not: Kütle çiftleşme, bu tür bir2-3 kadın ve 2-3 erkeklerden kullanarak grup s tek eşli çiftleşmelerin oranla daha fazla embriyolar üretebilir ve uygun boyutlu çiftleşme odalarında ile yapılabilir.
2. Tekrarlayın Adım 1.1 zebrabalıkları 25 çiftinden oluşan bir toplam test edilecek küçük moleküllerin her 96 oyuklu bir plaka için kurulum olacak şekilde.

Zebra balığı Embriyolar 2. Koleksiyonu

1. Ertesi gün, her balık çiftini ayıran bölücü kaldırmak ve 1 saat sonra, bir ince gözenekli süzgeç kullanarak zebra balığı embriyolar toplamak ve E3 embriyo orta (tarifi için malzeme listesine bakınız) içeren bir Petri tabağına yerleştirin.
   NOT: 1 saat embriyolar benzer gelişimsel aşamalarında olmasını sağlar Toplama embriyolar sonra.
2. Enkaz (örneğin, gıda ve katı atık) kaldırmak için bir plastik bir transfer pipet kullanın. Sonra, herhangi bir döllenmemiş yumurta embriyoların her debriyaj gözlemlemek ve kaldırmak için bir skala kullanın.
3. Sonra her di yerleştirmek, E3 embriyo medya Durusu ve taze E3 ile değiştirin28,5 ° C inkübatör embriyo sh. 2 saat sonra bir skala kullanılarak embriyolar her debriyaj gözlemlemek ve herhangi bir döllenmemiş yumurta kaldırmak.
   NOT: döllenmemiş yumurtalar diğer embriyolar zehirleyebilir ve tek bir hücre aşamasında veya opak olmak görünecektir.
4. Onlar epiboly% 40 ulaşana kadar bir skala kullanarak embriyoların gelişimsel ilerlemeyi izlemeye devam. % 40 epiboly aşamada ⁴⁰ iki ayrı tabakadan oluşur görünüyor embriyonun küre şeklini gözlemleyin.

3. Kimyasal Seyreltme Hazırlık

1. -80 ° C'de depolama ile ilgili kimyasal kütüphane plakayı kaldırın alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında da eritin.
   NOT: Farklı kütüphaneler kullanılan çözücü öncelikle bağlı olarak farklı oranlarda çözülme olacak. Tipik haliyle, -80 ° C'de dondurulur, bir kimyasal arşivinde tamamen oda sıcaklığında yaklaşık 3 saat içinde çözülmüş olacaktır. Uygun hazmat etiketleme ile güvenli bir yerde saklayın çözdürme plaka (lar). Wearppropriate gözlük, laboratuvar mont ve eldiven iki takım kimyasal maddeleri kullanırken.
2. Sütun 96 oyuklu bir plaka 2-12 içine E3 99 ul eklemek için 8 kanallı çok kanallı pipet kullanın.
   NOT: Bizim deneyim, uygun bir başlangıç ​​ilaç aralığı iM 10 arasında - güncel protokoller ^39'da açıklanan 50 mcM ve aynı zamanda. 1 mM kimyasal kütüphane stok plaka kullanarak eğer burada bir 10 mcM tavrını göstermiştir.
3. E3 ile ilgili oyuğuna her bileşiğin 1 ul ekleme 8 kanallı çok kanallı pipet kullanın.
4. (Burada, kolon 12), kontrol kolona 1 DMSO ul (ya da uygun bir çözücü) pipetle bir P10 kullanın.
5. Alüminyum folyo kütüphanede herhangi bir ışık-duyarlı bileşiklerin korumak ve stok kimyasal kütüphane plaka döner gibi, alüminyum folyo ile kimyasal seyreltme plaka Kapak -80 depolama için ° C.

4. arraying Zebra balığı Embriyolar

1. Petri seçin% 40 epiboly aşamada Zebra balığı embriyoları içeren. Bir transfer pipeti kullanarak, dikkatli bir şekilde (1.1 mL) her bir oyuğuna, derin 96 oyuklu bir plaka içinde yaklaşık olarak 10 embriyo yerleştirin. Sütun derin bir 96 gözenekli plakanın 2-12 içine embriyolar koyun.
   NOT: araştırmacı onlar için en iyi sorgulamak isteyen gelişim sürecine uyarlanmış ilaç ekleme zaman noktası seçmelisiniz. Plastik bir transfer pipet kullanılması embriyo hasarı en aza indirebilirsiniz. Ilaç tedavisi öncesinde% 40 epiboly Artan embriyo öldürücülüğe yol açtığından, sonraki gelişim süreçleri incelenmektedir, özellikle de daha önce ilaca maruz kalma için embriyolar geliştirir. Her kuyuda birden fazla 15-20 embriyoların yerleştirilmesi nedeniyle kalabalık ve kaçınılmalıdır gelişimsel gecikme neden olabilir. Bu, embriyoları içeren Derin 96 çukurlu levha kimyasal dilüsyon 96 plaka farklı olduğuna dikkat etmek önemlidir.
2. Içine fazla E3 her kuyudan aşırı E3 kaldırmak ve çıkarmak için bir cam transfer pipet kullanınbir sıvı atık konteyner.
   Not: Bu işlem, tipik olarak, bir araştırmacının hızına bağlı olarak, 30 dakika ile 1 saat sürer, böylece embriyolar burada tarif edilen kimyasal seyreltme ilave edilmesi için, hedef gelişim aşaması tamamlandıktan sonra,% 50 ve% 60 epiboly arasındadır. Plaka pipet ucu fazla E3 dışarı çekilmesi için kuyunun dibine karşı bastırılabilir, böylece embriyolar kuyunun altına düşmesi için bir 45 ° 'lik açıyla eğilebilir.

Kimyasal Uygulamaların 5. eklenmesi

1. Dizilmiş zebrabalıkları embriyoları içeren derin 96 oyuklu bir plaka içerisinde, ilgili oyuklara 100 ul kimyasal seyreltmeleri aktarmak için bir kanal 8 kanallı pipet kullanın.
   Not: bileşimin orijinal de yer gelen derin bir 96 oyuklu bir plaka (örneğin, kimyasal Seyreltme levhası içindeki B1 de yer derin B1 de konuma pipetlenir içinde iyi konumu ile aynı olduğundan emin olun96 gözlü plaka) eritin.
2. Bir kağıt havlu ıslatın ve 96 oyuklu bir plaka tutmak için yeterince büyük, ışığa duyarlı bir kap içine koyun.
   NOT: ıslak kağıt havlu kimyasal seyreltme buharlaşmasını önlemek yardımcı olacaktır.
3. Sonra, derin 96 plaka sızdırmaz ışığa duyarlı bir kap içine koyun ve 28.5 ° C 'de inkübe etmek, bir sızdırmazlık mat kullanın.
   NOT: Zebra balığı embriyolar ertesi sabaha kadar geliştirelim. Alternatif olarak, işlem için uygun bir gelişim aşaması analiz edilen kadar embriyoların gelişmeye bıraktı.

Kimyasalların 6. Kaldırma

1. İlaç tedavi kuyuların her satır için E3 300 ul eklemek için 8 kanallı çok kanallı pipet kullanın. Kapalı çizin ve kuyuların her satırdan E3 / kimyasal seyreltme atın. E3 300 ul embriyolar 3 kere yıkayın.
   NOT: Bu amaçla sadece kullanılan etiketli bir konteynıra ilaç-atık atın. Yıkama kolaylığı için, mult kullanmak için yeterince geniş E3 ile dolu bir cam lavabo kullanımıichannel pipet.

7. Pronase ve Zebra balığı Embriyolar Sabitleme

1. Dört 24 kuyu tabak içine plastik bir transfer pipet kullanarak Zebra balığı embriyolar transfer, daha sonra herhangi bir ölü embriyolar kaldırmak. Bunlar orijinal ilacın iyi konumlarına karşılık gelecek şekilde, 24 gözlü plakalar etiketleyin. Pipet embriyolar görselleştirmek ve embriyo iyi geçit önlemek için her iyi transferinden sonra karanlık bir arka plan önünde pipet yerleştirin.
2. Embriyolar ancak sıvıya böylece E3 kapalı çekmek için plastik bir transfer pipet kullanın.
3. Her bir oyuğa Pronaz stoklar 2 damla (50 mg / ml) eklemek için bir cam pipet kullanın. Embriyolar kuyular koryon bozmaya neden ajite sonra 5 dakika Pronaz inkübe ve edelim. Analiz için istenilen gelişimsel aşamada gelmeden önce Seçenek olarak ise, embriyolar Pronaz.
4. E3 ile iki kez embriyoların yıkamak için plastik bir transfer pipet kullanın.
5. Embriyolar analizi, kompozisyonunun istenen aşamada Bir kezletely kapalı çizmek ve kalan E3 atın.
6. Her kuyuya taze% 4 PFA / PBS eklemek için plastik bir transfer pipet kullanın. 4 ° CO embriyolar kuluçkaya / N düzeltmek için. Kullan taze başlangıçta embriyoların düzeltmek için PFA çözülmüş.
   NOT: ilgi ekran deneyini gerçekleştirmek için devam edin. Bölüm 8-10 Burada Ayrıntılı VVISH ile ekran plakalarını işlemek için bir işlemdir. Alternatif uygulama metotları, isteğe göre, daha sonra, Bölüm 11 devam etmek ve sonuçlarını değerlendirmek ikame edilebilir.

8. Embriyo Permeabilization

1. Çizmek-off% 4 PFA / PBS embriyolardan bir plastik transfer pipet kullanın ve 1x ile iki kez embriyolar yıkayın PBST (Tween ile tuzlu Fosfat tamponlu). Sonra embriyolardan 1x PBST kapalı çizmek, 48 tabak içine embriyolar aktarın. Derin 96 çukurlu bir levhanın asıl iyi konumları uyacak şekilde 48 oyuklu plakalar etiketleyin.
2. Kapalı çekmek ve% 100 metano eklemek daha sonra plastik bir transfer pipeti kullanılarak çukurlara% 100 metanol ilave edilerek yıkayınembriyoların tekrar l.
3. -20 ° C'de embriyolar yerleştirin ve en az 20 dakika inkübe edilir. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için -20 ° C'de% 100 metanol embriyolar tutun.
4. % 100 metanol çıkarın ve% 50 MeOH / 1 x PBST, sonra% 30 MeOH / 1x PBST ile embriyolar yıkama ve son olarak da iki kez 1 x PBST ile.
   NOT: Embriyolar daha eski 24 saat sonra döllenme (hpf) pigmentasyon ³⁹ kaldırmak için bu noktada ağartılabilecektir.
5. Proteinaz K (5 ug / ml) çalışma çözeltisi hazırlamak için 1x PBST, 50 ml eritilmiş proteinaz K stoğu (10 mg / ml) 15 ul ekle.
6. Embriyolardan 1x PBST çıkarın ve proteinaz K çalışma çözüm ekleyin. 4 dakika sonra, proteinaz K çıkarın.
   NOT: deneyci embriyo bozulmasını önlemek için bu adımı sırasında hızlı çalışması gerekir. Proteinaz K konsantrasyon ve kuluçkalama süresi ^41, tedavi edilen embriyoların yaşına bağlı olarak değişebilir gerekmektedir. Burada açıklanan parametreler embriyoların ilgilendirmeyen24 hpf olduğunu.
7. 1x PBST ile embriyolar yıkanır, daha sonra buz soğukluğunda% 4 PFA / PBS ilave edin. Embriyolar, oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 PFA / PBS içinde inkübe edin.

9. Hibridizasyon ve Probe Kaldırma

1. Cam bir transfer pipeti kullanarak,% 4 PFA / PBS kaldırmak ve 1 x PBST ile iki kez embriyolar yıkayın. HYB ⁺ 500 ul 1 x PBST yerine 70 ° C de 4 saat süreyle inkübe embriyolar.
   NOT: Ön hibridleme en az 2 saat süre ile yapılabilir, ancak 4 saat idealdir. Aynı zamanda, farklı hibridizasyon ve yıkama sıcaklıkları, örneğin 65 ° C gibi belirli bir prob için ideal olabilir, fakat bireysel olarak test edilmelidir.
2. İlgi ^41'in gen (ler) ine tekabül dioksijenin-etiketli riboproblar oluşturur.
3. HYB ⁺ 16 ml riboprob'un 16 ug ekleyin. Kullanmadan önce en az 20 dakika süreyle 70 ° C 'de riboprob / hyb ⁺ çözeltisi önceden ısıtın. Birden fazla prob kullanıyorsanız, aynı H her sonda 16 ug ekleyinYB ⁺ hacmi (16 mi).
4. Bir cam transferi pipet kullanarak, HYB ⁺ kaldırmak ve riboprob / HYB ⁺ karışımının 200 ul eklemek için P1000 kullanın. Kullanımı ve pipetle hemen önce ve aşağı bir kez her kuyuya karışımı eklemeden önce riboprob / HYB ⁺ kokteyl ters çevirin. Riboprob / HYB ⁺ çözüm eklemek için pipet uçları kullanın, bu pipet girmesini karışım buharı önler.
5. 70 ° de CO / N oranında riboprob / HYB ⁺ kokteyl embriyolar inkübe edin. O / N prob inkübasyondan ve takip eden sıcak yıkama için tüm plaka kuyuları kapsayacak şekilde bir yapışkan film kullanın.
6. 70 ° CO / N% 50 formamid / 2x SSCT, 2x SSCT ve 0.2x SSCT ve ön-sıcak hazırlayın.
7. P1000 kullanarak, riboprob / hyb ⁺ çıkarın ve -20 ° C'de karışım saklayın. İsteğe bağlı olarak, üç kata kadar riboprob / HYB ⁺ karışımını yeniden kullanın. Her bir tekrar kullanım öncesinde, orijinal ribopr için riboprob'un 3 ug eklemekObe / HYB ⁺ karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
8. Cam bir transfer pipeti kullanarak, 70 ° C'de 30 dakika boyunca% 50 formamid / 2 x SSCT ile iki kez embriyolar yıkayın. 70 ° C'de 15 dakika boyunca 2 x SSCT ile bir kez embriyolar yıkayın. 70 ° C'de 30 dakika boyunca 0.2x SSCT ile iki kez embriyolar yıkayın. 0.2x SSCT çıkartın ve oda sıcaklığında iki kez MABT ile embriyolar yıkayın.

10. Anti-dioksijenin Antikor Kuluçka ve Algılama

1. Her kuyudan MABT kaldırmak için cam bir transfer pipeti kullanarak. Plastik bir transfer pipeti kullanarak, her bir oyuğa taze blok çözeltisi ekleyin. Embriyolar, oda sıcaklığında 4 saat boyunca blok inkübe edin. Blok çözeltisi (5.000-kat seyreltme) 40 ml anti-digoksijenin antikoru 8 ul ekleyin.
2. Plastik bir transfer pipeti kullanarak, antikor / blokaj çözeltisi ile blok çözeltisi değiştirin. Tamamen embriyolar karşılamak için yeterli antikor / blokaj çözeltisi ekleyin.
3. Işık embriyoların kadar nüfuz edebilir böylece, alüminyum folyo ile 48 oyuklu plaka örtün. Inc4 ° C'de embriyolar O / N Ubate. Bir cam pipet kullanılarak, antikor / blok çözelti varsa onun çıkması ve 5-10 dakika her biri için embriyolar MABT ile 10 kez yıkanır.
   Not: kuyu taze MABT Her levhadan MABT çıkarın ve dağıtım için gereken araştırmacı, 5-10 dakika sürer olarak MABT yıkama sıvıları, sürekli gerçekleştirilebilir.
4. Ön-lekeleme tampon maddesi, 40 ml (80 ml toplam) hazırlandı ve iki boruyu oluşturmak. Boyama çözeltisi oluşturmak için ön boyama tamponu hazırlanmış boruların birine NBT 180 ul (50 mg / ml) ve BCIP 140 ul (50 mg / ml) ilave et.
   NOT: Bu boyama çözüm mor renkli bir alt tabaka oluşturur.
5. Ön-lekeleme tampon maddesi ile MABT yerine ve embriyolar 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
6. Boyama solüsyonu ile ön boyama tamponu yerine getirilmekte ve oda sıcaklığında bırakın. Kolorimetrik reaksiyonlarıyla ilgili bir skala kullanılarak her 15 dk izleyin.
   NOT: Boyama reaksiyonlar prob bağlı olarak birçok saat için birkaç dakika sürebilir.
7. TemsilciSteyn etme reaksiyonu tamamlanır ve daha sonra 5 dakika boyunca 1 x PBST ile iki kez embriyolar yıkamadan sonra 1 x PBST ile boyama çözeltisi katmaktadır.
8. 1x PBST çıkarın ve embriyoların düzeltmek için% 4 PFA / PBS ekleyin.
   Not: Alternatif olarak, bir anti-floresin bir antikor ile işaretlenmişlerdir riboproblar tespit edilmesi için bir çift İSTEĞİNİ gerçekleştirin. Ayrıca, yerinde bir çift performans sonra, 1x PBST ile yıkama (Aşama 10.8) sonra,% 4 PFA / PBS (Adım 10.9) ilave atlayarak MABT yıkama ile 15 dakika boyunca iki kez, 0.1 M gliserol ile 15 dakika boyunca iki kez embriyolar yıkayın ve blok 30 dakika boyunca embriyolar inkübe edin. Sonra doğru boyama çözüm kullanarak Adımlar 10,3-10,9 doğru antikor O / N eklemek ve gerçekleştirmek. , Fluoroscein-etiketli riboprob'un algılamak kırmızı tabakayı gözlemlemek BCIP'den ve INT ile bir boyama çözeltisi hazırlamak için (10,1 Adım bakınız).

11. Puanlama Kimyasal Ekran Embriyo Tabaklar

1. Embriyo sampl değerlendirmek için bir stereo mikroskop kullanarak sonuçların görsel puanlama yapınfenotip tahlilinde es.
2. Plastik bir transfer pipeti kullanarak, uygun görselleştirme için 12 kuyulu levhalara 48 gözlü levhalar embriyolar aktarılır. Bunlar orijinal Derin 96 gözlü levhadan de konumlara karşılık gelecek şekilde 12 gözlü levha üzerinde etiketleyin. Aktarımı tamamlandığında, stereo mikroskop altında görmek.
   NOT: Temsilcisi embriyolar 12 plakadan seçilmiştir ve bir kapak kayma ⁴¹ altında cam slaytlar üzerinde görüntülü olabilir.

Results

Burada anlatılan manuel yaklaşım verimli ve başarılı bir küçük molekül kimyasal genetik Zebra balığı embriyo modeli (Şekil 1) kullanılarak ekran yüksek verimi yapmak için tek bir araştırmacı için izin verir. Tek bir kişi bir kimyasal genetik ekranı gerçekleştirmek için bu yöntemi kullanarak, 9 hafta boyunca bir kişi (40 saat çalışma haftası taahhüt) ~ 600 bileşiklerin bir anket yapabilir ki, bu tür pratik (Şekil 1) . Böylece, bir kişinin tezgah zaman yüksek kaynak gerektiren ekipmanları gibi otomatik sistemler için ihtiyaç atlayabilir. Ticaret-off manuel ekran özel çaba birkaç hafta gerektirir. Buna karşılık, otomatik sistemlerin kullanılması robotik zaman 1-2 hafta içine dahil zamanı sıkıştırabilir ve genel nispeten az araştırmacı çaba gerektirebilir. Manuel ekran verimliliği ve / veya kapsamını artırmak için bir yolu m tarama sağlayacak olan, toplam 2-3 araştırmacılar askere olduğunucevher bileşikler, çeşitli bileşik konsantrasyonu ve / veya daha kısa bir süre boyunca taranması.

Bir DİLERİZ okuma ile zebra balığı embriyolarının bir kimyasal genetik ekran tamamlamak için protokolde yer alan başlıca adımlar akış şeması (Şekil 2) olarak gösterilmiştir. (1) kimyasal maruz kalma ve embriyo etiketleme, ve (2) analizi ve görüntüleme: Deneysel görevler çalışma haftası iki tipe ayrılabilir. Kimyasal maruziyet çalışma haftası, bu adımlar Gün 4 ((Gün 3) in situ hibridizasyon için embriyolar hazırlanıyor, zebra balığı yetişkin (Gün 1), embriyo toplama, arraying embriyolar ve ilaç tedavisi (Gün 2) kurma ve in situ hibridizasyon dahil -6). Analiz / görüntüleme hafta, araştırmacı embriyolar ve görüntü hit (Gün 7-11) puan mRNA analizleri.

Bir kimyasal genetik ekran performans kritik bir parçası tutarlı ve doğru iyi yerleri nitelemektedir. Kimyasal genetik ekran proses farklı bir tabak içinde bir iyi bir plaka bir kuyudan birden çok kez embriyoların setleri transfer içeren bir kimyasal hit atılırsa zaman doğrusal ve kolayca geri izlenebilmektedir olabilir, böylece kesin ve net etiketleme için ihtiyaç fevkalade burada ayrıntılı kimyasal kütüphane içinde kendi kimliğinin (Şekil 3). Bunu sağlamak için kolay bir yol, herhangi bir zamanda, bir bileşik ile tedavi edilen embriyo bir dizi için de yere doğrudan bu embriyolar tedavisinde kullanılan bileşiğin kimyasal kütüphane ilacın plakası tam konum ile eşleşen bir şekilde levhaları etiket (Şekil 3). Burada, renk-kodlama ve sayısal bir etiket ikili sistem sürekli işaretlerini (Şekil 3) kullanılarak ekran plakalara ilave edildi örnekleri, düzenlemek için kullanılmaktadır.

Bir yüksek girdi boyunca araştırma sonuçlarını analiz edilirken, bir metot doğru düzenlemek için geliştirmek açıklama ve olası küçük bir molekül analiz etmek için önemli bir ihtiyaç vardırhit. Bu nedenle, kimyasal genetik ekranı dikkatle tasarlanmış ve sıkı bir şekilde uyulmaktadır kapsamlı ve net bir sınıflandırma sistemi olmalıdır. Böyle bir sistem, kolay ve tamamen bir bileşiğin önemli dinamikleri ifade ve bitmiş ekranın sonuçlarını sunmak için kısa bir yol vermelidir. Böyle bir sistemi inşa etmek için bir yolu genel morfolojik ve şiddetini bir hit güvenini açıklıyor bir sınıf sistemi kullanılarak sınıf embriyoların etmektir. Bundan başka, Sınıf kategoriler ile bağlanmış olabilir, bir ⁽⁺⁾ veya ^(-) ilgili bölge (ler), geniş bir veya indirgeyici bir etki ya da tanımlamak için kullanılır. Burada, zebra balığı embriyolar 24 HPF% 50 epiboly bir biyoaktif kitaplığı (Enzo Chemicals) ile ilgili münferit bileşiklere tabi tutuldu ve daha sonra nefron segmentleri (Şekil 4A) tespit etmek için, üç riboprobes bir kokteyli WISH analiz edilmiştir. Bir örnek derecelendirme sistemi, büyük ölçüde büyütülmüş proksimal convolu sahip embriyo bir grup ihtiva eden bir oyuk Adıpronephros ve ted borucuk (PCT), Zebra balığı embriyonik böbrek, o da bu durumda en ağır kusuru ile ilişkili sınıf ve en üst düzeyde temsil edecek (Sınıf I), olarak kategorize ediliyor tedavisinde kullanılan bileşik neden olur (Şekil 4B) gözlenen fenotipin güven. (Şekil 4B) - bileşik daha sonra (PCT) ve a ^(+), ve böylece komple gösterimi (PCT ⁺ Sınıf I) açıklamalı olacaktır. Bu sınıflandırma anlayışı, ilaç ve bir bölümü olan bir şekilde etkilenen bölge olan bir organizma ile ilgili bileşiklerin etkisinin şiddeti de dahil olmak üzere ilgili bir küçük bir molekül ile ilgili bilgi bir hazinesi tanımlamak için basit ve hızlı bir şekilde Etkilenen (Şekil 4B).

Şekil 1. & #160;. Manuel Zebra balığı embriyosu kimyasal ekran stratejisi bir araştırmacı fizibil zebra balığı embriyolarının kimyasalların bir 96 plaka sınamak ve bir tek hafta boyunca sonraki DİLERİZ işleme gerçekleştirebilirsiniz. Kimyasal testler (Hafta 1 (Gün 1-6) ve Hafta 2 (Gün 7-12)) iki hafta Sahne analizi örnek adanmış bir üçüncü haftasında ile eşleştirilmiş olabilir. Yaklaşık ekran örneklerin değerinde iki 96 sıra tabak Hafta 3 (Gün 13-17) attı ve görüntülü olabilir. Bu senaryo tamamen 9 hafta ile taranmıştır yaklaşık 600 bileşiklerin küçük bir kütüphane denk, 3 haftalık bir süre içinde yaklaşık 200 bileşiklerin taranması tekabül etmektedir. Bu kılavuz strateji mevcut kaynaklara bağlı olarak değiştirilebilir. Örneğin, üç araştırmacılar, bir araştırmacı ile alacağını 9 haftalara göre 3 hafta yaklaşık 600 bileşiklerin bir ekran tamamlamak için zamanı azaltabilir. Tarama stratejileri gibi ilaç tedavi olarak ekranında belirli yönleriyle araştırmacıları atayarak adapte edilebilirment ve in situ hibridizasyon veya araştırmacıların yönetmenlik bağımsız kimyasal kütüphanesinden ayrı parçalar üzerinde tüm tarama işlemini gerçekleştirmek için.

Şekil 2. Akış Şeması:. 6 gün ekran iş akışının dökümü kimyasal tarama süreci Discretely 6 gün aşağı kırılmış olabilir. 1. Gün her bir 96 oyuklu plaka taranması için embriyolar tedarik zebra balığı çiftleşme çifti (= /> 25) ayarlama oluşur. Gün 2, ilaç tedavisi ile, ardından birleşme odalarından embriyolar toplanması ve derin bir 96 oyuklu bir plaka içerisinde, onları düzenlenmesiyle ilgilidir. Gün 3, embriyolar Dechorionation, doku fiksasyonu ve embriyo dehidratasyon dahil VVISH için hazırlanmıştır. Son olarak, DİLERİZ Gün 4-6 ile embriyolar üzerinde gerçekleştirilir. S kolayca olabilir sabit örneklerde olduğu alternatif boyama işlemleri unutmayınWISH ubstituted.

Şekil 3. Plaka Transfer etiketleme şeması. Balığı embriyo dizilir ve madde, 96 oyuklu bir plaka içerisinde işlemden sonra birikintileri çıkarmanın ve Pronaz maruz kalma, bir 24 yuvalı plakaya taşınır. Embriyolar, embriyo hazırlanması, VVISH ve doku tespiti için 48 iyi plakalar taşınır. Daha sonra, embriyolar puanlama, görüntüleme ve depolama için 12 oyuklu plakalara transfer edilir. Embriyo kesin arraying her test numunesi için menşe kimyasal izlemek için araştırmacı sağlar bir renk kodlama sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. Örnek derecelendirme sistemi. Böbrek segmentasyon analizi Bir ​​DİLERİZ deney mRNA transkripsiyon konumda değişikliklere göre embriyo fenotipleri değişikliklerin değerlendirilmesini sağlayan, seçilen prob kimliğine dayalı özel hücre tipleri leke araştırmacı sağlar ve / veya seviyeleri. Bir örnek olarak, zebra balığı, cenin böbreğinin üç segment, pronephros, ekran Karışım 1. Ekran Karışım 1 spesifik Podositler (P) lokalize wt1b oluşan probların bir kokteyl ile dolaştırılmış proksimal işaretler slc20a1a etiketli Distal erken (DE) segmenti ⁴⁷ etiketler borucuk (PCT), ve slc12a1. ^(-) Sembolü bir bölgenin azalmasını dikte için kullanılan bir süre A ⁽⁺⁾ sembolü bir bölge etiketinin yanında, genişleme ya da o bölgenin pozitif kayma açıklama için kullanılır. İşte, em13-cis RA ile tedavi bryos ilaç büyütülmüş proksimal dolambaçlı tubule ve Podositler üzerinde hiçbir belirgin etkisi ile distal erken segmentinde tam bir kaybı var. Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Zebra balığı kimyasal genetik ilaç keşif ilerlemesi üzerinde kritik bir etki yapabilir. Bu protokol etkili bir küçük molekül ekran yapmak için bireysel ya da küçük bir ekip sağlayarak, bir DİLERİZ okuması ile zebra balığı embriyolarının kimyasal genetik gerçekleştirmek için bir manuel yüksek verimli bir yöntem sağlar. Bu minimal kaynak yöntem birçok araştırma gruplarına kimyasal genetik fizibilite uzanır. Bu tür sistemleri genel olarak araştırma bölümleri genelinde erişilebilir değil Spesifik olarak, bu ekran strateji, robotik aletlerin kullanımı önemli bir alternatif sunuyor. Bu kılavuz ekran tek bir bireyin bir 6 günlük bir çalışma haftası bir DİLERİZ okuma ile bileşiklerden biri 96 plaka test etmenizi sağlar. Zebra balığı beri embriyolar ebeveyn dışında gelişen, yumurtlayarak çoğalan, ve embriyolar, onlar manuel basit enstrümanlar ile kullanım ve araştırmacı can dizi numuneler için müsaittir (mm 1-3 arasında) çıplak gözle görülebilecek kadar büyükBir mikroskop kullanmadan, çok-yuvalı plakalar. Zebra balığı hızlı bir şekilde gelişir çünkü Dahası, küçük molekül maruz daha sonra manuel olarak işleme en aza indiren bir bileşiğinin tek bir tedavi yerine tekrarlanan dozları ile etkili olabilir. Onların sarısı besleme yavru komplikasyonu ortadan kaldırır 5-6 gün gübreleme, için beslenme kadar bir kaynak sağlar, çünkü balığı embriyolar kolayca kültürlü. Ayrıca, larva organlarının çoğunluğu gelişmiş ve araştırma sorularına geniş bir dizi çalışma fırsatı sağlayan bu dönemde, içinde işlevsel hale gelmiştir. Embriyo kültür ortamına küçük moleküllerin basit bir ek non-invaziv ve araştırmacı (lar) ilaç dozu seçmek için, ilave zamanı ve süresi sağlar poz böylece birçok değişkenler üzerinde sıkı bir kontrol sağlamak ve belirli gelişim süreçleri için izin ilgi sorgulanacak. Burada tarif edildiği gibi, önemli bir araştırma, verimlilik kısa timefr elde edilebilirBu manuel ekran metodolojisi kullanılarak ame. (;, Yayınlanmamış Poureetezadi ve Wingert Şekil 4) Bizim tecrübelerimize göre, bu tür böbrek gelişimi sırasında nefron segmentasyonu gibi ilgi, bir süreci analiz etmek için bilinen bir biyoaktif kimyasal kütüphane kullanılarak vurgulanabilir yatırım çaba yüksek geri dönüş vardır.

Sabit Zebra balığı örneklerinde bir tahlil içerir çünkü burada anlatılan manuel kimyasal ekran son derece çok yönlüdür. Örneğin, bu strateji bir hafta içinde bileşiklerin bir çok test plakalarına revize edilebilir ve daha sonra bir hafta embriyolar skoru. Örneğin immünohistokimyasal ya da diğer doku boyama preparatları olarak sabit zebra balığı örneklerinde alternatif deneyler, aynı zamanda WISH okuması için ikame edilebilir. Deneysel stratejiler zebrabalıkları hücresel analizler nedeniyle erken gelişim evrelerinin optik netlik ve şeffaflık uyarlanabilir gerçekleştirmek için. Bundan başka, araştırmacılar daha sta de pigmentasyonu engelleyebilenges kimyasalları kullanmadan tamamen casper veya sırf zebrabalıkları ¹³ gibi pigment az genetik hatlarının kullanımı yoluyla pigment gelişme komplikasyonu önlemek. Bu, elle küçük moleküller yönetmek mümkün olduğunu ilgi leke (ler) işlemek, ve elle basit bir skala kullanılarak embriyolar puan. Bununla birlikte, otomatik görüntü analizi gerçekleştirilebilir ki akılda tutmak önemlidir ve aslında yüksek çözünürlüklü fenotip analizi için gerekli olabilir. Bu, örneklerin manüel işlem yapabilme çıplak gözle kolaylıkla ayırt edilebilir değildir farklılıklar rakamlarla ve araştırmacı önyargı ¹⁵ ortadan kaldırdığı için, örneğin, bu gibi bir transgenik muhabir olarak ortak doğrudan bir test ile otomatik bir görüntü analiz sistemi için tercih edilebilir. Neyse ki, bazı otomatik görüntüleme sistemleri kullanıcı dostu hem de yazılım maliyetleri ¹⁵ açısından ve ekonomiktir. Kullanımı ve diğer otomatik sistemlerin yetenekleri hızla geliştiğini ve can varorganizmaların ^12,15 taşınmaya hatta uyuşturucu tedavileri yönetmek, ve, şark organizmalar için kullanılacaktır. Bu otomatik sistemler yeni bir araştırma teknolojik yaş habercisi olmuştur ve test konularında büyük miktarlarda işlemek ve böylece HTS gerçekleştirmek için yenilikçi çözümler sağladık ve HCS bütün organizmalar ^12,15 yaklaşımları. Bu tür makineler tartışmasız yararlı araçlar olsa da, onlar da çok pahalı ve birçok temel araştırma laboratuarları için ulaşamayacağı bulunmaktadır. Bu otomatik yetenekleri erişim olmadan kimyasal ekranları mümkün olmadığı gibi görünebilir. Ancak, bu protokol bir zaman makul bir süre boyunca pratik bir şekilde kimyasal bir genetik ekran tamamlamak için kullanılabilecek bir manuel ekran yapmak için nasıl bir rehber özetliyor.

Genel olarak hem manuel tarama ve kimyasal genetiği için dezavantajları var, ve bir kimyasal ekranı göz önünde bulundurulduğu zaman tutulmalıdır. Özel olarak, burada açıklanan yöntem, bir orta derecede gerektirirFiziksel maharet. Maharet uygulama ile artıracak gibi bu endişe, azalmış veya tamamen tekrar yoluyla obviated olduğunu. Analiz için oyuk başına yalnızca 10 embriyo vardır Buna ek olarak, büyük bir hataya için en az odası vardır. Makul bir puanlama rejimi uyulması gereken çıkar bileşiklerin belirlenmesi için çok küçük moleküller, indüklenen fenotipinin penetrans değişebilir. Bu protokolü kullanan araştırmacılar bir hit düşünün ne için uygun titiz kriterlerini hazırlamak çok önemlidir. Bu ekran bu formu doğası büyük olasılıkla başka bir kimyasal Çökmenin ile tarif edilebilir yanlış pozitif, belli bir kısmını verecektir akılda tutmak da önemlidir. Dahası, tam da embriyoların ve asenkron geliştirme doğru ilaç tedavilerinin etkisini değerlendiren komplikasyonlara neden olabilir gibi, döllenmeden hemen sonra tarama için kavramalar toplamak için kritik öneme sahiptir. Bundan başka, bir ex gibi kimyasal tarama getirmedizenlenen strateji, sınırlamaları bir dizi vardır. Bileşik çözünürlük ve taşıyıcı moleküllerin toksisite (örneğin, dimetil sülfoksit (DMSO)), aynı zamanda bir sorun mevcut olabilir ve bir çok molekülü test engelleyici olabilir. Koryon ilaç maruziyeti için bariyer olarak hareket edebilir. Son olarak, zebra balığı kimyasal genetik için güçlü ve translasyon modeli olsa bile, bakım, her zaman bir hücre soyu gibi bir in vitro bir sistem kullanılarak, örneğin, bir alternatif bir kimyasal ekran stratejisi belirlemede alınmalıdır, bütün kullanımı için ikame edilebilir Hayvanlar. Bu bileşiklerin sistemik etkileri toplama olanaklar sunar ve bir memeli modelinde test edilecek olan bileşiklerin listesi seçip ayırmasına araştırmacıların etkinleştirmeniz gibi Bununla birlikte, bütün zebra balığı sisteminde kimyasal işlem, memelilerde içindeki yaklaşımlar iletken tercih kabul edilir.

Bugüne kadar, zebra balığı kimyasal ekranlar güçlü deneysel bir araçtır t sağladı, gelişimin mekanizmaları tasvir ve bu tür hastalık patolojileri önleme yeteneğine sahip moleküllerin tanımlanması gibi, tıpta kullanım için bir aday farmakolojik ajanlar belirleyebilir. Örneğin, Burns ve arkadaşları tarafından bir çalışma miyokardiyumda ⁴² GFP ifade transgenik zebra balığı embriyoları kullanılarak kalp hızı için otomatik mikro-iyi tahlil geliştirdi. Onlar gelişiminde kalp hızını analiz etmek için bu transgenik hattı kullanılır ve ilaç tedavisine ⁴² üzerine nasıl etkilendi. Başka bir çalışmada, Zebra balığı embriyo hematopoetik kök hücrelerin nüfus yoğunluğu test ederek, prostaglandin E2 HSC niş ²³ düzenlediğini belirledi. Bu bulgu fare doğrulandı, ve sonra insan göbek kordonu nakli ^23,31-33 (NIH, Klinik Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314) klinik test için uygulanmıştır. Yapılan son araştırmalara sayesinde, kimyasal genetik zebrafish kullanarak böbrek hastalığı okuyan yararlı olduğu kanıtlanmıştır 43 kadar. Zebra balığı böbrek nefrogenezisi veya nefron rejenerasyon, geliştirme ve akut böbrek hasarı ⁴³ sırasında böbrek oluşturan fonksiyonel ünitesini incelemek için mükemmel bir paradigma sağlar. Nefron yapı oldukça Zebra balığı embriyonik böbrek ve yetişkin memeli böbrek ^44-50 arasında korunur. Kimyasal genetiği ile birleştiğinde Zebra balığı embriyonik böbrek inceleyen çeşitli çalışmalar açıkça onun doğasında öteleme potansiyelini göstermektedir. Kimyasal genetik ekran polikistik böbrek hastalığı (PKD), ³⁴ anahtar oyuncular haline bilinen genler PKD2 ve ift172, eşleştirilmiş iki zebra balığı mutantlar üzerinde gerçekleştirilmiştir. Ekran pan-histon deasetilaz (HDAC) tanımlayan inhibitörü normal mutant embriyolarda görülen morfolojik kusurları geçersiz olabilir küçük bir molekül olarak A (TSA) trichostatin sonuçlandı. De Groh ve meslektaşları tarafından alınan farklı bir yaklaşım induc bileşikler için tarandıBöbrek fonksiyonu ³⁵ bozulmaya işaret eder vahşi-tip zebra balığı embriyolarının, ed ödem. Bir sonuç olarak PTBA tespit sonra, ödem neden olmaya ilave olarak, aynı zamanda PTBA, böbrek soylarının için bir işaretleyici pax2a ekspresyonunu arttığı görülmektedir. Daha da önemlisi, PTBA, optimize edilmiş bir türevi, daha sonra, gentamisin-indüklenmiş böbrek hasarı uygulandı, bundan başka, böbrek hasarı ²⁷ muzdarip farelerin kurtarma hızlandırılmış yetişkin zebrabalıkları yüzdesi öldürücülüğünün gösterilmiştir. Birlikte ele alındığında, zebra balığı kimyasal genetik bu katkıları bu protokolü açıklanan yöntem kullanılarak yapılabilir keşiflerin türlerini vitrin.

Kimyasal genetik araştırmalar önemli liyakat dogururken, belli zorlukları olmadan değildir. Sadece bir bileşiğin etkilenen ediliyor belirli bir gen ya da genlerin belirlenmesi için karmaşık yapabilirsiniz kimyasal genetik yaklaşım kullanılarak. Hedef (ler) bulunduğunda bile, bir significant boşluk bileşiği tanımlama ve küçük moleküllü davranacağı eylem mekanizması (ler) anlama arasında kalabilir. Örneğin, tek bir bileşiği, bir organizma içinde farklı özelliklerin belirli bir aralığına sahip olan özelliğine sahip olduğu için küçük bir molekül hareket ettiği mekanizmasını belirlemek için zor olabilir. Yeni teknoloji ve daha fazla kimyasal genetik ekranlar gelişiyle zebrabalıkları tamamlandı ve bununla birlikte, bir mekanizma belirleme problemi daralıyor. Tanımlanan bileşiklerin moleküler etkilerini belirlemeye yardımcı olmak için bir yöntem, mekanizma, potansiyel olarak daha önce açıklanmış veri çıkarsanabilecektir tarama, bilinen biyoaktif bir madde kütüphanesi seçmektir. Buna ek olarak, chemoinformatic algoritmaları, Keşif KAPISI gibi atfedilen mekanizmaları ¹⁴ sahip bir bileşik, bir veri tabanına karşı, bir bileşiğin yapısal benzerlikleri karşılaştırın kullanım için mevcuttur. Yine bir bileşiğin aydınlatmaya yönelik başka bir yol, bir MICR oluşturmak olacaktıroarray tedavi sonrası profili ve daha sonra benzer bir etki ¹⁴ ortaya mekanistik tanımlanan bileşikler ararken, böyle Bağlantı Haritası gibi mikro ilaç profilleri, bir derleme Bu profili sorgula. Bu yaklaşım, aynı zamanda, ilgi konusu bileşik ile benzer bir etkiye sahip olan genetik mutantlann tespit edilmesi için de kullanılabilir. Bir bileşik ve bir mutant arasında bir bağlantı bulma bileşiği, moleküler ya da üst akışında bileşiği ve morpholinos mutantların işlenmesi suretiyle tarif edilebilir, ilgili genin, mansap işleri düşündürmektedir. Başka bir seçenek Zebra balığı daha iyileştirilmiş olmaya devam ediyor kütle spektrometresi, olacaktır. Bu yöntem, ilaç tedavisinden sonra, belirli bir protein değişiklik ya da post-translasyonel modifikasyonları ayırmak için kullanılabilir. Son olarak, küçük moleküller ve hatta tüm kütüphaneleri bağlama ortaklarından pull için yadsınacaktır bazen yeteneğine sahiptir. O da kayda değer olduğu süre ne kadar küçük bir molekül fonksiyonların mekanizması ıönemli ithalat s mekanizmaları bilinmeyen kaldığı için FDA onaylı ilaçlar vardır.

Zebra balığı hem genetik ve fizyolojik memeliler için pek çok benzerlikler gösterirler rağmen, hala ilaç geçit ¹⁴ bir mesele var. Bir çalışmada zebra balığı embriyolarının ⁵⁰ hücre döngüsü inhibitörlerinin bir ekrandan hit çapraz yeteneği araştırılmıştır. Ekran hücre döngüsü etkinliğe sahip olduğu daha önce bilinmemekteydi 14 hit teşhisi ile sonuçlandı. Bu bileşiklerin içinden, 14, 6, hem insan ve zebra balığı, hücre kültürü deneylerinde, hücre döngüsü etkinliğe sahip olduğu bulunmuştur, 3, 1, sadece zebra balığı hücrelerinde aktif olan hücre kültürü deneylerinde serum inaktive olduğu gösterilmiştir, ve 4'te hiçbir aktiviteye sahip değildi ya da zebra balığı ve insan hücre kültürü analizleri, ancak zebrabalıkları bütün organizmada. Özellikle, sadece zebrabalıkları aktiviteye sahip 4 bileşikler prohi olabilir zebrabalıkları ve memeliler arasında farklar olduğunu göstermektedirbazı bileşiklerin translasyon potansiyelini bit. Bu, ancak memelilerde böbrek iyileşme oranını artırmak, insan alıcılarda ve PTBA-türevleri aşılamak için HKH'lerin yeteneğini güçlendirir PGE _2, böylece kanıt sağlamak gibi küçük moleküllerin örnekleri vardır dikkatli olmak önemli bir husustur ilke bu geçiş ^23,31-33 mümkündür.

Ne olursa olsun bu tuzaklar, kimyasal, genetik ve bu minimal kaynak yaklaşımın araştırma topluluk sunmak için çok şey var. Kimyasal genetik zebrabalıkları özellikle yararlıdır ve moleküler yolu sorgulama ve ilaç keşfi önemli bir rol oynamaya devam edecektir. Ayrık moleküler hedeflere dayalı kimyasal ekranları tarihsel nedeniyle adsorpsiyon, dağılım, metabolizma, boşaltım ve toksikolojik (ADMET) özelliklerinin ⁵¹ takımyıldızı olarak bilinen yüksek bir başarısızlık oranına tabi olmuştur. Için Zebra balığı kullanan kimyasal ekranlardaha çok ayrı bir hedef yerine, çok sayıda ADMET sorunları aşmak ve bütün organizmanın bağlamında etkili olan bileşikleri tespit edebilir, bir süreci üzerine. Mevcut mutant suşlar ve hedeflenen genetik mutantlar ve transgeniklerle oluşturmak için genom düzenleme kullanma yeteneği dahil olmak üzere Zebra balığı araştırma için mevcut kaynakların artan havuzlu, zebrafish kullanarak potansiyel kimyasal genetik ekranlar sınırsız sayıda neredeyse vardır. Birçok kimyasal kütüphaneler küratörlüğünü ve bilinen biyoaktif, yapısal olarak farklı ve yapısal olarak benzer yeni bileşikler, span koleksiyonlar edilmiştir. Bu reaktifler şu anda mevcut ve önümüzdeki yıllarda büyümeye muhtemeldir ekran kombinasyonları için heyecan verici fırsatlar zenginliği sağlamak. Elinde Bu olanaklar sayesinde, bu kılavuz ve yüksek verimli protokol zebrafish kullanarak kimyasal genetik ekranları taahhüt araştırma gruplarının kapasitesini artırmak için pratik ve kullanıcı dostu bir yol sağlar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 - 10 μ l doğal pipet uçları	USA Scientific	1111-3800
1x E3			50x E3 ve DI su kullanarak üretin.
1x PBST 1x PBS'de			%0,1 ara-20 üretir.
10x PBS	Amerikan Biyoanalitik	AB11072
12 oyuklu boyama kabı	BD-Falcon	35-3225
20x SSC	Amerikan Biyoanalitik	AB13156
24 kuyulu plaka	BD-Falcon	35-3226
%4 PFA/1x PBS 1x PBS'de			%4 PFA (a/h) üretin - kaynatın, ardından dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
48 kuyulu plaka	CytoOne	CC7672-7548
50x E3			DI suda 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250 mM NaCl ve 8.5 mM KCl üretir.
96 derin kuyu plakası	VWR	100-11-940
96 kuyu plakası sızdırmazlık matı	VWR	10011-946
anti-digoxigenin antikoru	Roche	11-093-274-910	-20 &� C'de tutun.
BCIP stoğu	Sigma	B8503	%100 DMF kullanarak 50 mg / ml üretin - dondurun ve ardından -20 ° C'de saklayın.
blok çözelti			10 ml BSA (% 10), 5 ml FCS ve 35 ml MABT kullanarak 50 ml üretin. (BSA ve FCS'yi 37 ° C'de çözün.)
BSA (sığır serum albümini) stoğu	Amerikan Biyoanalitik	AB00448	BSA pullarını oda sıcaklığında MAB içinde karıştırarak% 10 BSA üretin, ardından dondurun ve -20 ° C'de saklayın (Kullanılmayan BSA pullarını 4 ° C'de tutun.)
DIG/FLU etiketli riboprob in vitro transkripsiyon reaksiyon reaktifleri	Roche	11175025910; 11685619910	Üretici prosedürüne danışın.
DMF (dimetilformaldehit)	Amerikan Biyoanalitik	AB00450
DNaz 1 inhibitörü, 10x DNaz 1 tampon	Roche	4716728001
embriyo kuluçka kabı	Falcon	35-1005
epT.I.P.S 20-300 &# 956; l	Eppendorf	22492284
Etanol (EtOH)	Sigma	E7023	Moleküler sınıf H2< / sub>O ve% 100 EtOH ile 50 ml% 70 EtOH üretin, ardından -20 ° C'de saklayın.
FCS (fetal buzağı serumu) stok	Invitrogen	16140089	-20 ° C'de tutun.
filtre sterilizasyon ünitesi	Corning	430516	0.45 & # 956; m CA / 1 L hacim
ince forseps	Roboz	RS-1050
düz tabanlı mikrosantrifüj tüpü	VWR	87003-300; 87003-298
Formamid	Amerikan Biyoanalitik	AB00600	-20 ° C'de tutun.
cam lavabo 90 x 50	Kimax Kimble	23000
cam pipet	VWR	14673-010
cam şişe	Wheaton	225012
gliserol	Sigma	G7893
glisin	Sigma	G8898
glikojen	Roche 10901393001
HYB+			% 50 formamid,% 0.1 Tween-20, 5x SSC, 5 mg / ml maya torula RNA ve 50 &# 956 üretir; l/μ l heparin
INT stoğu	Sigma	I8377	%70 DMF ve %30 H2O kullanarak 55 mg / ml üretin - dondurun ve ardından -20 ° C'de saklayın.
MAB			1.5 L deiyonize H2O'ya 55.0 g Trisma bazı, 8 ml 1 M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleik asit ve 17.5 g NaCl ekleyerek üretilir. Daha sonra deiyonize H2O ila 2 L ile doldurun ve otoklavlayın.
MABT			örgü çay süzgecinde %0,1 Ara-20 Üretin
	İngiliz Çay Dükkanı	SKU # ASTR_KEN, MPN # 1705
moleküler dereceli damıtılmış su	Mediatech	25-055-CM
l	Eppendorf	3122000.019
çoklu 8 kanallı pipet 30 - 300 μ l	Eppendorf	3122000.051
nanodrop	Thermo	ND-2000c
NBT stoğu	Sigma	N6876	%70 DMF ve %20 H2O kullanarak 50 mg / ml üretin - dondurun ve ardından -20 ° C'de saklayın.
paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Hizmetleri	19210
PCR-Film yapıştırıcı	Eppendorf	30127.48
plaka kabı (Kalem Kutusu)	Sterilit	1722
ön boyama tamponu			%0.1 Ara-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl ve 100 mM Tris pH 9.5 üretir. (Her seferinde kullanmak için taze yapın.)
Pronase	Roche	11459643001	E3 kullanarak 50 mg / ml üretin, dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
Proteinaz K	Roche	03-115-879-001	DI suda 10 mg / ml üretin, ardından dondurun ve -20 ° C'de saklayın.
RNase 1 inhibitörü	Roche	3335399001
kauçuk ampul	Fisherbrand Fisher Scientific	03-448-22
boyama solüsyonu-mor	N/A	N/A	45 & # 956 kullanarak üretin; NBT'nin l'si ve 35 μ Ön boyama tamponunda ihtiyaç duyulan her 10 ml için l BCIP.
boyama çözeltisi-kırmızı			31.5 & # 956 kullanarak oluşturun; l INT ve 35 μ Ön boyama tamponunda ihtiyaç duyulan her 10 ml için l BCIP.
stereomikroskop	Nikon	SMZ645, SMZ1000
T3 RNA polimeraz	Roche	11031171001
T7 RNA polimeraz	Roche	10881775001
transfer pipeti	Samco	202, 204
Tween-20 stok	Amerikan Biyoanalitik	AB02038
su banyosu	Thermo	51221073	( Model # 2831)