Yöntem makalesi

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

DOI:

10.3791/52076

⸱

23 Mart 2015

 ,  ,  ,  , 
1Chemistry Department, Elon University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Wake Forest School of Medicine, 3Neuroscience Graduate Program, Wake Forest School of Medicine, 4ALS Center Translational Science Unit, Wake Forest School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlıklı ve hastalık gibi iki veya daha fazla farklı grup arasında karşılaştırma, hücresel durumu belirlemek için gereklidir. Mitokondri, hem hücre metabolizması hem de enerji üretimindeki rolleri ve apoptozun kontrolü nedeniyle hücre sağlığının bağlantı noktasındadır. Bu nedenle, izole mitokondri ve mitokondriyal pertürbasyonun doğrudan değerlendirilmesi, organele özgü (dis) fonksiyonun meydana gelip gelmediğini belirleme yeteneği sunar. Bu protokolde açıklanan yöntemler, HEK kültürlenmiş hücrelerden ve fare karaciğeri ve omuriliğinden sağlam, fonksiyonel mitokondrinin izolasyonunu içerir, ancak diğer kültürlenmiş hücreler veya hayvan dokuları ile kullanım için kolayca uyarlanabilir. TMRE tarafından değerlendirilen mitokondriyal fonksiyon ve bir floresan plaka okuyucu ile birlikte ortak mitokondriyal ayrıştırıcıların ve inhibitörlerin kullanılması, bu protokolün yalnızca çok yönlü ve çoğu araştırma laboratuvarı için erişilebilir olmasını sağlamakla kalmaz, aynı zamanda yüksek verim sunar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşayan hücreler yağ ve karbonhidrat şeklinde metabolik enerjiyi banka ve biyosentezi, membran taşıma ve hareket için bu enerjiyi kullanır. Bazı enerji glikoliz sırasında doğrudan ATP içine beslenme şekerlerin dönüşüm yoluyla sitosol içinde elde edilmektedir. Bununla birlikte, bir hücre ATP üretiminin başlıca kaynağı mitokondriyal solunum zincirinde 1 ile mitokondri içinde yararlanır. mitokondri yapısı, etkili ve verimli bir ATP üretimi için gerekli olan uzaysal yönlendirilmesini sağlar. Mitokondri bileşenleri bir zarlar arası boşluk ve birlikte matris içteki mitokondriyal bölme, ev ile ayrılmış bir çift zar sahip ve ATP üretimi dahil kimyasal reaksiyonlar....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri Sağlık kurallar National Institutes uymakta ve Wake Forest Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fare modeli için üreyen Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) elde edilmiştir. Vahşi tip (WT) kadın, SOD1G93A erkek transjenik olmayan [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A fareler ve deneylerde kullanılan transjenik olmayan WT yavruları oluşturmak için üretildi.

Soruşturma için 1. Modelleri

  1. Hücre kültürü
    1. % 5 CO2 içinde 37 ° C 'de, insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK-T293),% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş h....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml, IL1-β ve 75 ng / ml IFN-γ ile HEK-293T hücrelerinin tedavisi (x 3), 24-48 saat boyunca hücre ölümü aşamalı miktarlarda (Şekil 1A yol açar ). Hücre canlılığı MTT denemesi kullanarak değerlendirilmiştir ve sürekli olarak ~ 24 saat, tedaviden hücre canlılığını% 10 azalma ve 48 saat tedavi ile ~% 20'lik bir düşüş olduğunu göstermektedir edildi. Bireysel sitokinler ile benzer konsantrasyonlarda (100 ug / ml TNF-α, 40 ng / ml, IL1-β ve 75 ng / ml IFN-γ), 48 saat sonra benzer bir.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinant sitokinler ile HEK-293T hücrelerinin tedavisi 48 saat (Şekil 1) üzerine hücre ölümü orta miktarda neden olur. TNF-alfa, muamele ile uyarılan hücre ölümünün miktarı önceki çalışmalara 30 benzer ve hücre canlılığı, tek başına de literatürde 31,32 ile uyumlu olan herhangi bir sitokin olan belirleyici miktarda daha büyük olan çok sayıda sitokin birlikte uygulanmasından sonra azalır. miktarları ve sitokin tedavileri türleri yanı sıra bireysel sitokinler kokteyller karşılaştı.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma kısmen NSF hibesi CHE-1229562 (VDGM), Elon Üniversitesi Lisans Araştırma Ofisi, Elon Kimya Bölümü ve Elon Lumen Ödülü (TL ve TAD), Elon College Fellows Programı (JAC) ve Elon College Honors Programı (TAD) tarafından desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
L-glutamik asitSigmaG1251yerine potasyum tuzu kullanabilir.
malik asitSigmaM8304yerine potasyum tuzu kullanabilir.
KH2< / sub>PO4< / sub>SigmaP0662
K2< / sub>HPO4< / sub>SigmaP3786
EGTASigmaE3889
Trisma tabanıSigmaT6066
MOPSSigmaM3183
CCCPSigmaC2920100 yemek kaşığına kadar seyreltin; μ Etanolde çalışan bir stok olarak M ve -20 'de saklayın; °C.
ValinomisinSigmaV0627DMSO'da yapın ve 5 dakika olarak kullanın; μ M çalışma stoğu. -20 'de saklayın; °C.
sükrozFisherS5-500
KCNMallinckrodt6379Etanolde konsantre bir stok yapın ve ardından suyla seyreltin 
rotenoneSigmaR8875Son derece toksik. Etanolden yapılmıştır.
oligomisinSigmaO4876Son derece toksik. Etanolden yapılmıştır.
ADPSigmaA2754
TMRESigma8717-25mgSeyreltik 100  μ Kullanmadan hemen önce EB ile M stoğu.
DMEMGibco11965-0841x normal (yüksek glikoz).
Kalem / StrepInvitrogen15140-155
L-glutaminFisherSH3002101Alikotları -20 'de saklayın; ° C
FBSLonza14-501FABD menşeli, üstün kalite. Isıyı inaktive edin ve alikotları -20 ° C'de saklayın; °C.
Tripsin-EDTASigmaT4049
DMSOSIgmaD2650
Protien Test Boyası (5x)Bio-Rad500-0006Herhangi bir protein tahlili ikame edebilir.
BSAFisherBP1600-100Protein tahlili için suda 2 mg / ml stok yapın.
MTT tozuSigmaM2128Filtre, PBS'de yapılan 5 mg / ml stoğu sterilize eder. Alikotları -20 'de saklayın; ° C; 4 'de saklayın; ° 1 haftaya kadar C.
Tergitol çözeltisi (NP-40)SigmaNP40S
Rekombinant İnsan IL-1BGibcoPCH08014Bir kez -20 'de mağaza alikotları açıldı; ° C
Rekombinant İnsan TNF-alfaGibcoPHC3015L
Rekombinant İnsan IFN-gamaGibcoPHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)SigmaD8537Mg2+ ve Ca2+ iyonları içermediğinden emin olun.
Sitokrom c ELISA kitiAr-Ge HEK-293T hücreleri içinDTC0
D sistemleri İnsan.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
  2. Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitokondri zolasyonuMitokondriyal FonksiyonMembran PotansiyeliTMRE FloresansDiferansiyel Santrif jlemeH cre HomojenizasyonuFloresan Plaka OkuyucuMitokondriyal Ayr t r c larSitokin UygulamasHEK H creleri

İlgili makaleler