Yöntem makalesi

Kanatlı Üretim Örneklerden Bakteriyel Topluluklar Nitel ve Nicel Değerlendirme Karma DNA Ekstraksiyon Yöntemi

DOI:

10.3791/52161

⸱

10 Aralık 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Egg Safety and Quality Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 2Poultry Microbiological Safety and Processing Research Unit, USDA-Agricultural Research Service, 3Department of Biochemistry and Biophysics, Oregon State University, 4College of Public Health, University of Georgia, 5Department of Biological Sciences, Center for Microbial Genetics and Genomics, Northern Arizona University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çevresel kümes hayvanı üretim örnekleriyle kullanılmak üzere yeni bir yarı otomatik hibrit DNA ekstraksiyon yöntemi geliştirildi ve toplam bakteri topluluklarının nicel ve nitel tahminleri açısından ortak bir mekanik ve enzimatik ekstraksiyon yöntemine göre iyileştirmeler gösterdi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA ekstraksiyon protokolleri etkisi araştırıldı edilen numune tipine ve uygulanan aşağı doğru analiz tipleri, hem yüksek ölçüde bağlı olabilir. Yeni bakteriyel topluluk analizi teknikleri (örneğin, microbiomics, metagenomik) kullanımı bu disiplinler içinde tarım ve çevre bilimleri ve birçok çevresel örneklerde daha yaygın hale geliyor düşünüldüğünde physiochemically ve mikrobiyolojik (benzersiz örn, fekal ve çöp / çarşaf örnekleri olabilir kümes hayvanları üretim spektrumu), uygun ve etkili DNA ekstraksiyon yöntemleri dikkatle seçilmiş gerekir. Bu nedenle, yeni bir yarı-otomatik hibrit DNA ekstraksiyon yöntemi çevre kanatlı üretim örnekleri ile kullanılmak için özel olarak geliştirilmiştir. Mekanik ve enzimatik: Bu yöntem, DNA ekstraksiyonu iki temel tür bir kombinasyonudur. Bir iki adım yoğun mekanik homojenizasyon adımı (kullanarak boncuk-yenerek özellikle ÇEVREYLE için formüledışkı örnekleri örnek matris bakterilerin uzaklaştırılması ve DNA geliştirmek ve Gram-pozitif bakteri topluluk üyelerinin kurtarma geliştirmek için tal örnekleri) "altın standart" enzimatik DNA ekstraksiyon yöntemi başında eklenmiştir. Hibrid yöntemi enzimatik ekstraksiyon kısmı başlatıldı sonra, kalan saflaştırma işlemi numune verimi arttırmak ve örnek işleme hatayı azaltmak için bir robot iş istasyonu kullanılarak otomatik edildi. Kanatlı dışkı ve çöp örnekleri işlerken katı mekanik ve enzimatik DNA ekstraksiyon yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu yeni hibrid yöntemi nicel dikkate iyi genel kombine performansı, toplam bakteri topluluklarının tahminleri (microbiomics kullanarak) (16S rRNA qPCR kullanarak) ve nitel sağlanan .

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karmaşık klinik veya çevresel örnekleri (örneğin, dışkı, toprak) analiz ederken, DNA'nın çıkarılması için kullanılan iki ana metodoloji vardır. Birincisi, yoğun bir boncuk çırpma aşaması kullanılarak matrisin mekanik olarak bozulmasıdır, ikincisi ise bakteri hücrelerini kimyasal olarak serbest bırakmak ve aynı anda matristen PCR inhibitörlerini inhibe etmek için matrisin enzimatik bir bozulmasıdır. Bu iki tür ekstraksiyon yönteminin çalıştığı farklı araçlar göz önüne alındığında, önceki çalışmaların uygun DNA ekstraksiyon yönteminin hem yüksek oranda numuneye hem de analize bağlı olduğunu göstermesi şaşırtıcı değildir. Karşılaştırmalı DNA ekstraksiyon çalışmaları daha önce bazı yöntemlerin çevresel örneklerden1-3 elde edilen DNA kalitesi ve miktarının iyileştirilmesi için daha uygun olduğunu gösterirken, diğerleri denatüre edici gradyan jel elektroforezi (DGGE)4-6, terminal kısıtlama fragmanı uzunluk polimorfizmi (T-RFLP)7, otomatik ribozomal intergenik aralayıcı analizi (ARISA)8 ve filogenetik mikrodiziler9 gibi topluluk düzeyinde analizler için iyileştirmeler göstermiştir. Bu nedenle, özellikle bakteri topluluğu analizlerindeki son gelişmeler göz önüne alındığında, çevresel örneklerin türlerine ve bu örnekler üzerinde gerçekleştirilen analiz türlerine göre uygun DNA ekstraksiyon yöntemlerinin kullanılması veya geliştirilmesi gerekmektedir.

Yeni nesil dizileme, daha kantitatif topluluk değerlendirmeleri (örneğin, kantitatif PCR (qPCR)) ile bağlantılı olarak, çevresel ve klinik bilimlerde daha yaygın hale geliyor, ancak DNA ekstraksiyon yöntemlerinin bu veri setleri üzerindeki etkisini belirlemek için çok az araştırma yapılmıştır. DNA ekstraksiyonu karşılaştırma çalışmalarının çoğu, tarımsal hayvan örneklerinden değil, insan veya insan model örneklerinden10,11 elde edilen mikrobiyomik topluluk tahminleriyle ilgilendi. Kanatlı odaklı az sayıdaki yeni nesil dizileme çalışması, spesifik metagenomik12,13 veya mikrobiyomik14 sorularını ele aldı; DNA ekstraksiyon yönteminin elde edilen mikrobiyomik analizler üzerindeki etkisini tartışmadılar. Kümes hayvanı üretimiyle ilgili çevresel örneklerin (örn. dışkı, altlık/yatak takımı, mera toprağı) karmaşık doğası göz önüne alındığında, DNA ekstraksiyon yöntemlerinin dikkatli bir şekilde seçilmesi gerekir. Kümes hayvanlarıyla ilgili çevresel numunelerin çok sayıda PCR inhibitörü içerdiği bilinmektedir ve PCR ve müteakip aşağı akış analizi için 500 kata kadar DNA özü seyreltmeleri gerekli olmuştur15-17. Bu nedenle, sadece matrisi fiziksel olarak bozmak için değil, aynı zamanda mevcut çok sayıda inhibitörü azaltabilmek/ortadan kaldırabilmek için DNA ekstraksiyon yöntemlerinin bu tür numuneler için optimize edilmesi önemlidir.

Enzimatik bir ekstraksiyon yöntemi olan QIAamp DNA Dışkı Mini Kiti, zor bağırsak/dışkı örneklerinden(1,18,19) DNA ekstrakte edilirken "altın standart" olarak kabul edilmiştir ve kümes hayvanı çevre örneklerine başarıyla uygulanmıştır8,14. PCR inhibitörlerinin tescilli bir matris kullanılarak enzimatik olarak uzaklaştırılması, otomatik iş istasyonları kullanarak verimi önemli ölçüde artırma (ve numune işleme hatasını azaltma) yeteneği gibi, bu tür çevresel numuneler için bu yöntemi kullanmanın en büyük avantajlarından biridir. Önemli bir dezavantaj, bakteri hücrelerini çevresel matristen fiziksel olarak ayırmak için mekanik bir homojenizasyon adımının olmamasıdır. Kanatlı kökenli olmayan bağırsak ve dışkı örneklerini test ederken, bir DNA ekstraksiyon protokolüne boncuk çırpma veya mekanik bozulma adımının eklenmesi, ekstraksiyon verimliliğini9, DNA verimi/kalitesi1,4,5'i önemli ölçüde artırdı ve zenginlik, çeşitlilik ve kapsama açısından aşağı akış topluluk analizlerini önemli ölçüde iyileştirdi5,6,11. Bu çalışmalar sadece mekanik boncuk çırpma yöntemlerini "altın standart" enzimatik yöntemle karşılaştırmakla kalmadı, aynı zamanda bazıları sonuçları iyileştirmek için mekanik boncuk çırpma adımını enzimatik protokole ekledi6,9,11.

Yukarıdaki çalışmalardan elde edilen sonuçlara göre, bakteri topluluğu analizleri (hem kalitatif hem de kantitatif), enzimatik yönteme mekanik bir homojenizasyon aşamasının eklenmesi yoluyla kümes hayvanlarıyla ilgili çevresel örneklerden iyileştirilebilir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı iki yönlüydü: (1) hem mekanik (güçlü homojenizasyon adımı) hem de enzimatik (PCR inhibitörü uzaklaştırma ve otomasyon) ekstraksiyon yöntemlerinin en çok arzu edilen yönlerini kullanan yeni bir DNA ekstraksiyon tekniği geliştirmek ve (2) bu yeni yöntemin kantitatif (qPCR yoluyla) ve kalitatif (mikrobiyomik yoluyla) bakteri topluluğu değerlendirmelerini temsili mekanik ve enzimatik yöntemlerle karşılaştırmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çevre Kanatlı Üretim Örnekleri 1. Mekanik Homojenizasyon

  1. Ekstre önce, 95 ° C'ye kadar bir su banyosu ve bu, su banyosu zaman bu ısıya varılması için izin verir.
  2. 2 ml Parçalama Matrisi e tüpüne toprak veya dışkı maddesinin 0.33 g tartılır.
    1. Bu tüpün kapasitesini aşan için aşağıdaki çözümleri neden olacağından, tüp numune 0.33 g aşmayın.
    2. RT çözülme dondurulmuş örnekler ağırlığında önce.
    3. Toprak / dışkı 1 g toplam analiz etmek için, dışarı 3 tartmak her çevresel numune için 0.33 gr örnekleri çoğaltmak.
    4. Ekstre etmeden önce konik matris, boruların içinde -20 ° C'de saklayın örnekleri, gerekirse.
  3. 825 ul Sodyum Fosfat Tampon ve örnek bir tüpe PLS çözeltisi 275 ul ekleyin. ~ 15 saniye boyunca bir vorteks ile karıştırın ve daha sonra 5 dakika için 14,000 x g'de örnekleri santrifüj.
  4. Superna Durusutant Tampon ASL 700 ul ekleyin ve. 5 saniye boyunca bir vorteks ile karıştırın.
    1. Tepeboşluğu bu noktada konik tüp mevcut (~% 10, toplam hacim) olduğundan emin olun. Herhangi bir tepe boşluğu varsa, borular çapraz kontaminasyon ve / veya örnek kaybına neden olabilir sonraki homojen hale getirme adımı sırasında sızıntı eğilimi olacaktır.
  5. Bir FastPrep 24 Aracı içine örnekleri yerleştirin ve 40 saniye boyunca 6.0 m / sn hızında örnekleri homojenize.
  6. 5 dakika boyunca 14.000 xg'de homojenize örnek santrifüjleyin. Steril 2 ml mikrosantrifüj tüp süpernatant aktarın.
  7. Örnekten DNA kurtarma maksimize etmek için, tekrar aynı steril, 2 ml mikrosantrifüj tüp içine süpernatantlar birleştirerek, 1,4-1,6 adımları.

Örnek homojenatlarında İnhibitörlerinin 2. enzimatik inhibisyonu

NOT: Bu protokol QIAamp DNA Tabure Mini Kit kullanır.

  1. Kuluçkaya yatmak5 dakika süre ile 95 ° C su banyosu içinde yüzer yüzer içinde herhangi bir kalan hücreler DNA geri kazanımı maksimize etmek.
    1. Çoğunlukla, Gram-negatif organizmalar içeren örneklerin, 70 ° C'de inkübe edilir. Gram-pozitif organizmalar (kanatlı dışkı örneklerinde olduğu) mevcut olan, ancak, 95 ° C de inkübe edilir.
    2. Basınç bu mühürlü mikrosantrifüj tüplerinde kurmak gibi tüpler açık "pop" olmaz emin ve potansiyel örnek hacmi kaybetmek mikrosantrifüj tüpleri plastik kilitleme klipleri kullanın.
  2. Basınç, yeniden kap mikrosantrifüj tüpleri bırakın ve 15 saniye için bir girdap kullanarak karıştırmak için her mikrosantrifüj tüp açın.
  3. , 1 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin süpernatan 1.2 mi çıkarmak ve yeni bir 2 ml'lik steril mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirin.
  4. Her bir numune için 1 Inhibitex sekmesine ekleyin ve örnek bir homojen beyaz / kirli beyaz bir sıvı haline gelene kadar bir girdap kullanarak karıştırın.
    1. T kaçınınnumuneyi içeren mikrosantrifüj tüp içine yerleştirirken Inhibitex sekmesini ouching. Bunu gerçekleştirmek için, açık mikrosantrifüj tüp üzerinde doğrudan sekmesini içeren blister paketi yerleştirin ve yavaşça kabarcık paketinin dışında ve mikrosantrifüj tüpe sekmesini itin.
  5. 5 dakika boyunca 14.000 x g'de oda sıcaklığında (-25 ° C), 1 dakika için örnek ve santrifüj inkübe edin.
  6. 5 dakika için 14,000 x g'de bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj tüm sıvı aktarın.
    1. Sıvı aktarımı sırasında adım 2.5 sonunda mikrosantrifüj tüpü altındaki topak olabilecek herhangi bir diğer parçacık kaçının.

Qiacube süreci Robotik Workstation Kullanımı 3. Otomatik DNA Saflaştırma

Not: plastik sarf sayısı, santrifüj içinde deneme türbin çarkına adaptörleri düzenlenmesi, ve tamponlar / solüsyonlar gerekli hacimleri, num bağlıdırçalışma ediliyor örneklerin ber.

  1. Rotor adaptörleri içinde uygun yuvalara elüsyon tüpleri ve filtre tüpleri ekleyin. Her numune için, rotorun adaptörün orta yuvaya 400 ul ekle. Numune sayısı arıtıldıktan göre doğru düzende iş istasyonu santrifüj rotor adaptörleri yerleştirin.
    1. Bir başarısızlık arıtma protokolünün santrifüj adımlarından biri sırasında kesme neden olabilir bunu beri mikrosantrifüj tüp kapakları tüm düzgün rotor adaptörü içinde güvenli olduğundan emin olun.
  2. Iş istasyonuna 1.000 ul ve 200 ul filtre ipuçları gerekli sayıda ekleyin ve tamponların gerekli hacmi ile birlikte tampon şişeleri doldurmak.
    NOT: Bu arıtma protokolü (AL, AW1, AW2 ve AE) için gerekli tamponlar tüm QIAamp DNA Tabure Mini Kit içinde yer alır. Kullanıcı AW met için gerekli olan% 100 etanol tedarik gerekiyorffers ve arıtma işleminde kullanılan bir solüsyon olabilir.
  3. Bir steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine verilen proteinaz K çözeltisi gerekli hacmi ekleyin ve iş istasyonu üzerinde yuva A içine yerleştirin. Ayrıca, iş istasyonunun çalkalama bölümüne 2 ml güvenli kilit mikrosantrifüj örnek tüpleri RB (saflaştırılmış olan örneklerin sayısına eşit) gerekli numarayı ekleyin.
    1. Örnek tüplerin kapakları sıkıca makine başlangıçta gerekli tüm plastik ve sıvılar talep için kullanılabilir olduğundan emin olmak için iş istasyonu tararken bir hata neden olur bunu bir başarısızlık beri, iş istasyonunda uygun yuvalara yerleştirilir emin olun koşmak.
  4. Patojen Algılama Protokolü ve iş istasyonu doğru yüklendiğini emin sonraki ekranlar aracılığıyla okuma - İnsan Tabure - iş istasyonunda dokunmatik ekranı kullanarak, DNA Tabure seçin. Bir kez tüm onay ekranları bu protokolü çalıştırmak için, Başlat geçirilir.
    1. 12'den fazla örneklerinden DNA ayıklanması ise 12 numune bir çalışma iş istasyonunda tamamlamak için ~ 72 dk sürer, çünkü, numunelerin sonraki seti için homojenizasyon işlemi (Adım 1) başlar.
  5. Sonraki mansap analizler için gerekli olana kadar -20 ° C'de, rotor adaptörleri numune kaldırmak, onları kap, ve yer.
    1. Bu noktada, bir santrifüjleme / buharlaştırma tabanlı sistemi kullanılarak tek bir numune (toplam analiz miktarı = 1 g), 3 suret saflaştınlmasını birleştirir. Tris-EDTA tampon maddesi içinde 100 ul bir son hacme çoğaltır ve yeniden elüte birleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma için, taze dışkı pisliği ve çöp örnekleri güneydoğu ABD'de ticari broiler evi (~ 25.000 kuş) elde edildi. piliçler (Gallus gallus) Cobb-500 haçlar vardı ve onlar örnekleme zamanında 59 gün eski. Taze dışkı ve çöp örnekleri (waterer / besleyici hatları arasında, waterer / besleyici hatlarının yakınında, soğutma pedi yakın ve egzoz fanları yakın) evin içinde dört farklı alanda kurtarıldı ve bu alanların her birinden örnekler toplanmış beş içeriyordu bu alan içinde örnekler. Evin dört alanlarından örnek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemi örneği daha önce 1,3,6 görülen DNA ekstraksiyon yöntemleri bağımlı doğasını analiz destekleyen, hem dışkı ve çöp örneklerin nicel ve nitel toplam bakteri topluluğu tahminleri etkilemiştir. Dışkı ve çöp numuneler hem için, DNA ekstraksiyon yöntemleri performans sırası nicel (Mekanik> Hybrid> Enzimatik) ve nitel (enzimatik> Hybrid> Mekanik) toplam bakteri topluluğu tahminleri için farklı oldu. Melez yöntem yüksek nicel veya nitel tahminler üretmek değil iken, her ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, numune alımındaki yardımları için Latoya Wiggins ve Katelyn Griffin'e ve numune alma ve moleküler analizlerdeki yardımları için Laura Lee Rutherford'a teşekkür eder. Mikrobiyomik örnek hazırlama ve dizileme için Argonne Ulusal Laboratuvarı'ndan Sarah Owens'a da teşekkür ederiz. Bu araştırmalar, Tarımsal Araştırma Servisi, USDA CRIS Projeleri "Kanatlı İşleme Sistemlerinde Patojen Azaltma ve İşleme Parametreleri" #6612-41420-017-00 ve "Kanatlı Hayvanlarda Gıda Kaynaklı Patojenlerin Karakterizasyonu için Moleküler Yaklaşımlar" #6612-32000-059-00 tarafından eşit olarak desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lysing Matrix E tüpMPBio6914-050Farklı boyutlar mevcuttur ve kedinin son 3 numarası. Hayır. boyutu belirtin (-050 = 50 tüp, -200 = 200 tüp, -1000 = 1.000 tüp)
Sodyum Fosfat ÇözeltisiMPBio6570-205Ayrı olarak satın alınabilir veya dışkı için FastDNA Spin Kitinde bulunabilir (Kat. 116570200)
PLS TamponMPBio6570-201
Tampon ASL (560 ml)Qiagen19082
FastPrep 24 homojenizatörMPBio11600450048 x 2 ml HiPrep adaptörü (Kat. No. 116002527) mekanik homojenizasyon adımının verimini iki katına çıkarmak için kullanılabilir
QIAamp DNA Tabure Mini KitiQiagen51504
QIAcube24 (110V)Qiagen9001292Ön sonuçlar, QIAcube HT (Kat. Hayır. 9001793) verimi artırmak için kullanılabilir, ancak bu makine için farklı sarf malzemeleri gereklidir ve daha karşılaştırmalı çalışma yapılması gerekir.
Filtre Uçları, 1.000 ml (1024)Qiagen990352
Filtre Uçları, 200 ml (1024)Qiagen990332
QIAcube Rotor Adaptörleri (10 x 24)Qiagen990394Rotor adaptör kitinde bulunan 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüpleri için bir alternatif vardır. Sarstedt Mikro tüp 1.5 ml Güvenlik Kapağı, Cat'tir. No. 72.690
Numune Tüpleri RB (2 ml)Qiagen990381Alternatif: Eppendorf Safe-Lok mikro test tüpü, Cat. 022363352

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maukonen, J., Simoes, C., Saarela, M. The currently used commercial DNA-extraction methods give different results of clostridial and actinobacterial populations derived from human fecal samples. FEMS microbiology ecology. 79, 697-708 (2012).
  2. Tang, J. N., et al. An effective method for isolation of DNA from pig faeces and comparison of five different methods. Journal of microbiological. 75, 432-436 (2008).
  3. McOrist, A. L., Jackson, M., Bird, A. R. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. Journal of microbiological. 50, 131-139 (2002).
  4. Ariefdjohan, M. W., Savaiano, D. A., Nakatsu, C. H. Comparison of DNA extraction kits for PCR-DGGE analysis of human intestinal microbial communities from fecal specimens. Nutrition journal. 9, 23(2010).
  5. Carrigg, C., Rice, O., Kavanagh, S., Collins, G., O'Flaherty, V. DNA extraction method affects microbial community profiles from soils and sediment. Applied microbiology and biotechnology. 77, 955-964 (2007).
  6. Smith, B., Li, N., Andersen, A. S., Slotved, H. C., Krogfelt, K. A. Optimising Bacterial DNA Extraction from Faecal Samples: Comparison of Three Methods. The Open microbiology journal. 5, 14-17 (2011).
  7. Claassen, S., et al. A comparison of the efficiency of five different commercial DNA extraction kits for extraction of DNA from faecal samples. Journal of microbiological. 94, 103-110 (2013).
  8. Scupham, A. J., Jones, J. A., Wesley, I. V. Comparison of DNA extraction methods for analysis of turkey cecal microbiota. Journal of applied microbiology. 102, 401-409 (2007).
  9. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of microbiological methods. 81, 127-134 (2010).
  10. Peng, X., et al. Comparison of direct boiling method with commercial kits for extracting fecal microbiome DNA by Illumina sequencing of 16S rRNA tags. Journal of microbiological. 95, 455-462 (2013).
  11. Yuan, S., Cohen, D. B., Ravel, J., Abdo, Z., Forney, L. J. Evaluation of methods for the extraction and purification of DNA from the human microbiome. PloS one. 7, 33865(2012).
  12. Qu, A., et al. Comparative Metagenomics Reveals Host Specific Metavirulomes and Horizontal Gene Transfer Elements in the Chicken Cecum Microbiome. PloS one. 3, 2945(2008).
  13. Sekelja, M., et al. Abrupt temporal fluctuations in the chicken fecal microbiota are explained by its gastrointestinal origin. Applied and environmental microbiology. 78, 2941-2948 (2012).
  14. Oakley, B. B., et al. The Poultry-Associated Microbiome: Network Analysis and Farm-to-Fork Characterizations. PloS one. 8, 57190(2013).
  15. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Eiteman, M. A., Lovanh, N., Sistani, K. Evaluation of nitrogen retention and microbial populations in poultry litter treated with chemical, biological or adsorbent amendments. Journal of environmental management. 92, 1760-1766 (2011).
  16. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Eiteman, M. A., Sistani, K. Microbial mineralization of organic nitrogen forms in poultry litters. Journal of environmental quality. 39, 1848-1857 (2010).
  17. Rothrock, M. J., Cook, K. L., Warren, J. G., Sistani, K. The effect of alum addition on microbial communities in poultry litter. Poultry science. 87, 1493-1503 (2008).
  18. Li, M., et al. Evaluation of QIAamp DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota. Journal of microbiological. 54, 13-20 (2003).
  19. Dridi, B., Henry, M., El Khechine, A., Raoult, D., Drancourt, M. High precalence of Methanobrevibacter smithii and Methanosphaera stadtmanae detected in the human gut using an improved DNA detection protocol. PloS one. 4, 7063(2009).
  20. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environmental science and technology. 37, 343-351 (2003).
  21. Rothrock, M. J. Comparison of microvolume DNA quantification methods for use with volume-sensitive environmental DNA extracts. Journal of natural and environmental sciences. 2, 34-38 (2011).
  22. Navas-Molina, J. A., et al. Methods in Enzymology. DeLong Edward, F. 531, Academic Press. 371-444 (2013).
  23. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME journal. 6, 1621-1624 (2012).
  24. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 Suppl 1, 4516-4522 (2011).
  25. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods. 7, 335-336 (2010).
  26. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics. 27, 2194-2200 (2011).
  27. Edgar, R. C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 26, 2460-2461 (2010).
  28. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
  29. Caporaso, J. G., et al. PyNAST: a flexible tool for aligning sequences to a template alignment. Bioinformatics. 26, 266-267 (2010).
  30. Price, M. N., Dehal, P. S., Arkin, A. P. FastTree 2–approximately maximum-likelihood trees for large alignments. PloS one. 5, 9490(2010).
  31. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Lovanh, N., Sorrell, J. K., Loughrin, J. H. Spatial and temporal changes in the microbial community in an anaerobic swine waste treatment lagoon. Anaerobe. 16, 74-82 (2010).
  32. Cook, K. L., Rothrock, M. J., Warren, J. G., Sistani, K. R., Moore, P. A. Effect of alum treatment on the concentration of total and ureolytic microorganisms in poultry litter. Journal of environmental quality. 37, 2360-2367 (2008).
  33. Lovanh, N., Cook, K. L., Rothrock, M. J., Miles, D. M., Sistani, K. Spatial shifts in microbial population structure within poultry litter associated with physicochemical properties. Poultry science. 86, 1840-1849 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Hybrid DNA ExtractionMechanical HomogenizationEnzymatic ExtractionBead BeatingRobotic WorkstationPCR Inhibitor Removal16S rRNA qPCRMicrobiome AnalysisPoultry Fecal SamplesEnvironmental Sample Processing

İlgili makaleler