Gelişim sırasında tavuk embriyosunu görüntülemek ve ona erişmek zor olabilir. Basit, uygun maliyetli ve bir sınıfta veya araştırma ortamında kolayca kullanılabilecek bir ex ovo yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, embriyonik gelişimin geç aşamalarına kadar embriyoya erişim sağlar (HH 40).
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Optimize Ex-ovo Kalkınma Gelişmiş Aşamaları Chick Embriyolar ekimi
Bu makalede
Özet
Özet
Anatomi, embriyoloji ve gelişim biyolojisi alanındaki araştırmalar büyük ölçüde model organizmaların kullanımına dayanmıştır. Canlı embriyolardaki gelişimi incelemek için tavuk gibi model organizmalar sıklıkla kullanılır. Tavuk, düşük maliyeti ve minimum bakımı nedeniyle mükemmel bir model organizmadır, ancak opak bir yumurta kabuğu içinde bulundukları için gözlemsel zorluklar sunarlar. Embriyoyu geliştikçe düzgün bir şekilde görebilmek için, kabuğun pencereli olması veya çıkarılması gerekir. Embriyonik gelişim çalışmasında araştırmacılara yardımcı olmak için hem pencereleme hem de ex ovo teknikler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, yöntemlerin her birinin sınırlamaları ve zorlukları vardır. Burada, tavuk embriyoları için HH 19 evresinden birçok organın geliştiği gelişimin geç aşamalarına (HH 40) kadar embriyonik gelişimin gözlemlenmesini sağlayan basit, optimize edilmiş bir ex ovo kültür tekniği sunuyoruz. Bu tekniğin hem lisans sınıflarında hem de embriyo manipülasyonlarının yapıldığı daha gelişmiş araştırma laboratuvarlarında benimsenmesi kolaydır.
Giriş
Ex ovo kültürü, tavuğun gelişimi çalışmasında önemli bir rol oynamıştır1, 2. Bu kültürleme yöntemi, nörolojik hastalıkları, uzuv gelişimini, kraniyofasiyal gelişimi incelemek ve diyabet ile ilişkili malformasyonları araştırmak için bir model olarak kullanılmıştır 3, 4, 5.
Ex ovo tekniğinin birçok çeşidi vardır. En yaygın yaklaşım, bir strafor kap6,7,8 veya bir cam kase5 kullanmaktır. Bu yöntemlerde, embriyoyu beşiklemek için fincan veya kase streç film ile kaplanır, fincanın üzerine bir kapak yerleştirilir ve embriyo daha sonra uygun nem oranına sahip bir inkübatöre yerleştirilir6. Ancak bu kurulum teknik olarak zor olabilir. İlk zorluk, embriyoyu beşiklemek için kullanılan plastik sargıdır. Bu sargı ile çalışmak zordur ve çoğu zaman bardağa çok iyi yapışmaz. Bu sorunu çözmek için, sargıyı yerinde tutmak için bardağın etrafına elastik bir bant yerleştirilir. Buna rağmen, sargı hala kayabilir, bu da embriyo için ölümcüldür. Plastik sargı, embriyo manipülasyonları ve gözlemleri sırasında kullanılabilecek forseps veya iğneler tarafından yırtılma veya delinme potansiyeline sahiptir. Son olarak, bu kurulum çok kararlı değildir ve öğrenciler bardakları kolayca devirebilir. Kapların yüksekliği, embriyoyu stereomikroskop altına yerleştirmeyi de çok zorlaştırır, bu da yüksekliği ölçmek için sınırlı bir hedefi vardır. Bu zorluklar, lisans öğrencilerinin ileri gelişim biyolojisi dersleri gibi öğretim laboratuvarlarında canlı civciv embriyoları ile çalışmasını zorlaştırmaktadır.
Ex ovo yöntemindeki yukarıdaki zorluklar, araştırmacıların embriyonik civciv gelişimini görmek için pencereleme yöntemi 9,10'a yönelmelerine neden olmuştur. Bu teknikte, embriyonun üzerindeki yumurta kabuğunda bir delik veya "pencere" açılır. Delik, daha fazla embriyonik gelişime izin vermek için bant veya balmumu9 ile yeniden kapatılabilir. Pencereleme yönteminin embriyonik gelişimi görüntüleme yeteneği ve kolay bakım gibi bazı avantajları olmasına rağmen, bu yöntemin de çeşitli sınırlamaları vardır. Birincisi, tüm embriyoyu (özellikle geç aşamalarda) görmek için pencerenin oldukça büyük olması gerektiğidir. İkincisi, büyük pencerelerin kapatılması zordur; Uygun olmayan bir sızdırmazlık, sterilite ve hayatta kalma sorunlarına yol açacaktır. Erimiş balmumunun dolgu macunu olarak kullanılması, protokole başka bir elverişsiz ve dağınık adım ekler. Bu nedenle, pencereleme yöntemi genç evrelerdeki civciv embriyoları için ideal olsa da (HH 11 – HH 27), geç evrelerde tüm embriyonun görüntülenmesi kolay bir şekilde gerçekleştirilemez.
Burada, yüksek teknolojili ekipman ihtiyacını ortadan kaldıran, stereomikroskop altında kullanımı kolay, embriyoya mikroskobik manipülasyonlar yapmak için yeterli desteği veren ve araştırmacıların embriyonun büyümesini bir bütün olarak gelişimin sonraki aşamalarına (HH 40-41'e kadar) iyi bir şekilde görmelerini sağlayan gelişmiş ve basit bir ex ovo kültür tekniğini11 açıklıyoruz. Ex ovo tekniğindeki bu ilerlemelerle, bireyler embriyonik gelişimin daha eksiksiz bir anlayışına erişim kazanırlar. Örneğin, daha sonraki aşamalara doğru büyüme, bireylerin kemikleşme, tüy gelişimi ve ileri uzuv ve göz gelişimi gibi bu zaman noktasına kadar gerçekleşmeyen gelişimsel süreçleri gözlemlemelerine olanak tanır. Tüm embriyo ve ekstraembriyonik zarlar ve damar sistemi açıkça görülebilir. Embriyonik manipülasyonlar (yani, inhibitörlere batırılmış boncukların implante edilmesi veya doku katmanları arasına bariyerlerin yerleştirilmesi) gibi daha ileri araştırmalar da yapılabilir ve araştırmacılar daha sonraki aşama embriyolarda manipülasyonların etkisini gözlemleyebilirler.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: Tüm malzemeleri Tablo 1'de verilmiştir.
1. Tavuk Embriyolar Saklama
- Yaklaşık% 40 nem ile Gallus 37 o C yatay Gallus gerginlik tavuk yumurta inkübe ve bir kez ya da günde iki kez yumurta açın. Yumurta kabuğu Torna yapışmasını embriyo önlemek için önemlidir.
- 4 o C'de yumurta tutmak, önceki aksi embriyo sarısı kitle ventral yer alacak ve ek olarak 3. adımda yumurta açılması zarar görür gibi kültür kurma 24 saat içinde yumurta açmak etmeyin "halt" kalkınma inkübasyon öncesinde en fazla bir hafta derece ama bu ideal değildir.
2. Tavuk Embriyolar Sahneleme
- Hamburger ve Hamilton 12 evreleme tablosunu kullanarak tavuk embriyoları Sahne. Eski-ovo kültürlenmesini kurmak için ideal bir sahne HH evre 19-20 (inkübasyon 3- etrafında gün) bec olduğunuause Bu kafa 53 hpf döner kısa bir süre sonra olduğunu.
Not: HH evre 19-20 aşağıdaki morfolojik özellikleri ile karakterize edilir: Somitlerin kuyruk çoğunluğu içine uzatılır, ancak kuyruk çok uç kuyruk tomurcuk kıvrılmış, bölünmemiş kalır, allantois küçük ve damarsal sınırlıdır, bacak-tomurcuklar kanat-tomurcuklar daha büyük ve gözler pigmentlenmemiş veya grimsi bir renk var.
3. Shell Embriyo Çıkarma
- Kabuktan embriyo çıkarmadan önce,% 70 etanol ile kabuk sprey ve kurumaya bırakın. Bu embriyo zarar verir gibi hızla yumurta açmayın.
- Dikkatli olmak dikkatli alt tarafında yumurta çatlak, yumurta yönünü değiştirmek için değil (yani, inkübasyon sırasında ventral oldu tarafı) ve steril içine embriyo serbest tekne (88 x 88 x 23 mm) tartın. Silin% 70 etanol ile tekneler tartın. Yumurta sarısı çuval zarar görmediğinden emin olmak için kontrol edin embriyo. Yumurta sarısı h Eğerkırık gibi hayatta olmayacak gibi, embriyo atın.
- O canlı olmasını sağlamak için embriyo uyun; Kalp atıyor, damar normal görünür, ve hiçbir belirgin anormallikler mevcuttur. Tartmak tekne kenarları kuru olduğundan emin olun.
- Bir pipet kullanarak, enfeksiyonu önlemek için albümin üzerine penisilin / streptomisin, 40 ul (5.000 birim penisilin, ml başına 5 mg streptomisin) bırakın.
4. Nem Odası Hazırlama
- Kim-mendil ve / veya bir steril plastik konteynerin (12 x 12 x 6 cm ebadında), alt pamuk emici bir ped küçük bir deste koyun,% 70 etanol ile silinmiştir.
- Kim-mendil ve / veya pamuk su (yaklaşık 150 mi) biraraya getirildi steril damıtılmış su ilave edin.
5. Ex Ovo Kültür Montaj
- Nemli dolgu üstüne embriyo içeren tartmak tekne yerleştirin. Ardından, t üstünde bir kare steril petri kabına (9.5 x 9.5 cm) yeri yarısıO gevşek kapak oluşturmak için tekne tartın.
- Onun kapaklı plastik kap örtün. Hala odasının içine iyi hava akışı sağlar kısmi mühür sağlanması, kapağın iki köşeleri aşağıya doğru bastırın.
- Dikkatle istenilen aşamaya kadar 37 o C inkübatör içine kurulum yerleştirin.
- Kontrollü nem inkübatör kullanılamaz ise, nem kontrolü yardımcı inkübatör su kapları yerleştirin. Nem odalarında ve inkübatör tüm suyu sterilize ve kuluçka döneminde gerektiği gibi doldurun. % 40 nem ideal.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yöntemin ovo Bu eski geç gelişim evrelerinde (HH 40-41) (Şekil 1A ve 1B) gelişme erken aşamalarında (HH 19/20) embriyoların gözlem için izin verir. HH 19-20 de kültür kurma kültür embriyoların beka artırır. Hayatta kalma kültürü ve sahnede 21 sonra çok düşüktür (53 hpf önce) çevirerek kafasına önce, embriyo daha az sağlam embriyolar elde edilir, böylece kaldırılması üzerine kabuk daha sopa eğilimindedir. (Yaklaşık% 40 HH 40-41 kadar hayatta) Genel olarak, kültür ex...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kültürleme ve her ikisi de pencereleme ex ovo avantajları ve zorlukları vardır. Burada avantaj ve yöntem ovo Strafor bardak ex ve burada gösterilen yönteme ovo Optimize ex pencere yöntemi zorlukları karşılaştırın. Bizim yöntem geç gelişim evrelerinde ve yöntem 1, 2 ovo geleneksel ex bizim ayrıntılandırmaları de manipülasyon ve civciv embriyo rahatlıkla izlenebilmektedir, 3 lisans öğretim laboratuvar derslerinde kullanmak üzere, ek çok k...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bu yazının sunulan bilgilere açısından hiçbir rakip mali çıkarlarını var.
Teşekkürler
Biz onun filme iş ve bu yazının video bölümünü düzenlemek için Mount Saint Vincent Üniversitesi Paul Poirier, Medya Yapımcı, teşekkür etmek istiyorum. Biz finansman için Kanada Doğal Bilim ve Mühendislik Araştırma Konseyi kabul.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Penisilin / Streptomisin | Sigma | P4458 | Donma / çözülme olaylarını önlemek için küçük alikotlar yapın |
| Kare Petri Kabı | 9,5 cm x 9,5 cm | ||
| Tartı Teknesi | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Kilitli kap | Kilitli | Yok | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
Kaynaklar
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522(2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
