İzolasyon ve Kemirgen Aort eksizyonu; Kardiyovasküler Hastalığı Çalışmasında Çok Yönlü Tekniği

Summary

Aort patolojisi ciddi morbidite ve mortaliteye yol açabilir, bu nedenle hastalığın ilerlemesi ve potansiyel tedavilerin araştırılması gereklidir. Burada, araştırmacılara kardiyovasküler hastalık araştırmalarında yardımcı olmak için murin aortunu izole etmek ve eksize etmek için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Kardiyovasküler hastalık, kalp ve/veya kan damarlarının hastalığını tanımlayan geniş bir terimdir. Vücuda oksijenli kan sağlayan ana kan damarı aorttur. Ateroskleroz ve anevrizma gibi hastalıklarda aort damarı etkilenebilir. Bu hastalıkları araştıran araştırmacılar, hastalığın ilerlemesini karakterize etmek ve potansiyel terapötiklerin etkinliğini değerlendirmek için aortun doğrudan gözlemlenmesinden faydalanacaktır. Bu protokolün amacı, kardiyovasküler hastalıkları araştıran araştırmacılara yardımcı olmak için aortun uygun izolasyonunu ve eksizyonunu tanımlamaktır. Aortun izolasyonu ve eksizyonu, araştırmacıların brüt morfometrik değişikliklere bakmalarına ve istenirse histolojik değişikliklere bakmak için dokuyu korumalarına ve boyamalarına izin verir. Aort, ilgilenilen hedefleri ve etki mekanizmalarını keşfetmek için protein ve gen ekspresyonunu değerlendirmek için moleküler çalışmalar için kullanılabilir. Bu teknik, teknoloji ve maliyet açısından doğal sınırlamaları olduğu için görüntüleme modalitelerinden üstündür. Ek olarak, yeni izole edilmiş ve eksize edilmiş bir aorttan birincil izole edilmiş hücreler, araştırmacıların in situ ve in vitro tahliller yapmasına izin verebilir. Aortun izolasyonu ve eksizyonu, hayvanı feda etmek zorunda kalma sınırlamasına sahiptir, ancak bu durumda, aort hastalığı çalışmasında en çok yönlü teknik olduğu için faydalar zarardan daha ağır basar.

Introduction

Aort oksijenli kan ve vücut burada da benzer kısımlar ile vücut temin kardiyovasküler fonksiyon çok önemli bir rol oynar, hastalığa karşı hassastır. Ortak aort hastalıkları diyet, sigara ve sedanter yaşam tarzı ¹ olmak üzere genetik ve çevresel faktörlerin sonuçları ateroskleroz ve anevrizma içerir. Ateroskleroz, tipik olarak kronik hiperlipidemi ² olan hastalarda bulunan aort duvarının bir kalsiyum ve lipit bazlı plak birikmesidir. Anevrizma sonuçta ³ yırtılmasına neden olabilecek bir artış çapı ardından aorta ve damar duvarının incelme yapısal elemanların bozulma ile karakterize edilir.

Hayvan modelleri hastalık ve potansiyel tedavilerin etkinliğinin mekanizmasını incelemek için kullanılan önemli araçlardır. Kardiyovasküler araştırmalarda yaygın olarak kullanılan hayvan modelleri, özellikle vasküler ve metabolik bozuklukların araştırılması aratmakBöyle Apolipoprotein E gen nakavt ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör gen nakavt fareler ⁴ olarak lipid düzeylerini değiştirmek için genetiği değiştirilmiş fareler vardır. hastalık ve tedavinin etkinliğinin mekanizmasının değerlendirilmesi için yöntemlerin çoğunluğu, aort izole edilmesini ve çıkarılmasını içerir.

Aort lokalize ve izole edildikten sonra, morfometrik analizi, anevrizma varlığında, tipik olarak çap ⁵ daha büyük bir% 50 artış olarak tarif edildiği gibi belirlenebilir. Yerinde analiz gerekli işlemi tamamlandıktan sonra, aort, ileri analiz için çıkartılır. Bir eksize edilen aort örneğin protein ve / veya gen sentezleme tahlilleri ya da moleküler çalışmalar yapmak için dondurulmuş flaş olabilir% 4 paraformaldehid ile sabitlenmiş ve sonra sarılır, bölümlere ayrılır ve histopatolojik analiz için boyanmıştır. Aort histolojik analiz gibi yapısal bozulma, plak oluşumu ve lökositlerin sızması gibi aort hastalığı ortak özellikler göstermektedir ^{6,7. Buna ek olarak, bir eksize edilen orta damar alındı, in vitro çalışmalar 7 çok çeşitli kullanılabilir endotel ve düz kas hücreleri dahil olmak üzere birincil hücre hatları izole etmek için kullanılabilir.}

Şu anda, aort hastalığı bu derinlemesine karakterizasyonu sağlamak yanı sıra kardiyovasküler hastalık çalışma araçları ile araştırmacılara sunmak için başka yöntemler vardır. Manyetik rezonans görüntüleme, bilgisayarlı tomografi ve ultrasonografi gibi görüntüleme yöntemleri ancak bu küçük hayvanlarda zor ve yeterli teknolojisine sahip bir aygıtı elde ⁸ pahalı, morfolojik aorta değerlendirmek için yakın yöntemlerdir. Ölümsüzleşmiş hücre hatları, ancak bu hücrelerin yapay doğa hücre yaşam döngüsü ve apoptoz ⁹ üzerindeki etkileri araştırmakla sınırlayıcı hastalık ve tedavilerin etkinliğinin potansiyel mekanizmaları, araştırmak için satın alınabilir.

genel amacıBu yazının kardiyovasküler hastalık soruşturma kemirgen aorta steril izolasyon ve eksizyonu göstermektir.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri, Cincinnati Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca onay (NIH Yayın No. 85-23 ile yapıldı ) 1996 Revize.

1. Fare Hazırlanması

1. Anestezik bir tedavi üstü doz hayvan teşhir ederek Euthanize, izofluran etkisi inhale. Bir zararlı uyarıcı olarak ayak tutam yoluyla birincil ötenazi doğrulayın. Ötenazi, diyafram kesme İkincil yöntem, yaklaşan adım ortaya çıkar. Alternatif yöntemler kullanılmıştır verilen ötenazi elde edilir edilebilir.
2. Sanitizie nem alanına için% 70 etanol ile, ilk kesim yapılacaktır karın bölgesi boyunca kürk püskürterek fare dış yüzeyi, böylece kürk, etanol ile ıslatılmış ve herhangi bir serbest / kuru tüyleri girmezler bölge.
3. Bir sur üzerinde fare dışarı LayÜst ve alt uzantıları ile yatar pozisyonda rahi kurulu dışa genişletilmiş.
4. Cerrahi bandı kullanarak kuruluna Güvenli uzantıları.

Kalp ve Aort 2. izolasyonu

1. Farenin doğru konumlandırma sonra, bulmak ve sternum kılıç şeklinde sürecine sadece aşağı karın cildi izole etmek forseps kullanabilir.
2. Düz yukarı kaldırarak cilt gerginliği oluşturun ve periton ve göğüs boşluğunun alt kısmının üstün kısmını açığa yüzeysel cilt kaldırmak için makas kullanın.
3. Kılıç şeklinde sürecini kaldırma ve subkostal kenarları boyunca sürecine sadece aşağı yan kesiler yaparak periton boşluğuna girin.
4. Kalp veya herhangi bir büyük kan damarları lacerate emin olmak, diyafram geçiyor, göğüs boşluğuna kadar parçalara ayır.
5. Göğüs kafesi ön kısmını kaldırmak için adım 2.3 cranially yapılan yanal kesiler uzatın. EğerGerekli, künt diseksiyon ile göğüs ön duvarından kalp ücretsiz.
6. Malzeme emmek için steril gazlı bez kullanılarak gereksiz kan ve sıvı göğüs boşluğunu temizleyin. Alan daha görünür sonra, daha iyi kalp ve aorta maruz akciğerleri kaldırmak.

Kalp ve Aort 3. Perfüzyon

NOT: Bu adım çok hemen önce yapmak, kalp delinerek kan elde etmek için.

1. Steril buz soğuk 1x Fosfat tampon çözeltisi (PBS), 10 ml bir 10 cc şırınga doldurun ve şırıngaya bir 25 gauge iğne takılır.
2. Yavaşça kalbin sol ventrikül içine iğne takın.
3. Perfüzyon basınç birikimini hafifletmek için sağ atrium kesin. 3 dakika - 2 üzerinde fare içine şırınga içeriğini serpmek.
4. Perfüzyon sıvıyı emmek için sağ atrium açılışında steril gazlı bez kullanın.

Aort 4. İzolasyon ve eksizyonu

1. PE tamamlanması üzerinerfusion, göğüs boşluğu içinde görüş alanını karıştırdığın kalan sıvıyı emmek için steril gazlı bez kullanın.
2. Suprapubik bölgeye kesi uzanan, karın duvarından kaudal keserek gastrointestinal içeriğini Açığa. Bilateral aşağı tuş veya eksize edilebilir cilt flep oluşturmak için alt ekstremitelerde yönünde daha fazla kesi uzatın.
3. Daha iyi aorta görselleştirmek için karaciğer, pankreas, mide, dalak, bağırsaklar ve lobları çıkarın. Aort renal arterlerin şubelerinde yüzeysel olarak, perirenal bölgesi yakınında diseksiyon dikkatli olun.
   NOT: kesin bu adımı gerçekleştirin ve gastrointestinal sistem kirlenme eğilimi artırır bakteri ile zengin olarak şekilde kaydolur.
4. 1x PBS ile bölgeyi durulayın ve bir steril gazlı bez ile emilim bütün sıvıyı çıkarın.
5. Steril Microscissors ve microforceps kullanarak, omurga dorsal ve ventral yemek borusu gelen aort ayırın.Bu künt diseksiyon ve bunun için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak kullanmak en iyisidir.
   NOT: aort izole iliyak bifürkasyonunda kaudal başlayacak ve kaudal diseksiyon karotis ve brakiyosefalik arterlerde cranially cranially temizlik ve kavite dorsal yüzeyinden aort ayıran taşımak veya başlatın. Her iki yöntem uygun ve araştırmacılar konfor kadar.
6. Aort duvarının bir kısmını kaldırmak için emin olmak ince microscissors kullanarak perivasküler yağ dokusu çıkarın. Bu aortik düz kas hücrelerinin kültür sırasında fibroblast ve kirlenme ihtimalini en aza indirmek için önemlidir.

Results

Prosedürün tamamlanmasından sonra, hala (Şekil 1A) bağlı renal arter ile göğüs ve karın boşlukları içerisine inen kalp kaynaklı sağlam bir aort, orada olacak. Buradan, aort abdominal aort anevrizması (Şekil 1B ve 1C) çalışmalarında tanısal olan morfometrik değişiklikleri ölçmek için yerinde görüntülü olabilir. Daha sonra, aort, kaldırıldı sabit ve histolojik değişikliklere bakmak lekeli olabilir. Aort genel ve ortak leke hematoksilin ve eozin boyama (Şe...

Discussion

Aort hastalığı, ciddi vakalarda önemli sistemik patolojiye ve muhtemelen ölüme yol açabilir. Tedavi seçenekleri şu anda sınırlıdır, bu nedenle bu alanda sürekli araştırma yapılması gerekmektedir¹⁰. Murin modelleri, hastalığın ilerlemesini ve potansiyel olarak tedavi seçeneklerini daha fazla incelemek için idealdir⁴. Bu nedenle, bu yazıda açıklanan yöntemin başarıyla tamamlanması, araştırmacılara hastalığın ilerlemesini ve ilaç etkinliğini ölçmek için araçlar sağlayacaktır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isofluran	Med-Vet International	#RXISO-250
%70 etanol	Fisher	07-678-001
Fosfat tamponlu salin	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Cerrahi bant	3M	1527-1
Steril gazlı bez	Dukal Corporations	1312
25 gauge iğne	BD
10 ml şırınga	BD	309604