Nedeniyle obezite ve diğer yandaş arasındaki şiddetli ve negatif bağlantı, rol adipoz araştırma hastalığında oynadığı ve genel sağlık garantilidir. Biz izolasyon ve yerinde kullanarak adipoz çalışması için izin yağ depolarında eksizyonu ve in vitro yöntemler bir protokol mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yerelleştirme, Kimlik ve Eksizyon Kemirgen Yağ depolarının
Bu makalede
Özet
Özet
Obezite son birkaç on yılda önemli ölçüde artmıştır ve yetişkin ABD nüfusunun üçte birinden fazlasını etkilemektedir. 2005 yılında obezitenin ekonomik etkisi, yalnızca doğrudan tıbbi maliyetlerde 190,2 milyar dolar gibi şaşırtıcı bir miktara ulaştı. Obezite, çok çeşitli hastalıklar için önemli bir risk faktörüdür. Tarihsel olarak, yağ ve vücuttaki ana ve temel işlevleri hakkında çok az şey biliniyordu. Kahverengi ve beyaz yağ iki ana yağ türüdür, ancak mevcut literatür brite veya bej yağ adı verilen yeni bir yağ türü tanımlamıştır. Araştırmalar, yağ depolarının belirli metabolik profillere sahip olduğunu ve bazı depoların obezite ve diğer ilgili bozukluklar için bir eğilime izin verdiğini göstermiştir. Bu protokolün amacı, araştırmacılara yağ üzerindeki farklı faktöriyel etkilerin analizine izin verecek yağ depolarını belirleme ve eksize etme kapasitesi sağlamaktır; yağın hastalık ve genel sağlıkta oynadığı yararlı veya zararlı rolün yanı sıra. Yağ depolarının izolasyonu ve eksizyonu, araştırmacıların brüt morfolojik değişikliklerin yanı sıra histolojik değişikliklere de bakmalarını sağlar. İzole edilen adipoz, transkripsiyonel ve translasyonel değişikliği değerlendirmek için moleküler çalışmalar için veya ilgilenilen hedefleri ve etki mekanizmalarını keşfetmek için in vitro deneyler için de kullanılabilir. Bu teknik, birden fazla deponun basitlik ve minimum kontaminasyon ile izolasyonuna izin veren tasarımı nedeniyle yayınlanmış diğer tekniklerden üstündür.
Giriş
Yağ nedeniyle 20. yüzyılın son birkaç on yıl içinde obezite en dramatik artış, medya spot kayda değer bir görünüm getirmişti. Obezite anda yetişkinlerin üçte biri ve Amerika Birleşik Devletleri'nde (ABD) 1 çocuk ve ergenlerin% 17 daha fazla etkiler. Tüm etnik grupları Kapsayan, obezite salgını çevreleyen istatistiksel araştırma Meksikalı Amerikalılar (% 40.4), tüm İspanyollar (% 39.1), ve olmayan kıyasla İspanyol olmayan siyahlar obezite (% 49.5) en yüksek yaşa göre düzeltilmiş oranına sahip olduğunu göstermiştir Hispanik beyazlar (% 34.3) 2. Obezitenin ekonomik etkisi de sağlık sistemi için büyüyen bir husustur. 2012 yılında, 2005 yılında ABD'de obezite için bakım yıllık tıbbi maliyeti 190.200.000.000 $, genel tıbbi harcama bütçesinin yaklaşık% 21 olduğu tahmin edilmiştir. Ne yazık ki, çocukluk çağı obezitesi tek başına doğrudan tıbbi maliyetler 14 milyar dolar sorumlu olduğu tahmin edilmiştir. İstatistiksel olarak, bu ortalama tıbbi maliyeti olduğu tespit edildiobezite ile bireylerin bu morbidite 3-5 olmayanlara göre daha yüksek 2741 $ bir yıl oldu.
Tip 2 diyabet, dislipidemi, kardiyovasküler hastalıklar, kanser, kas iskelet bozuklukları ve kronik inflamasyon: Obezite gibi durumların çeşitli için önemli bir risk faktörüdür. Obezite derinden metabolik sendrom ve diğer kronik hastalıkların 6-8 patogenezi bağlıdır. Obezite ve diğer yandaş arasında böyle sert ve olumsuz bağlantıları ile, bilimsel araştırma daha güncel salgın ve adipoz oynadığı çeşitli ve önemli rolleri anlamak için dikkat odaklanmıştır.
Tarihsel, yağ dokusu önemsiz kabul edildi ve basit bir dolgu dokusu gibi sadece görülüyordu. Metabolizma, hormon regülasyonu, inflamasyon, koruma ve izolasyon 9: Şu anda, yağ vücudun işlevi birçok temel rol oynamaya gösterilmiştir. Yağ dokusu öncelikle oluşuradipositler de perisitler, endotel hücreleri, monositler, makrofajlar ve pluripotent kök hücrelerin 8 içerir. Yağ dokusu farklı depolarda vücuda dağılır. ana depolar deri altından, kas içinden, deri altından bulunan ve içgüdüsel 10 edilebilir. Yağ depolar bozuklukları 8 obeziteye bir depo belirli duyarlılık göstermiştir ve ilgili olan depo belirli metabolik profillerin sahip olduğu gösterilmiştir.
Geleneksel, adipoz doku iki ana gruba sınıflandırılmıştır: beyaz yağ dokusu (WAT) ve kahverengi adipoz doku (BAT); Son literatür gösterir, ancak üçüncü bir grup varlıkları brite veya bej adipoz 11 vaftiz. Adipoz doku farklı renkler, morfolojileri, metabolik fonksiyonları, biyokimyasal özellikleri ve ifade 10 genetik modellerine sahip olduğu gösterilmiştir. WAT içinde Adipositler tek, büyük lipit damlacık ve mitokondri değişken miktarlarda bulunmaktadır. WATbaskın olarak vücudun deri altına ve visseral yerlerde bulunur. Birincil enerji depolama ve organ koruma alanı olarak WAT çalışır. BAT Adipositler bir multiloküler morfoloji ve bol mitokondri var. BAT öncelikle boyun ve göğüs büyük kan damarlarının yanı sıra, skapula 12 yer almaktadır. Thermogenesis 7 düzenleyen enerji sokmaksızın davranışları BAT öncelikle çalışır. Brite veya bej yağ BAT benzer bir morfoloji ve ifade paylaşmaya gösterilmiştir fakat beyaz adipositlerden 11 kaynaklandığı tespit edilmiştir.
Bu yazıda anlatılan cerrahi yöntem gibi faktörler farklı etkilerini analiz etmek kapasitesine sahip araştırmacılar sunar: çevre, ilaç ve genetik, adipoz var; de yararlı veya zararlı rol adipoz hastalığı ve genel sağlık oynar gibi. Aynı zamanda, bir yol sağlayarak tespit ve adipoz dokuda farklı izole etmek içindaha izin depoları arasındaki biyokimyasal ilişkiler ve farklılıklar anlamak. Bu vücut içindeki konumu, işlev ve yağ arasındaki ilişkinin belirlenmesinde yardımcı olabilir. Bu tarif edilen yöntem, in vitro çalışmalar için brüt görselleştirme, gen ekspresyon analizi, protein ifadesi analizi, histolojik ve birincil hücre hatlarının izolasyonu için araçlar sağlayarak gerçekleştirir. Şu anda farklı yağ depoları, yanı sıra anatomik yerlerde metabolik davranışı içgörü sağlayan birçok makaleleri vardır; ama özellikle, lokalize belirlemek ve bu depoları izole etmek için nasıl bir derinlemesine bir yöntem vermeyin. Bu durum bunların cerrahi, bir veya iki depo 13-14 bir izolat için tasarlanan diğerleri yöntemlerine göre diseksiyon ve kontaminasyon en az bir miktar ile birden fazla depo izolasyonu sağlayan bir hassas bir teknik sağlamaktadır.
Bu protokolün amacı sağlamaktırBirden fazla anatomik bölgelerden yağ depoları farklı tiplerinin belirlenmesi ve izolasyonu için kesin bir metot.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Tüm hayvan prosedürleri Cincinnati Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve (NIH Yayın No Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca onayı ile yapıldı . 85-23) 1996 Revize.
1. Euthanize ve Fare sterilize
- Izofluran bir supratheraputic dozunu içeren bir açılır kutu içinde fare yerleştirin ve etkisi nefes sağlar. Fare ötenazi sonra, kutudan çıkarın.
- Cervically ötenazi ikinci aracı olarak yerinden.
- % 70 etanol ile hayvan temizleyerek fare dış yüzeyini sterilize edin.
2. Kimlik ve Üç Farklı Yağ Depoları izolasyonu
- Kahverengi Yağ Dokusu (BAT) İzolasyon:
- Emin kürk epidermal ve dermal laye ile kesme yardımcı olmak için alkol temizliği ıslak olduğundan emin olunrs.
- Masanın karşı sırtını bir yatar pozisyonda fare yerleştirin.
- Sadece forseps, asansör ile diyafram altında cilt tut ve makasla kesilirken.
- Periton maruz fare çevresi enine kesin.
- Farenin üst yarısını deglove ile kelebek şeklinde BAT deposu ortaya koymaktadır. Bir yandan alt uzantıları ve karın tutun ve baş yukarı doğru çekerek cildi.
- Masaya eğilimli konumlandırılmış böylece fareyi yönlendirin. Saçlı maruz depo kontamine dikkatli olun.
- Temiz cerrahi aletler ve eldiven taze çifti değişiklik.
- Skapula ve ilgili depo bulun. Dikkatle kelebek üstünde herhangi bir yüzeysel beyaz adipoz kaldırmak ve daha sonra interskapular kahverengi yağ kelebek teşrih. Yakından kahverengi yağ ile ilişkili kas önlemek için dikkatli olun.
NOT: Bir diseksiyon mikroskop kullanımı w kaldırılması için tavsiye edilirHite yağ, aynı zamanda, scapulalar kahverengi adipoz ayrılmasında. - Yağ depo çıkarın ve 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır.
- RNA ya da bir protein ekstrakte edilir edilecekse, -80 ° C'de, sıvı azotun ve mağaza içine daldırma ile doku dondurma. Bozulmasını önlemek için bir kerede örnek dondurun. Kültürleme Eğer, DMEF-12 doku kapak ve tüm örnekler kültür (ek bilgi) için tahsil edilene kadar buz üzerinde ayarlayın.
- Subkutan Yağ Dokusu (SQ) izolasyonu, Beyaz Yağ Dokusu Depo (WAT):
- Yağ depoları arasında değil çapraz kontaminasyona olarak eldiven taze çifti koyun.
- Inguinal, fare alt yarısını de-gloving'i üçgen SQ depoları Reveal. Bir yandan üst uzantıları ve toraks tutun ve diğer elinizle ayak aşağı doğru çekerek cildi.
- Saçlı maruz depo kontamine dikkatli olurken bir yatar pozisyonda fare yönlendirin.
- Temiz Surgicaeldiven taze çifti l aletleri ve değişim.
- Dikkatle SQ yağ üçgenleri incelemek. Yağ, meme bezleri komşu, kas ile örnek kontamine veya herhangi damarları keserek ve kanla kontamine örnek için dikkatli olun.
NOT: Sınırlar açıkça tanımlanmış değilse, bir diseksiyon mikroskop kullanılması tavsiye edilir. - Yağ depoları çıkarın ve 2 ml mikrosantrifüj tüpler transfer.
- RNA ya da bir protein ekstrakte edilir edilecekse, -80 ° C'de, sıvı azotun ve mağaza içine daldırma ile doku dondurma. Bozulmasını önlemek için bir kerede örnek dondurun.
- Boyama için, düzeltmek veya OCT embed. Kültürleme Eğer, DMEF-12 doku kapak ve tüm örnekler kültür (ek bilgi) için tahsil edilene kadar buz üzerinde ayarlayın.
- Gonadal Fat bir Visseral Yağ Dokusu (KDV) ve Beyaz Yağ Dokusu (WAT) Depo İzolasyonu:
- Yağ depoları arasında değil çapraz kontaminasyona olarak eldiven taze çifti koyun.
- Sci ilessors doğrudan diyafram altında, enine periton kesti. Koronal karın organları açığa rektum ortasına kadar diyaframdan periton kesin.
- Testisler veya yumurtalıkların bulun ve kadınlarda epididimal erkeklerde adipoz veya gonadal adipoz olarak bilinen ekli beyaz yağ dokusu, tespit.
- Eldiven taze çifti Temiz cerrahi aletler ve değişim
- Dikkatle testis, epididim ve vas deferensler epididimal yağ depolarını hem teşrih. Ya da kadın, eğer dikkatle yumurtalıkların hem gonadal yağ yastıkları incelemek.
- Yağ depoları çıkarın ve 2 ml mikrosantrifüj tüpler aktarabilirsiniz.
- RNA ya da bir protein ekstrakte edilir edilecekse, -80 ° C'de, sıvı azotun ve mağaza içine daldırma ile doku dondurma. Bozulmasını önlemek için bir kerede örnek dondurun.
- Boyama için, düzeltmek veya OCT embed. Kültürleme Eğer, DMEF-12 doku kapak ve tüm örnekler kültür (ek bilgi) için tahsil edilene kadar buz üzerinde ayarlayın.
Perivasküler Yağ Doku 3. izolasyonu (PVAT)
- Kalp İzolasyonu:
- Dışa genişletilmiş üst ve alt uzantıları ile bir yatar pozisyonda fare yatıyordu.
- Cerrahi bant kullanarak Güvenli uzantıları.
- Yukarıda listelenen fareyi yerleştirdikten sonra, forseps ile kılıç şeklinde süreci kaldırarak gerilim yaratmak. Göğüs boşluğunun alt kısmını açığa diyafram aracılığıyla yatay kesin.
- Kılıç şeklinde süreci kaldırarak, gerginlik korurken, sadece sternum tarafına, kafasına doğru superiorda göğüs kafesi kesti.
- Klavikula sadece alt göğüs kafesi Pick up ve her iki yönde aksillada doğru dışarı klavikula alt uzunluğu boyunca kesilmiş. göğüs boşluğu ve içeriği (kalp, akciğerler, vb) şimdi açıkça görülebilir olmalıdır.
- Steril ga kullanarak gereksiz kan ve sıvı göğüs boşluğu temizleyinUZE sıvıyı emmek için. Toplama organları veya gemiler (ek bilgi) bol emin olunuz.
- Alan sıvı temizlendikten sonra, kalbin daha iyi poz sağlayan, akciğerler kaldırmak için bronşlar ve takılarak gemilerin kesti.
- Yerelleştirme ve Eksizyon Aort ve Perivasküler Yağ Dokusu (PVAT):
- Karaciğer, mide, dalak, pankreas, bağırsak ve kolon: iyi aort alt bölümlerini tanımlamak için aşağıdaki organları çıkarın.
- İlk mide ve yemek borusu belirlenmesi ile başlar. Vücuttan mideyi boşaltmak için gastro-özofageal kavşakta yemek borusu kesin.
- Sonraki, bağırsakları ve çevredeki mezentere belirlemek. O aort böbrek kısmına çok yakından yatıyor ardından "bağırsak çalıştırın.", Mezenterden ile yüzeysel Cut
- Kolon mümkün olduğunca rektum kadar yakın özgür kesin. Böylece, fare mide, bağırsak ve kolon kurtararak.
- Tekrartutturma mezenteri ve damarları aracılığıyla keserek mide, bağırsak, kolon, pankreas ve dalak hareket ettirin. pankreas ve dalak mide, bağırsak ve kolon ücretsiz gelmelidir.
- Tüm lobları kaldırmak, mezentere hepatik venler ile kesme ve takarak karaciğer çıkarın.
- Visseral tabaka kesip ve yağ böbrekleri çevreliyor. Aortun farklı kesimleri için coğrafi işaretler olarak hizmet etmek in vivo aorta bağlı böbrekleri bırakın.
- Steril 1x PBS ile bölgeyi durulayın ve bir steril gazlı bez ile emilim bütün sıvıyı çıkarın.
- Mikro-makas ve mikro-forseps kullanarak, omurga dorsal eki ve yemek borusu onun ventral eki aort ayırın.
- Aşağıdaki ve iliak bölgede çatallanma kalbinde kökenli inen aorta aorta uzunluğunu ayırarak aort izole edin.
- Belirlemek ve subklavian damarları izole. Bu gemiler yalıtmakAort kök boyundan daha iyi kalp aort kavşak ve kök maruz.
- Sonra timus çıkarın kalbin hareketini sağlayan, brakiyosefalik arter, sol karotis arter ve sol subklavian arter kesti.
- Bir diseksiyon mikroskobu yardımıyla, aort çevreleyen perivasküler adipoz dokusu (PVAT) katmanı görüntüleyin.
- Sıkıştırmayın veya PVAT sıkmak, yavaşça mikro-forseps ile aortadan PVAT şekilde çekmeyin büyük özen. Yavaşça diyafram nerede sadece üstün torakal bölgede başlayan mikro-makas ile aorta PVAT eki kesti.
NOT: A diseksiyon mikroskop tavsiye edilir. - Aort geminin iliak çatallanma sadece üstün bulunan İnfrarenal aort bölgesinde, terbiye, bu sürecini aortun tüm uzunluğu tekrarlayın.
- Aortik ark PVAT isteniyorsa, daha az c PVAT kaldırmak için aynı yöntem kullanılırkemer urvature.
- 2 ml mikrosantrifüj tüpü (lar) içine PVAT numuneler.
- RNA ya da bir protein ekstrakte edilir edilecekse, -80 ° C'de, sıvı azotun ve mağaza içine daldırma ile doku dondurma. Bozulmasını önlemek için bir kerede örnek dondurun. Kültürleme Eğer, DMEF-12 doku kapak ve tüm örnekler kültür (ek bilgi) için tahsil edilene kadar buz üzerinde ayarlayın.
NOT: Kapsamlı bir yağ depo analizi ilgilenen varsa ek yağ depoları dikkate şunlardır: retroperitoneal, mezenterik, omentum, perikard ve popliteal.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kimlik ve kasık deri altı yağ, interskapular kahverengi adipoz, viseral adipoz epididim (Şekil 1), yanı sıra aort arkı perivasküler adipoz, torakal aort adipoz, böbreküstü aort adipoz ve infrarenal aort adipoz lokalizasyonu (Şekil 2) kullanılarak başarıyla gerçekleştirilmiştir açıklanan cerrahi yöntem. BAT ve WAT örnekler arasında histolojik muayene ve farklılaşma pozitif boyanan (Şekil 3) hematoksilen ve eozin (H & E) ile değerlendirildi. Hücre ölümü meydana getire...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Obezite morbidite büyük bir ev sahibi ve adipoz tam olarak anlaşılmış değildir oynadığı rolün tam bir anlayış yol açabilir; adipoz alanında nedenle devam araştırma gereklidir. Hayvan modelleri, özellikle fare modelleri hastalıklar ve potansiyel ilaç tedavilerinin test ilerlemesinde ilk araştırma için idealdir. Bu modelleri kullanarak, kesin izolasyon ve yağ depolarında eksizyonu yağ etkilenen hastalıkların patolojisi çalışmada son derece önemli ve gerekli bir araçtır.
Adipoz depolarına ilişk...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarların teşekkür hakkı yok.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Isoflurane | Med-Vet International | #RXISO-250 | |
| %70 Etanol | Fisher | 07-678-001 | |
| DMEF-12 | Sigma Aldrich | D-6421 | Doku koymadan önce su banyosunda ısıtın. |
| 2 ml Mikrosantrifüj tüpleri | Midsci | MCT-200-CS | |
| Fosfat tamponlu salin | Sigma Aldrich | P5368-10PAK |
Kaynaklar
- Ogden, C. L., Carroll, M. D., Kit, B. K., Flegal, K. M. Prevalence of obesity in the United States, 2009-2010. NCHS Data Brief. 82, 1-8 (2012).
- Flegal, K. M., Carroll, M. D., Kit, B. K., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and trends in the distribution of body mass index among US adults, 1999-2010. 307 (5), 491-497 (2012).
- Cawley, J., Meyerhoefer, C. The medical care costs of obesity: an instrumental variables approach. Journal of Health Economics. 31 (1), 219-230 (2012).
- Obesity accounts for 21 percent of U.S. health care costs, study finds. , Cornell University. Available from: http://www.sciencedaily.com/releases/2012/04/120409103247.htm (2012).
- Marder, W., Chang, S. Childhood Obesity: Costs, Treatment Patterns, Disparities in Care, and Prevalent Medical Conditions. Thomson Medstat Research Brief. , (2006).
- Cortez, M., Carmo, L. S., Rogero, M. M., Borelli, P., Fock, R. A. A high-fat diet increases IL-1, IL-6, and TNF-α production by increasing NF-κB and attenuating PPAR-γ expression in bone marrow mesenchymal stem cells. Inflammation. 36 (2), 379-386 (2013).
- Sanchez-Gurmaches, J., Hung, C. M., Sparks, C. A., Tang, Y., Li, H., Guertin, D. A. PTEN loss in the Myf5 lineage redistributes body fat and reveals subsets of white adipocytes that arise from Myf5 precursors. Cell Metab. 16 (3), 348-362 (2012).
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. J Lipid Res. 48 (6), 1253-1262 (2007).
- Aarsland, A., Chinkes, D., Wolfe, R. R. Hepatic and whole-body fat synthesis in humans during carbohydrate overfeeding. Am J Clin Nutr. 65 (6), 1774-1782 (1997).
- Park, A., Kim, W. K., Bae, K. H. Distinction of white, beige and brown adipocytes derived from mesenchymal stem cells. World J. Stem Cells. 6 (1), 33-42 (2014).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and. 150 (2), 366-376 (2012).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154 (9), 2992-3000 (2013).
- Casteilla, L., Pénicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity. Methods Mol. Biol. 456, 23-38 (2008).
- Grant, R., Youm, Y. H., Ravussin, A., Dixit, V. D. Quantification of adipose tissue leukocytosis in obesity. Methods Mol. Biol. 1040, 195-209 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
