Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating

Summary

Biyolojik ligandların mikro ölçekli modelleriyle işlevselleştirilmiş hücre kültürü substratları, doku mühendisliği alanında çok büyük bir faydaya sahiptir. Burada, biyolojik ligandların mekansal olarak hassas ve bölgeye özgü immobilizasyonunu sağlayan ortogonal kimyalar sunan çoklu, mikro desenli poli (etilen glikol) fırçalarla doku kültürü substratlarının çok yönlü ve otomatik üretimini gösteriyoruz.

Abstract

Doku mühendisliğinde, kültürde doku morfolojisinin ve hücre kaderinin mekansal kontrolünün mikron ölçeğinde sergilenmesi arzu edilir. Aşılı poli (etilen glikol) (PEG) fırçaları sunan kültür substratları, mikro ölçekli, kirlenmeyen ve hücre yapışmasına dirençli bölgelerin yanı sıra hücrelerin kovalent olarak bağlı ligandlarla biyospesifik etkileşimlere katıldığı bölgeler oluşturarak bu görevi başarmak için kullanılabilir. Bu tür substratları kullanarak karmaşık dokuları tasarlamak için, diferansiyel biyoaktiviteler sağlamak için işlevselleştirilmiş ve in vivo nişleri taklit eden mikro ölçekli oryantasyonlarda hizalanmış çoklu PEG fırçalarını sırayla modellemek gerekecektir. Mikrokontakt baskı (μCP), bu tür aşılı PEG fırçalarını modellemek için çok yönlü bir tekniktir, ancak manuel μCP, mikro ölçekli hassasiyetle gerçekleştirilemez. Bu nedenle, ortogonal 'tıklama' kimyaları sunan karmaşık, mikro ölçekli ve son derece düzenli PEG fırça desenlerine sahip kültür substratlarını üretmek için robotik mikro temas baskı (R-μCP) destekli bir yöntem geliştirmek için gelişmiş robotları yumuşak litografi teknikleri ve yeni ortaya çıkan yüzey kimyası reaksiyonlarıyla birleştirdik. Burada, bu tür alt tabakaları üretmek için iş akışını ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Introduction

Aynı anda doğal olmayan kirlenme özellikleri korurken kovalent bağlı biyokimyasal ligandlar görüntülemek için PEG-aşılı yüzeylerin yeteneği, onları kültürü yüzeylerin ^1,2,3 mühendislik özel mikro ortamlar için ideal bir seçimdir. Ligand konjüge PEG fırça tarafından aracılık biyospesifik etkileşimlerin tek hücre fenotipleri in vivo doku mikroçevrelerde kompleksi içinde bulunan biyokimyasal işaretlerin etkilerinin indirgeyici analizi sağlar. Ayrıca, biyo-dik bir "klik" kimyaları da yerel konformasyonun ^4-6'da sunulmuştur, böylece ligand yönsel hareketsiz kılınmasını temin etmek için kullanılabilir. Böylece, PEG mikro mekansal desenlendirme fırçalar hareketsiz biyokimyasal ipuçları ^6,7 ile uyarılan hücre sinyallerini araştırmak için in vitro nişler tasarımcısı oluşturmak için çok yönlü bir araçtır.

Biyokimyasal cu mekansal kalıplarını üretmek için ortak bir yöntemes PEG konjuge alkanetiollerin desenleri ile microcontact baskı (μCP) altın kaplı yüzeylerde gerektirir. Daha sonra, PEG-açillenmiş alkanetiollerin micropatterned kendinden düzenlenen tek tabakaları (SAMs), sadece alt-tabaka ^8,9 olmayan desenli bölgelere, biyokimyasal moleküllerin, örneğin, protein fiziksel adsorpsiyon kısıtlar. Bununla birlikte, bu teknikle üretilen SAMs uzun vadeli hücre kültür ortamında oksidasyona duyarlı olan. Böylece, SAMs alkantiyol μCP'd genellikle daha fazla bölgenin olmayan kirlenme istikrarı ¹⁰ arttırmak için yüzey başlatılan atom transfer radikal polimerizasyonu (SI-ATRP) kullanılarak PEG polimer fırçalar ile aşılanmış. Özellikle, μCP alkantiyol polimerizasyon başlatıcı, poli SI-ATRP (etilen glikol) metil eter metakrilat (PEGMEMA) monomerlerin ve ardından altın kaplı yüzeylerde ω-meraptoundecyl bromoizobutirat micropatterned uzun süreli, istikrarlı, ve non yüzeyleri oluşturur kirlenme PEG fırçalar. Ayrıca, bu bundan başka çeşitli kimyasal kısımların ¹¹ sağlamak için modifiye edilmiş olma yeteneğine sahiptir.

Bu özellik, Sha et yararlanarak. ark. dik "tık" kimyaları sunulması çok bileşenli PEGMEMA fırçalar ile kültür substratları mühendisi için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemde, bunlar sıralı sodyum azid, etanolamin serpiştirilmiş μCP / SI ATRP bir dizi aşama kullanmak, ve birden fazla hareketsizleştirilmiş ligand ⁶ mikro desen gösteren kültür tabakaları oluşturmak için nükleofilik sübstitüsyonu propargilamin. Yeni kültür sübstratları mühendislikten geçirilmesi için indirin μCP ile bağlantılı olarak, kimyasallar kullanıldığında potansiyel büyük olsa da, çok sayıda μCP aşamalar, tek bir alt-tabaka üzerinde düzenlenebilir hangi kesinlik ve doğruluğu sınırlıdır. Hassasiyet ve doğruluk yüksek düzeyde tekrarlanabilir bu çok yönlü teknikler kullanılarak in vitro nişler kompleksi üretimi için gerekli olacaktır.

e_content "> Bu sınırlama çözmek için, bazı otomatik ve yarı-otomatik μCP sistemleri al.. Çakra ve diğ. üretilen özel pulları bir ray sistemi üzerindeki izlenerek ve altın-kaplı slaytlar konformal temas ettirildiği bir μCP sistemi geliştirilmiştir Bir bilgisayar kontrollü pnömatik aktüatör. Bununla birlikte, bu yöntem, özel damga tasarımlar hassas imalat gerektirir ve çok μCP ¹² adım yaparken elde doğruluğunda bir rapor ile birlikte 10 mikron hassas bildirir. Daha yeni olarak, entegre bir kinematik bağlantı sistemini kullanan bir metodu rapor, tek bir desen kullanarak 1 um altında hassas, ama nedeniyle ¹³ kalıp kalıp damga özelliklerin hassas kontrol eksikliği doğru birden çok desen hizaya koyamadık. Ayrıca, önceki yöntemlerin her ikisi de desenlendirme adımları arasında sabit kalmasını tabakayı gerektirir , böylece önemli ölçüde olabilir yüzey modifikasyonu kimyaları çeşitliliğini sınırlayıcıkullandı. Damga tasarım ve üretim maksimal esneklik verirken Burada, birden çok μCP adımların doğru ve kesin bir uyum otomatik R-μCP sistem yetenekli açıklar. Ayrıca, desenli yüzeyler defalarca böylece sıralı nükleofilik değiştirmelerin dahil olmak üzere çeşitli substrat modifikasyonu kimyaları, kullanımına izin veren, stampings arasındaki sistemden kaldırılabilir. Bu tür kimyasallar kullanıldığında mühendislik Yüzeyleri hem de bize ^6,14 ve diğerleri ⁷ tarafından önceden hücre kültürü için kullanılmıştır. Böylece, karmaşık ve micropatterned biyokimyasal ipuçları ile kültürü yüzeylerin ölçeklenebilir üretimi için bir yöntem geliştirmek için Ar-μCP ve sıralı nükleofilik sübstitüsyon reaksiyonları birleşti.

Protocol

1. Yaratma Elastomerik Pullar

1. PDMS damgası en silikon ustaları oluşturmak için, bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak PhotoMask metraj desenleri.
   1. 300 mikron iç çapı (ID) ve 1,200 mikron merkez-merkez aralığı ile 600 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ilk desen tasarlayın.
   2. 600 mikron kimliği ve 1200 mikron merkez-merkez aralığı ile 900 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ikinci desen tasarlayın.
   3. Ayrıca, 45 ° açıyla 1,200 mikron merkez-merkez köşe desen aralıklı her dizi tasarım dört köşe 1 x 1 mm ² kare referans işaretlerini yerleştirin.
   4. Mikroakışkan dökümhane ile başka bir ^{yerde, 15} veya işbirliği detaylı olarak, standart litografi teknikleri kullanarak bir 300 um özelliği derinliğe ilişkilendirerek, 1 boy oranları: 1 Bu deneyde kullanılmak üzere silikon ustaları imal.
      Not: Özellik daha düşük 100 um alt-tabaka yüzeyi ile temas etmeden önce pul anormal deformasyonuna neden olan vuruş derinlikleri.
      NOT: Bu protokol, özel ekipman ve yaratmak için temiz odalar gerektiren Fotorezist tarif desenleri, zaten elde silikon ustaları sahip başlar. Bu desenli ustaları oluşturmak için bir fabrikatör veya çekirdek tesisi ile danışmak en iyisidir.
2. Silanize silikon ustaları (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) triklorosilan buharı ile inkübasyon O / N.
   NOT: Silan buharı son derece toksik ve sadece kimyasal davlumbaz ele alınmalıdır.
3. PDMS nin önceden polimer ve 60 ° C'de bir petri kabı O / N olarak silanize edilmiş silikon ustaların üstüne sertleştirme maddesi PDMS: 1 oranında, bir 10 sertleştirme ile silikon ustaların ters kopyaları oluşturun.
4. Silikon ustalardan PDMS pulları kaldırmak ve akrilonitril bütadien stiren damgalar (ABS) arkaları veya diğer herhangi bir sert malzeme bağtutkal kullanarak s.
   Not: seçim malzemenin şeffaf veya biyolojik olarak uyumlu olmak zorunda değildir. Bununla birlikte, PDMS daha robotik kalıp ve yüksek sağlamlığa sahip olan bir arayüz için düz bir yüzeyin sağlanması gerekir.

2. hazırlanması Coverslides

1. Durulama mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) hafif bir azot akımı altında, etanol ile durulanır ve kurutulur edilmeden önce 1 dakika süre ile, aseton içinde, toluen, metanol ve sonikasyon.
   NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz toluen ve aseton tutun.
2. Odaklanmış bir elektron ışını buharlaştırıcı kullanılarak 18.0 nm altın (Au), ardından ~ 3.5 mil titanyum (Ti) ile kaplayın coverslides.
   NOT: Bu prosedür silikon ve polistiren altın dahil kaplı yüzeylerde çeşitli uyumludur. Bu yerinde oluşturmak mümkün olsa da, altın kaplanmış alt tabakalar aynı zamanda ticari tedarikçilerden yoluyla ulaşılabilir.
   NOT: yüzeylerde Au tabakalar olması gerekirken, Ti tabakalar, en az 3 mil kalınlığında olmalıdırı en az 5 nm kalınlığında ve son alt-tabakanın ^16,17 doğru optik özelliklerine bağlı olarak kalınlığı 1 mm tüm yol arasında olabilir. Yüzeyleri imalatı için optik açık olması gerekli değildir; Bununla birlikte, imal edilen alt-tabakaların mikroskopik analizi kolaylaştırır.
3. Kullanımdan hemen önce yumuşak azot altında etanol ve kuru ile altın kaplı coverslides durulayın.

3. R-μCP dış çevresinin

1. Seçici uyumlu mafsallı robot kolu (SCARA) sistemi ile R-μCP önce, sistemin yazılımını kullanarak robotik araç efektörler ve beraberindeki çift kamera sistemleri kalibre.
   NOT: Bu aletler Şekil 1'de resmedilmiştir.

Şekil 1. R μCP Sistemi ve Robotik Kol İşleme. (A) tüm takım ve demirbaşlar ile R-μCP sisteminin Büyük ölçekli görünümü, (a) vakumla mandren, (b) reaktif banyo, (c) aşağı bakan kamera, (d) damga yuvalama fikstür, (e) robotik aracı. (B) Robotik kol takım resmeden (f) elmas uçlu dağlama aracı ve (g) pnömatik emme aracı (h) ABS destekli PDMS damga tutarak.

2. Elle 600 mikron ID ve 900 mikron OD halkasal bölge damga yuvalama fikstür aşağı yüz çıkıntılı bir PDMS damga yerleştirin. Elle Şekil 1A görüntülenen vakum aynası, üstüne taze temizlenmiş altın kaplamalı coverslide yerleştirin ve bağlı laboratuar vakum kullanarak hareketsiz.
3. Robot denetimleri kullanarak, Şekil 2A gibi, altın kaplı coverslide merkez noktasının üzerinde aşağı bakan kamera hizalayın.
   NOT: Bu nokta başlangıçta görsel muayene ile tanımlanabilir ve büyük hassasiyet gerektirmez, PDMS damga çok larg olduğu gibialtın kaplı slayt daha er.
4. Dört başvuru etch robot kolu talimat "X" boyutları ile bir kare köşelerinde işaretleri robot koluna bağlı elmas uçlu aşındırma aracını kullanarak altın kaplı coverslide merkezli 3.8 mm 3.8 mm. (Şekil 2B'de tasvir; OTOMATİK SÜRECİ)
   NOT: Bu dört referans işaretleri aşağı bakan kamera bir görsel çerçevesinde olmasını sağlar.
5. Robotların pnömatik emme takım kullanarak, pick-up ve PDMS Şekil 2C olarak damga yuvalama fikstür üzerinde 1 mm damga basılı tutun. (OTOMATİK SÜRECİ)
6. Damganın kare referans işaretleri görselleştirmek ve damgası ortalama X, Y belirlemek için kamera yazılımı ile 10 kez onları tanımlamak, ve açısal merkezinden ofset, Şekil 2D ve E resimde yukarı bakan kamera ve LED aydınlatma halkası kullanılması robot takım ekseni. (OTOMATİK SÜRECİ)
7. Olduğu gibi NOT: Bir iç hesaplama tam hizalamak için robotik sistemin yazılımı tarafından gerçekleştirilir damga ve geleceğin R-μCP adımlarla Coverslip X, Y, merkezi yerleri ve açısal uzaklıklar.
8. Şekil 2F'de de gösterildiği gibi 3.8)) alkantiyol bir ATRP inisiyatör, ω-mercaptoundecyl bromoizobutirat (etanol içinde 2 mM bir banyoda damga yerleştirin. (OTOMATİK SÜRECİ)
9. Alkantiyol çözeltiden damga çıkarın ve Şekil 2G olarak etanolün buharlaştırılması 0.48 bar (5 psi) basınçlandı azot akımı üzerine yerleştirin. 1 dakika sonra, azot akışı basınç üniform bir kuruluğa gelene sağlamak için 1.03 bar (15 psi) kadar arttırmaktadır. (OTOMATİK SÜRECİ)
   NOT: Eksik kurutma desen sadakat tamamen veya kısmen kaybına neden olur.
10. Kurutma işleminden sonra, altın kaplamalı slayt hesaplanan merkez pozisyonu üzerindeki pul taşımak ve Şekil 2H'de gösterildiği gibi Z eksenine motor gücünü izlerken 100 um artışlarla indirin.
    NOT: Bu Z-ekseni motoru yaşadığı ve robot rehberlik yazılımında görüntülenen tork iletilir. (OTOMATİK SÜRECİ)
11. 79.2 kPa önceden belirlenmiş bir basınç elde edildikten sonra damga düşürücü durdurmak, ve 15 saniye için altın kaplı sürgü ile temas sağlamak. (OTOMATİK SÜRECİ)
    NOT: basınç değerleri burada mevcut damga tasarım ve özellik yüksekliği için optimize edilmiştir. Damga tasarım deneme ve yanılma süreci bu doğrultuda özellikle boy oranı yüksek pul, ayarlamak için, değiştirilir.
12. Yavaşça altın kaplamalı slayt damga kaldırmak ve geri damga yuvalama fikstür damgası yer. (OTOMATİK SÜRECİ)

Micropatterned Coverslides ilgili PEGMEMA 4. SI-ATRP

1. Vakum basıncı micropatterned coverslide tutarak serbest bırakın ve bir 50 ml'lik bir Schlenk şişesine aktarın. Mühür ve degas savurma bir vakum pompası kullanılarak şişeyi.
2. Ekleme makromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), su (34.4 mi), metanol (43.8 mi), bakır (II) bromür (1 mmol) ve 2 ', 2-bipiridin (3 mmol) ihtiva eden ATRP Reaksiyon karışımı 5.5 mi Schlenk şişesi.
3. Reaksiyonu başlatmak için su içinde L-sodyum askorbat (454,3 mM) 0.5 ml ilave edilir, ve atıl gaz altında, oda sıcaklığında 16 saat süre ile devam etmesini sağlar.
   NOT: Şekil 3A-B'de gösterildiği gibi, L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra, tepkime rengi koyu kahverengiye doğru açık yeşil yönelecektir.
   NOT: Reaksiyon 16 saat ötesine devam edebilirsiniz, ancak önemli ölçüde PEG fırçaların uzunluğunu artırmak olmayacaktır.

SI-ATRP Şekil 3. başlatılması. (A) reaksiyonu ve L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra (B), müteakip bir renk değişikliğiyle başlatılması. SI ATRP prosedür takip edilerek micropatterned coverslide yüzeyinin (C) mikroskop görüntüsü. Ölçek çubuğu 1 mm.

4. Schenk şişeden micropatterned coverslide çıkarın ve hafif bir azot akımı altında, etanol, su, ve etanol ve kuru ile durulayın.
   Not: SI-ATRP sonra, yüzey değişiklikleri gözle görünür olmalıdır ve Şekil 3C'de olduğu gibi, bir mikroskop altında görüntülenmiş ve analiz edilebilir.
   Not: Bu, bu alt-tabakaların immunostain ihtiyacını ortadan kaldıran şekilde deneme hassas test etmek için basit bir yöntemdir.

Micropatterned PEGMEMA Chains 5. Azit Functionalization

1. 20 ml'lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin.
2. N, 6 ml ilave edilir, reaksiyon şişesine, 100 mM sodyum azit ihtiva eden N-dimetilformamid (DMF). 24 saat boyunca 37 ° C 'de bu reaksiyon koruyun.
   NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMF taşıyınız. Sodyum azid tartıp dikkatli olun.
3. Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın.

Brom Fonksiyonlu PEGMEMA Chains 6. Pasivasyon

1. 20 ml'lik bir cam reaksiyon şişelerine Micropatterned coverslide yerleştirin.
2. 100 mM etanolamin ve reaksiyon şişesine, 300 mM trietilamin ihtiva eden, dimetil sülfoksit (DMSO) ve 6 ml ilave edilir. 24 saat süre ile, 40 ° C'de, bu reaksiyonu tutun.
   NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO, etanolamin ve trietilamini tutun.
3. Tamamlandığında micropatterned coversl kaldırmakReaksiyon şişesinden ide, bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın.

İç anulus 7. R-μCP ve PEGMEMA SI-ATRP'si

1. Küçük özellikleri ile halkasal bölge önceden micropatterned anülleri içine yerleştirilir şekilde 300 mikron ID ve 600 mikron OD çıkıntılı anülleri, bir PDMS damga ikame, 3.12 - Daha önce Adımlar 3.2 ve 3.6 de açıklandığı gibi R-μCP adımları uygulayın.
   NOT: Bu damga basıncı eşik 132,0 kPa. Daha önce de belirtildiği gibi, bu basınç ayarlarının en düşük mühür özellikleri bu deneyde kullanılmak üzere optimize edilmiştir.
2. 4.4 - aşamalarında daha önce 4.1 de açıklandığı gibi SI-ATRP'si adımları uygulayın.

Micropatterned PEGMEMA Chains 8. Asetilen Functionalization

1. 20 ml'lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin.
2. DMSO mM 100 ihtiva eden 6 ml ekleyinReaksiyon şişesine propargilamin. 24 saat boyunca oda sıcaklığında bu reaksiyona koruyun.
   NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO ve propargilamin tutun.
3. Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın.

9. Bakır-katalize "Click" Asetilen biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı

1. 20 ml'lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin.
2. Bakır sülfat (15 mM) / tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA, 30 mM) içinde 6 ml (ekleme 1: 1 h / h su Reaksiyon şişesine 562 uM azit-PEG ₄ -Biotin konjugat ihtiva / DMF). Reaksiyonu başlatmak için bu karışıma su içinde L-askorbik asit (0.15 mM) ve 1.2 ml ilave edilir.
3. 10 sn için, reaksiyon çözeltisi içinden kabarcık olarak, azot, Parafilm ile şişenin kapatılması, ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca reaksiyona girer.
4. Completio üzerineN, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide kaldırmak, su ile yıkayın ve bir 12-yuvalı polistiren tabağa koyun.

Biyotinilat Asetilen Grupların 10. Immunofluorescent Algılama

1. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca DPBS (% 3 eşek serumu) micropatterned coverslide bloke eder. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca HAA içinde Streptavidin-546 konjugatı (2 ug / ml) (PBS içerisinde% 3 eşek serumu) ile biyotinile asetilen grupları için leke.
2. Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS ile 5 kez yıkayın.
   Not: Bu adım tamamlandıktan sonra, Şekil 4B, sürgünün bir görüntüsünü göstermektedir.

11. Bakır-free "Click" Azide'da biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı

NOT: Arzu edildiği takdirde, bu alt-tabaka tadilat aşaması, hücre kültürü esnasında in situ gerçekleştirilebilir.

1. 12-çukurlu, s micropatterned coverslide boşolystyrene çanak aşağıdaki HAA durular.
2. 20 uM DBCO-PEG ₄ -biotin ihtiva HAA (ya da hücre kültür ortamı) olarak 2 ml ilave edilir, ve bu reaksiyon oda sıcaklığında 24 saat boyunca devam etmesine izin vermek (ya da bir inkübatör içinde 37 ° C'de).
3. DPBS (ya da sadece bir ortam değişikliği yapılması) ile tamamlandıktan sonra, micropatterned coverslide 5 kez çalkalayın.

Biyotinilat Azit Grupların 12. Immunofluorescent Algılama

1. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca 2 ml DPBS içinde Streptavidin-488 konjugatı (2 ug / ml) (% 3 eşek serumu) ile biyotinile azid grupları için leke.
2. Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS içinde 5 kez yıkayın.
3. Resim konfokal floresan mikroskobu kullanılarak coverslide Micropatterned. Bu adım tamamlandıktan sonra Şekil 4A-C sürgünün görüntüleri yer almaktadır.
   NOT: doku kültürü deneyleri için alt tabakalar kullanırken, bölümleri 10 ve bu protokolün 12 atlayın. İstenen açıda sonraişlevsellik e, bir azot akımı altında% 100 etanol ve kurutulması her iki tarafa da durulama işlenmiş coverslide sterilize edin. Steril bir biyolojik güvenlik kabini için slayt aktarın ve hücre tohumlama ve kültürü ile geçmeden önce PBS ile beş kez slayt durulayın.

Results

Manuel hizalama μCP tekniklerinin kullanılması dik işlevselleştirüerek PEG-aşılı fırçaları Dizilerle kültür substratları mühendisi kimyaları önceki çalışmalarında ⁶ kanıtlanmıştır "tıklayın". Bununla birlikte, bu desen yönlendirme minimum kontrol sağlar ve genellikle fonksiyonalize alanlarında örtüşme ile sonuçlanır. Burada, yeni bir Ar-μCP sistemi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için kullanılır ve onun yetenek için doğru model 300 mikron ID ve 600 mikron OD 600 mikron ile PEG fırça annuli ayrı bir dizi içi...

Discussion

Doku mühendisliği için ideal bir alt-tabakalar Biyolojik Tabanlı Akıllı ve böylece doğal dokuların içinde bulunan kritik bir biyolojik olarak aktif ligandlann uzamsal dağılımını özetlemek olacaktır. Ayrıca, ligandların zamansal ayarlamaları ve yönlendirilmiş doku morfojenezini izin vermek için sunulan ve mekansal olarak hücre akıbetinde indüksiyon sınırlandırıldığı uzamsal desen etkinleştirmeniz dinamik özelliklere sahip olacaktır. Bu gibi maddelerin imalatı yüzeylerde karmaşık ve son derece düzenli yönlerde birden fazl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SCARA	Epson	LS3-401ST	İstenirse artırılmış hassasiyete sahip üst düzey modeller mevcuttur.
(Tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil)triklorosilan	Gelest	SIT8174.0	DİKKAT, Yalnızca kimyasal davlumbazda kullanılmalıdır. Gofretleri silanize ederken, tüm silan buharlaşana kadar kimse davlumbaza girmemelidir.
Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti	Ellsworth Yapıştırıcı Co	NC9020938	Kullanmadan önce çözeltileri vakuma maruz bırakarak kabaca gazdan arındırın. Kit 182 gibi alternatif kitler kabul edilebilir.
24 mm x 50 mm # 1 Kapak Cam Slaytları	Fisher Scientific	48393106	Bunlar, ihtiyaca göre değişen boyutlarda bir dizi tedarikçiden satın alınabilir.
CHA-600 Telemark Elektron Işını Evaporatörü	Telemark	SEC-600-RAP	Özel eğitim gerektirir.
EPSON LS3 SCARA	EPSON	LS3-401ST
& omega; -mertkaptoundesil bromoizobutirat	Prochimia	FT 015-m11-0.2	-20 ° C'de saklayın. Diğer ATRP başlatıcıları bu R-&mu olarak kullanılabilir; CP platformu tüm mikro modelleme modalitelerine uygulanabilir.
Schlenk Tüp Şişesi 50 ml	Synthware	60003-078	Diyaframlı kauçuk tıpalar gerektirir.
Poli (etilen glikol) metil eter metakrilat	Sigma Aldrich	447943	MEHQ ve BHT içermeyen hazır inhibitörler içeren gönderilir.
Metanol (Sertifikalı ACS)	Fisher Scientific	A412-4	DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.
Bakır(II) Bromür	Sigma Aldrich	437867	DİKKAT, cerrahi maske ile maruziyeti sınırlayın.
2,2'-Bipiridin	Sigma Aldrich	D216305	DİKKAT, cerrahi maske ile maruziyeti sınırlayın.
Sodyum L-Askorbat	Sigma Aldrich	A4034
20 ml Borosilikat Cam Sintilasyon Şişeleri	Fisher Scientific	03-340-4E
Sodyum Azide	Sigma Aldrich	S2002	DİKKAT, cerrahi maske ile maruziyeti sınırlayın.
N,N-dimetiformamid	Sigma Aldrich	227056	DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.
Ethanolamine	Sigma Aldrich	398136	DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.
Trietilamin	Sigma Aldrich	T0886	DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.
Dimetilsülfoksit	Sigma Aldrich	276855	DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.
Propargylamine	Sigma Aldrich	P50900	DİKKAT, yalnızca kimyasal çeker ocakta tutun.
200 Proof Ethanol	Wisconsin Üniversitesi Malzeme Dağıtım Hizmetleri	2292	DİKKAT, yalnızca kimyasal davlumbazda tutun.
Azide-PEG3-Biotin	ClickChemistryTools	AZ104-100	DMF
Bakır (II) Sülfat	Sigma Aldrich	C1297	DİKKAT, cerrahi maske ile maruziyeti sınırlayın.
Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA)	Sigma Aldrich	678937
L-Askorbik Asit	Sigma Aldrich	A7506
Fosfat Tamponu Salin	Invitrogen	14190144
Eşek Serumu	Sigma Aldrich	D9663	Eşek serumu ile kontamine olmuş maddeler biyolojik olarak tehlikeli madde olarak kabul edilir ve buna göre imha edilmelidir. Çeşitli diğer bileşikler (örneğin BSA) mevcuttur ve bu amaca hizmet eder.
12 Kuyulu Polistiren Plaka	Thermo Scientifit - NUNC	07-200-81	Plakalar, farklı boyutlara sahip bir dizi tedarikçiden satın alınabilir.
DBCO-PEG4-Biotin	Clickchemistytools	A105P4-10	DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Konjuge	Yaşam Teknolojileri	S-11223	PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 Konjuge	Yaşam Teknolojileri	S-11225	PBS'de Çözündürülmüş
Nikon A1-R Konfokal Mikroskop	Nikon	Nikon Eclipse Ti, A1R	İşlevselleştirilmiş mikro desenli substratları görüntülemek için bir epifloresan mikroskop yeterlidir.