Yöntem makalesi

Yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu Helikobakter pilori Çağ Tip IV Salgı Sistemi Pili

DOI:

10.3791/52122

⸱

21 Kasım 2014

 ,  , 
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Cag Tip IV Salgı Sistemi (Cag-T4SS) olarak bilinen onkojenik bakteri organelini görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Cag-T4SS'nin, değişen demir mevcudiyeti koşullarına yanıt olarak H. pylori'nin yüzeyinde farklı şekilde üretildiğini bulduk.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Helicobacter pylori, insan popülasyonunun yarısının insan mide nişini kolonize eden sarmal şekilli, gram negatif bir bakteridir1,2. H. pylori mide kanserinin birincil nedenidir ve dünya çapında kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedenidir3. Mide hastalığı riskinin artmasıyla ilişkilendirilen bir virülans faktörü, H. pylori kromozomu içinde tip IV sekresyon sistemini ve aynı kökenli efektör molekülCagA 4,5'i kodlayan 40 kb'lık bir bölge olan Cag-patojenite adasıdır. Cag-T4SS, CagA ve peptidoglikanın konak epitel hücrelerine5,6 translokasyonundan sorumludur. Cag-T4SS'nin aktivitesi, sitokin ekspresyonunun yukarı regülasyonu, proinflamatuar yolların aktivasyonu, hücre iskeletinin yeniden şekillenmesi ve onkojenik hücre sinyal ağlarınınindüksiyonu dahil olmak üzere konakçı hücre biyolojisinde çok sayıda değişikliğe neden olur 5-8. Cag-T4SS, iç ve dış zarı kapsayan ve hücreden dışarıya doğru hücre dışı boşluğa uzanan alt montaj bileşenlerinden oluşan bir makromoleküler makinedir. Cag-T4SS'nin hücre dışı kısmı "pilus" olarak adlandırılır5. Çok sayıda çalışma, Cag-T4SS pili'nin konak-patojen arayüzünde9,10 oluştuğunu göstermiştir. Bununla birlikte, bu önemli organelin biyogenezini düzenleyen çevresel özellikler büyük ölçüde belirsizliğini korumaktadır. Son zamanlarda, düşük demir mevcudiyeti koşullarının Cag-T4SS aktivitesini ve pilus biyogenezini arttırdığını bildirdik. Burada, insan gastrik epitel hücreleri ile ko-kültürden önce değişen demir mevcudiyeti koşullarında H. pylori'yi büyütmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu analizleri ile demir kısıtlı koşullarda sergilenen hiper piliated fenotipin görselleştirilmesi için kapsamlı bir protokol sunuyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

H. pylori enfeksiyonu mide kanseri için önemli bir risk faktörüdür1. Bununla birlikte, hastalık sonuçları değişir ve konak genetiği, H. pylori suşlarının genetik çeşitliliği ve konakçı diyeti gibi çevresel unsurlar gibi çok sayıda faktöre bağlıdır11. Önceki raporlar, H. pylori enfeksiyonu, demir eksikliği (azalmış kan ferritin ve hemoglobin konsantrasyonları ile ölçüldüğü gibi) ve sonuçta mide hastalığının ilerlemesinin artmasına yol açan IL-8 sekresyonu dahil olmak üzere artmış proinflamatuar sitokin üretimi arasında bir korelasyon olduğunu ortaya koymuştur12. Akut H. pylori enfeksiyonu, konakçın....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. H. İnsan Gastrik Hücrelerine ile Demir Durumu ve Co-kültür Çeşitli Koşullar pylori Büyüme

  1. H. seçin Bu çalışmalar için pylori soyu PMSS1 bir sağlam cağ patojenite adası ve işleyen bir tip IV sekresyon sistemi ifade çünkü. Aynı zamanda, bir negatif kontrol olarak izogenik bir kafes mutant (PMSSI Δ kafesi) kullanmaktadır. % 5 CO2 varlığında 37 ° C'de 24 saat boyunca% 5 koyun kanı (kan agar plakaları) ile takviye edilmiş TSA plakaları üzerine bakteri büyütün.
    NOT: reaktifleri hazırlayın ve Malzemeleri ve Ekipmanları Tablo belirtildiği gibi malzemeleri bir araya getirin. Her....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, demir kullanılabilirliği değişen koşulları H. modüle kapasitesine sahip olduğunu göstermiştir ana patojen arayüzünde pilori Çağ-T4SS pilus biyogenez. H. tek başına ortamda kültürlenen zaman H. pylori 3 Pili / hücre ortalama oluşturur. H. H. pylori demir yetiştirilir tüketen bakteri büyümesi (Şekil 1), alt inhibitördür (sentetik kenetleyici dipiridil kullanılarak) şartları altında, bakteriler üreten bir çok Çağ-T4SS pili (~ 7 pili / hücre) için kull.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Demir, bakteriyel patojenler dahil olmak üzere yaşamın birçok formları için önemli bir mikrobesleyicidir. Mikroorganizmaları istila canlılığı kısıtlamak için bir çaba, omurgalı ana "beslenme dokunulmazlığı" 18 olarak bilinen bir süreç içinde besin demir müsadere. Buna karşılık olarak, bakteriyel patojenler çevrelerini algılamak ve demir toplama sistemleri, toksinler ve toksin salgı makine 19,20 olarak virülans özelliklerinin detaylandırılması düzenleyen küresel bir sinyal molekülü olarak .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Gazi İşleri Bakanlığı Kariyer Geliştirme Ödülü 1IK2BX001701 ve Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi'nden CTSA ödülü UL1TR000445 tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi'nin veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Taramalı elektron mikroskobu deneyleri, kısmen, NIH hibeleri CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 ve EY08126 tarafından desteklenen VUMC Hücre Görüntüleme Paylaşılan Kaynağı kullanılarak gerçekleştirildi.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kazeinden modifiye brusella suyu
Pepton (10 g/L)Sigma70172
Hayvan dokusunun peptik sindirimi (10 g/L)Sigma70174
Maya özütü (2 g/L)Sigma92144
Dekstroz (1 g/L)SigmaD9434
Sodyum klorür (5 g/L)Thermo FisherS271-10
Kolesterol (250X) (4 ml/L)Yaşam Teknolojileri12531018
Ferrik klorür (100 veya 250 uM)Sigma157740-100G
Dipiridil (200 uM)SigmaD216305-100G
Modifiye RPMI
RPMI+HEPES (1X)Yaşam Teknolojileri22400-121
Fetal sığır serumu ( 100 ml/L)Yaşam Teknolojileri10438-026
Elektron Mikroskobu Hazırlama
Paraformaldehit (%2.0 sulu)Elektron Mikroskobu Bilimleri15713
Gluteraldehit (%2.5 sulu)Elektron Mikroskobu Bilimleri16220
Sodyum kakodilat (0.05 M)Elektron Mikroskobu Bilimleri12300
Osmiyum tetroksit (% 0.1 sulu)Elektron Mikroskobu Bilimleri19150
Etanol (mutlak)SigmaE7023
Kolloidal gümüş boyaElektron Mikroskobu Bilimleri12630
SEM örnek taslaklarıElektron Mikroskobu Bilimleri75220
LamellerThermo Fisher08-774-383
IL-8 Sekresyon Değerlendirmesi
Quantikine IL-8 ELISA kitiR& D SistemleriD8000C

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
  2. Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Taramal Elektron MikroskobuKonak Patojen Aray zPili G r nt lemeGastrik Epitel H creleriDemir K s tlamasAlan Emisyon TabancasKritik Nokta Kurutucu

İlgili makaleler