Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak bir protein fotoreseptörünün yapısını araştırmak için bir yöntem bu yazıda açıklanmıştır. PeakForce Kantitatif Nanomekanik Özellik Haritalama (PF-QNM), mika yüzeyindeki bozulmamış protein dimerlerini ortaya çıkarır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu
Bu makalede
Özet
Özet
Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM), bir yüzeyin bir güç yanıtı araştırmak için bir konsol bağlı bir piramit şeklinde bir uca kullanır. Ucunun çökme görüntü topografisine dönüştürülebilen bir lazer ve bölümlere ayrılmış detektör tarafından ~ 10 pN ölçülebilir. Genlik modülasyonu veya "dokunarak modu" AFM bir görüntü üretmek için rezonans frekansında titreşen ise yüzeyi ile aralıklı temas probu içerir. Bir sıvı hücre ile birlikte kullanılan, dokunarak modu AFM gibi fizyolojik ilgili koşullarda proteinler gibi biyolojik makromoleküllerin görüntüleme sağlar. Dokunulduğunda mod AFM probu ve deneyimsiz kullanıcılar için zor olabilir tarama parametreleri çok sayıda sık ayarlamaları manuel ayar gerektirir. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için, bu ayarlamalar çok zaman tüketir.
PeakForce Kantitatif Nanomekanik İşletme Haritalama (PF-QNM) bir kuvvet yanıtlayanların ölçerek bir görüntü oluştururnumune ile temas her noktada için tek başlarına eğrisi. ScanAsyst yazılım ile, PF-QNM otomatik olabilir. Bu yazılım otomatik olarak belirli bir örnek için ayar noktası, sürücü frekansı, tarama hızı, kazanç, ve diğer önemli tarama parametreleri ayarlar. Sadece bu süreç kırılgan sondaları ve örnekleri hem koruyor, önemli ölçüde yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için gerekli süreyi azaltır. PF-QNM sıvı AFM görüntüleme için uyumludur; Bu nedenle, biyolojik olarak ilgili malzemeleri görüntülenmesi için geniş bir uygulama alanına sahiptir.
Bu çalışmada sunulan yöntem, fotosentez R. gelen bir bakteriyel kırmızı ışık fotoreseptör, RpBphP3 (P3) görüntüler elde PF-QNM uygulanmasını açıklar onun ışık adapte devlet palustris. Bu yöntem kullanılarak, bireysel protein P3 dimerleri ve dimerlerin agrega bir görüntüleme tampon varlığında bir mika yüzeye gözlenmiştir. Uygun yüzey ayarlamalar ve / veya çözelti konsantrasyonu Bu yöntemle,genel olarak diğer ilgili biyolojik makromoleküller ve yumuşak malzemeler için uygulanabilir.
Giriş
Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 1986 yılında buluşun (Şekil 1) bu yana yüzeyleri, ince filmlerin ve tek moleküllerin yapısal ve mekanik özelliklerin belirlenmesi için çok önemli bir araç haline gelmiştir. 1-3 sıvı hücreyi kullanarak, bu yöntemin fizyolojik olarak ilgili olan bir ortamda biyolojik makromoleküllerin çalışmaları ve hatta canlı hücrelerde özellikle faydalı olur. AFM geleneksel iletişim modu AFM, çünkü yumuşak bir malzeme veya yüzeyine gevşek bağlı molekülleri görüntülenmesinde kullanılmıştır 4-10 dokunulduğunda mod nedeniyle tipik olarak uygun değildir yanal kuvvetlerin neden zarar dirsek tarafından numune üzerinde....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Bilgisayar ve Mikroskop Kurma
- N 2 silindir vanasını açın ve hava masa yüzen ve seviye sağlamak için kolları ayarlayın.
- Bu sırayla bilgisayar, kontrolör ve fiber optik ışık açın.
- AFM / LFM moduna tarayıcıyı ayarlayın ve AFM başının üzerinde kamera ortalamak.
- Açık yazılım. Seç deneme kategori "Nanomekanik Özellikleri", deney grubu altında "Niceliksel Nanomekanik Haritalama" ve deney altındaki "Sıvı içinde PeakForce QNM". Yük Deney ve ardından Kur'u tıklatın.
- Sahnenin yüzeyini görmek için Z objektif kullanarak kamerayı odaklanın. / Aşağı kaba kadar kullanılması piezos yaklaşık 1 mm AFM kafası açıklığı ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hafif uyarlanmış halde bir fotoreseptör protein, P3, temsili AFM görsel, Şekil 3 ve 4'te sunulmaktadır. Bir taze kırılmış mika alt-tabaka (Şekil 3A) protein adsorpsiyonu için uygun, düz bir yüzeydir. Bir negatif kontrol olarak, temiz mika bir görüntü toplama çeşitli nedenlerle önemlidir. İlk olarak, sıvı hücre temiz temin edilmiş olup, önceki deneylerden elde edilen herhangi bir kalıntı malzemeler yüzey kirletecektir. İkinci olarak, bu sonda kalitesini test eder. Prob k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
AFM fizyolojik ilgili koşullarda proteinler ve diğer biyolojik makromoleküllerin görüntüleme tamamen yetenekli bir tarama prob mikroskop yöntemidir. X-ışını kristalografisi ve NMR ile karşılaştırıldığında, AFM biri sınırlama aynı çözünürlüğü, özellikle yanal çözünürlük elde etmek için onun yeteneksizliği. Herhangi bir yüzey üzerinde bir molekül analiz etmek için kullanıldığında, AFM veriler incelendiğinde, molekülün görüntü yüzeyinin etki ve sonda da göz önüne alınmalıdır. Elde edilen görüntünün üzerine sondanın etkisi .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Rekabet eden finansal çıkarlar veya çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
NSF-MR program (CHE: 1229103) yeni kontrol elektroniği, yazılım, sıvı hücreleri ve bir çift AFM / STM montajı için gerekli diğer ekipmanların satın finansman için kabul edilmektedir. Biz AFM enstrümantasyon, eğitim ve görüntüleme ile yardım Chicago NSF-MRSEC programının Üniversitesi (DMR-0820054) de ortak tesisler kabul ve enstrüman süre Malzeme Araştırma Olanakları Ağı (DMR-0820054) hazır. Biz özellikle bizim kampüs için gerekli enstrümantasyon getirdi NSF-MR teklifin finansmanı önce öğrencilerimizi ağırlamak için Dr Qiti Guo, Dr Justin Jureller ve Prof Ka Yee Lee teşekkür ederim. Sarf malzemeleri için yaz araştırma öğrenci ve öğretim burslarını yanı sıra destek sağ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Çok Modlu 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | Nanoscope V denetleyici ve J tarayıcı ile donatılmış |
| Bruker-Nano | SNL-10 | , ScanAsyst-Fluid+ | |
| Kılavuz Çekme Modu Akışkan Hücresi | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mika V-4 Sınıf | SPI malzemeleri | 1150503 25 | x 25 x .26 mm |
| Örnek destek diski | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri kabı | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| mikropipetleyiciler | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Alıntı yapılan referanslara göre hazırlanmıştır | ||
| Nanoscope yazılımı | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optik Işık | Dijital Aletler A.Ş. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disk Tutucu | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml şırınga | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tüpleri | Denville Scientific | C2171 | |
| Pymol Moleküler Grafik Sistemi v.1.5.0.1 | Schrödinger, LLC |
Kaynaklar
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, Available from: http://dx.doi.org/10.1103/PhysRevLett.56.930 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (19....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
