Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hydra Glutatyon kaynaklı Besleme Tepki Ölçüm

10.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52178

⸱

16 Kasım 2014

 , 
1Centre of Excellence in Epigenetics, India Institute of Science Education and Research, Pune

Bu makalede

Özet

Burada, indirgenmiş glutatyon formunun neden olduğu hidradaki beslenme tepkisinin nicelleştirilmesi için basit bir tahlili açıklıyoruz. Bu tahlil, dokunacın apikal ucu ile hidranın ağzı arasındaki mesafenin ölçülmesine dayanır.

Özet

Hydra, avı yakalamak için indirgenmiş glutatyonu (GSH) tespit etmek için sinir sistemine ve kemosensasyona sahip en ilkel organizmalar arasındadır. Av organizmalarının hareketi, avın içine yerleştirilen hidradan nematokistler adı verilen acı veren hücrelerin mekanosensoriyel boşalmasına neden olur. Avı ağza doğru getirmek için dokunaçların kıvrılmasını, ağzın açılmasını ve bunun sonucunda avın yutulmasını içeren hidradaki beslenme tepkisi, yaralı avdan salınan sıvıda bulunan GSH tarafından tetiklenir. Bugüne kadar bilinmeyen hidradaki beslenme yanıtının moleküler mekanizmasını tanımlayabilmek için, besleme yanıtını ölçmek için bir test oluşturmak gerekir. Burada, dokunaçların apikal ucu ile hidra ağzı arasındaki mesafenin ölçüldüğü ve GSH ilavesinden önce ve sonra bu mesafenin oranının belirlendiği besleme yanıtının niceliklendirilmesi için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Göreceli dokunaç yayılımı olarak adlandırılan oranın, beslenme tepkisinin bir ölçüsünü verdiği bulundu. Bu test, açlıktan ölen hidranın günlük beslenen hidraya kıyasla gelişmiş bir beslenme tepkisi gösterdiği bir açlık modeli kullanılarak doğrulandı.

Giriş

Hydra, avı yakalamak için indirgenmiş glutatyonu (GSH) tespit etmek için sinir sistemine ve kemosensasyona sahip en ilkel organizmadır1. Nematod, kabuklular, böcek larvaları, kurbağa yavruları ve yumurtadan yeni çıkmış balıklar gibi çeşitli hayvanlarla beslenir1. Bu av organizmalarının hareketi, avın2. içine yerleştirilen hidradan nematokist adı verilen acı kapsüllerinin mekanosensoriyel boşalmasına neden olur. Yaralı avdan salınan sıvıda bulunan GSH, daha sonra avı ağza doğru getirmek için dokunaçların kıvrılmasını, ağzın açılmasını ve bunun sonucunda avın yutulmasını içeren hidradaki beslenme tepkisini aktive eder. Dopamin3, glutamat4, GABA, glisin5, NMDA reseptörleri6 ve allatotropin7 gibi çoklu moleküllerin hidradaki beslenme tepkisinde rol oynadığı gösterilmiştir. Ayrıca, GSH tarafından indüklenen kemosensoriyel yanıtın, hayvanın beslenme durumu tarafından modüle edildiği, açlıktan ölen hidranın gelişmiş beslenme tepkisi1 sergilediği gösterilmiştir. GSH duyarlılığındaki böyle bir artış biyolojik olarak önemlidir, çünkü açlık altında hidranın avını daha yüksek hassasiyette bulması gerekir.

GSH tarafından indüklenen beslenme yanıtı mikroskop altında net bir şekilde gözlemlenebilse de, besleme yanıtı gözlemlerini ölçmek için tipik olarak kullanılan yöntemler nicel değildir. Vakaların çoğunda, hidranın ağzının açık kaldığı süre, beslenme tepkisinin bir ölçüsü olarak alınmıştır8,9; başka bir durumda ise nicelik, beslenme tepkisini10 gösteren bir popülasyondan çıkan hidra sayısına dayanıyordu. Bununla birlikte, hidra poliplerinin ağız açılma süresini gözlemlemek zahmetlidir ve gözlemler sırasında ağız oryantasyonunun yönü gibi kontrol edilemeyen parametrelerin neden olduğu değişikliklere tabidir. Benzer şekilde, beslenme yanıtı nicel bir parametre olduğundan, popülasyon temelli yaklaşımlar, bireysel gözlemcinin görüşü veya gözlemsel yanlılığından kaynaklanan varyasyonlara/hatalara tabidir. Bu sorunları aşmak için, dokunacın apikal ucunun hidra polipinin ağzından olan mesafesine dayalı olarak hidradaki (Hydra vulgaris Ind-Pune11) beslenme tepkisinin nispi nicelleştirilmesi için bir yöntem geliştirdik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Besleme Tepki 1. Hydra Kültür ve Ölçüm

  1. Bir yer alan (1 mM Tris-HCI tamponu, pH 7.6, 1 mM NaCI, 1 mM CaCI2, 0.1 mM KCI ve 0.1 mM MgSO 4) Artemia ile bunların günlük olarak beslemek ve bir ortam içinde tutarak kültürde hidra polipler korumak 12 saat ışık-12 saat karanlık döngüsü altında 18 ° C'de cam kase daha önce 12 açıklandığı gibi.
  2. Beslenme yanıtının ölçülmesi için bir 24 oyuklu plaka tek bir kuyusuna 5-6 dokunaçlarını sahip hidra polip olgun aktarın. Eğerek kuyudan kalan ortamı çıkarın, sonra hemen taze orta 500 ul ekleyin.
  3. Hidra ortamda 9 iM glutatyon çözeltisi hazırlayın. Glutatyon çözüm oksidasyona eğilimli olduğundan, her zaman, her deney için taze hazırlanmış glutatyon çözümü kullanın.
  4. Görüntü kaydı için hükme sahip bir mikroskop görüntüleme platformu için plaka aktarın. Davranış o böyle karanlık bir arka plan kullanınf hydra polip açıkça zıt arka plan karşı görüntülü olabilir.
  5. Oda gözlem ve dalgalanan şiddetleri, hava akımları ve gürültü ışıklar hydra serbest davranışını görüntülenmesinde kullanılan. Hatta glutatyon yokluğunda - Bu tür bozukluklar arasında ayrıca hidra polip dokunaçlarıyla daralma gösterir neden olabilir.
  6. Polip 5 dakika dinlenmek için izin verin.
  7. Polip davranışı açıkça görüntülü olabilir ki iyi böyle bir merkez bölgesi boyunca yer olduğundan emin olun. Polip kuyunun kenarında ise, bir pipet kullanarak orta kızarma tarafından merkeze getirmek ve tekrar dinlenmek için izin verir.
  8. Rahat bir durumda hidra'nin bir görüntü yakalayın. Bu sıfır zaman noktasında gözlem olacaktır.
  9. Hızlı bir şekilde de 3 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere 9 uM glutation çözeltisi ekleyin. Hidra'yla gösterilen deney ve yanıtın amacına bağlı olarak, glütatyon ve Choo farklı konsantrasyonları bir dizi testiGerekli uygun konsantrasyona se.
  10. Hemen 4-5 dakika boyunca her 15-30 saniye sonra glutatyon çözüm ve yakalama görüntüleri ekledikten sonra Sayacı başlatmak. Time-lapse görüntüleme sırasında büyütme ayarlarını değiştirmeyin.
  11. Yumuşak ve kuyudaki hayvanın konumu minimal mikroskop görüş alanında rahatsız ki, bu tür homojen akımı ile glutation solüsyonu ekleyin. Polip glutatyon çözüm ekledikten sonra yoğun hareket Ancak, görüntü yakalama için görüş alanındaki polip getirmek için çok yavaşça plakasını taşıyın.
  12. Kontrol deneyinde, benzer diğer tüm parametreleri tutarken orta glutatyon eksik kullanımı.
  13. 13:00 önce beslenme yanıtının ölçüde sirkadiyen ritmin olası etkisini önlemek için - günün ilk yarısında yukarıdaki deney tüm adımları gerçekleştirmek için emin olun.
  14. GNU Image Manipulation Program (GIMP) kullanılarak çekilen görüntülerin her açın.
    15. Tentacles ve hypostome her apikal ucu arasındaki mesafeyi belirlemek için ölçün> Menü> Araçlar edinilebilir "Tedbir" aracını kullanın. Ağız açıklığı herhangi bir görüntü gözlenmesi durumunda, açılan ağız merkezi ve tentacle apikal ucu arasındaki mesafeyi belirler. Tentacle yayılması gibi bu mesafeye bakın.
  15. Öncesi ve glutatyon maruz kaldıktan sonra her polip için ortalama tentacle yayılmasını hesaplayın. Sonraki zaman noktalarında her birinde edilene sıfır zaman noktasında ortalama dokunaçlı yayılma oranı hesaplanır. Bu oran göreceli dokunaçlı yayılması çağrılır.
  16. En az 20 polip ölçümleri tekrarlayın.

figure-protocol-1
figure-protocol-2

2. Yöntem Doğrulama kullanarakAçlık Modeli

  1. Açlık için ayrı bir cam kase için birkaç hydra polip aktarmak ve 5 gün boyunca onları beslemek yok. Benzer bir büyüklükte bir kapta artemia ile günde birkaç polip kontrol doyur. Hem deneysel ortamda mantar üremesini önlemek için günlük kase gelen orta değiştirin.
  2. Deney gününde, 1 saat süre ile Artemia ile Hydra kontrol grubu besleme ve ortam tüm meyvelerin ve ölü Artemia çıkarılmasından sonra, daha sonraki deneyler için, bu Hidra kullanır.
  3. Nedeniyle gözlem süresi için bir eğilim önlemek için önceki adım 1 'de tarif edilen yöntemle kontrol grubundan hidra ile karşılaştırıldığında aç Hydra besleme yanıtını ölçen aç her ölçümleri alternatif ve Hydra polipler kontrol eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Glutatyon Hidra av içine çeken amacıyla ağzına doğru dokunaçlarıyla buruşmasına sergilemeye neden olur. Dokunaçlarıyla böyle kıvırma yakın hypostome için dokunaçlarıyla apikal uçlarını getiriyor. Bu Hücrelerin yayılması azalma veya Hücrelerin ve hypostome (Şekil 1), apikal ucu arasındaki doğrusal mesafe ile sonuçlanmaktadır. Göreceli tentacle yayılması, ya da ortalama ahtapotun kollarından oranı önce yayılmış ve glutatyon ekledikten sonra, zamanla azaltan çoklu polipler arasında ortalama. Nispi Hücreler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Hydra davranışı Beslenme Metazoan'da en atalarının duyusal sistemlerinden birini temsil eder. Nematosist destekli av yakalama sonra yayımlanan kabuklu sıvısında GSH varlığı uzun zaman önce 1 tespit edildi, ancak GSHR protein ne de olası kodlayan gen / ler ne hidra bugüne kadar karakterize edilmiştir. Birkaç deneme GSH hidra 8, 14, 15, bağlama proteinleri karakterize etmek için yapılmıştır. Ancak, bu farazi reseptör proteinlerin kimlik besleme reaksiyona katkıda bulunması olasıdır karanlık ve ço...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, video prodüksiyonundaki yardımları için K. P. Madhu'ya, Nita Beliappa'ya ve Hindistan Bilim Eğitim ve Araştırma Enstitüsü Medya Merkezi personeline, Pune'a müteşekkirdir. Çalışma, Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü Mükemmeliyet Merkezi programı kapsamında SG'ye fon sağlanarak ve Hindistan Hükümeti Bilim ve Teknoloji Bölümü tarafından RK'ya doktora sonrası burs ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Soğutmalı İnkübatörPanasonic MIR-254-PE
MikroskopLeicaS8AP0 
Mikroskop Leica için kamera EC3
Azaltılmış glutatyonSigmaG42514 ° C'de saklanır. Oksidasyonu önlemek için açmadan önce şişeyi oda sıcaklığına getirin
Görüntü düzenleme programıGIMPSürüm 2.8

Kaynaklar

  1. Loomis, W. F. Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra. Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).
  2. Beckmann, A., Ozbek, S. The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle. Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).
  3. Venturini, G., Carolei, A. Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations. Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).
  4. Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris. Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).
  5. Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa). Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).
  6. Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study. Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).
  7. Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding. PLoS ONE. 8, (2013).
  8. Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins. FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).
  9. Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. Glutathione in the Nervous System. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).
  10. Venturini, G. The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies. Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).
  11. Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. Description and phylogenetic characterization of common hydra from India. Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).
  12. Horibata, Y., et al. Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase. J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).
  13. Koizumi, O., Maeda, N. Rise of feeding threshold in satiated Hydra. J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).
  14. Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra. Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).
  15. Morita, H., Hanai, K. Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra. Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).
  16. Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system. Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).
  17. Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra. J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).
  18. Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione. J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).
  19. Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands. Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).
  20. Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. Computer automated movement detection for the analysis of behavior. J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hydra Beslenme TepkisiGlutatiyon AnaliziTentak l A l m l mNematokist Bo almasKemosens r Alg lamaA l k ModeliG reli Tentak l A l mGlutatiyon zeltisiMikroskobik G r nt lemeBeslenme Davran Kantifikasyonu
Hydra Glutatyon kaynaklı Besleme Tepki Ölçüm
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.