Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin İn Vitro

Summary

Bu yöntem, bakterilerin fagositozunu ve oksidatif patlamayı aynı anda ölçerek granülosit fonksiyonunu değerlendirmek için bir teknik gösterir. Görüntü tabanlı akış sitometrisi, hepsi göreceli fonksiyonel kapasitelerinde farklılık gösteren üç farklı aktive granülosit alt kümesinin tanımlanmasına izin verdi.

Abstract

Granülositler, vücudun bakteriyel ve viral enfeksiyonlara karşı doğuştan gelen bağışıklık tepkisinde anahtar bir rol oynar. Granülosit fonksiyonunu ölçmek için yöntemler mevcut olsa da, genel olarak bunlar sağlayabilecekleri bilgi açısından sınırlıdır. Örneğin, mevcut tahlillerin çoğu, tek, sabit uzunlukta bir inkübasyonun ardından kaç tanenin aktive edildiğinin bir yüzdesini sağlar. Meseleleri karmaşık hale getiren çoğu tahlil, algılama teknolojisindeki sınırlamalar nedeniyle işlevin yalnızca bir yönüne odaklanır. Bu rapor, bakterilerin granülosit fagositozunun ve oksidatif patlamanın eşzamanlı ölçümü için bir tekniği göstermektedir. Bu fonksiyonların her ikisini de aynı anda ölçerek, aktive edilmiş granülositlerin üç benzersiz fenotipi tanımlandı: 1) Düşük Aktivasyon (minimal fagositoz, oksidatif patlama yok), 2) Orta Aktivasyon (orta derecede fagositoz, bazı oksidatif patlama, ancak iki fonksiyonel olayın birlikte lokalizasyonu yok) ve 3) Yüksek Aktivasyon (yüksek fagositoz, yüksek oksidatif patlama, fagositozun birlikte lokalizasyonu ve oksidatif patlama). İnaktive edilmiş granülositlerden oluşan dördüncü bir popülasyon da tanımlanmıştır. 10, 20 ve 40 dakikalık tahlil inkübasyonları kullanılarak, tahlil inkübasyon süresinin aktive edilmiş granülosit fenotiplerinin yeniden dağılımı üzerindeki etkisi değerlendirildi. Dördüncü bir inkübasyon, kontrol olarak buz üzerinde tamamlandı. Seri zaman inkübasyonlarını kullanarak, test, bir tedavinin granülosit fonksiyonunu mekansal olarak nasıl etkilediğini tespit edebilir. Tüm örnekler, kantitatif görüntüleme (QI) seçeneği, otomatik örnekleyici ve çoklu lazerler (488, 642 ve 785 nm) ile donatılmış görüntü tabanlı bir akış sitometresi kullanılarak ölçüldü.

Introduction

Granülositler işgalci antijenlere karşı ilk savunma hattını sağlar vücudun doğal bağışıklık sisteminin bir bileşeni temsil eder. Granülosit fonksiyonu değerlendirmede Önceki yöntemler granülositler ^1-4 değişti nasıl zor topluca tespit yapma, ayrı yöntem kullanılarak fagositoz kapasitesi veya oksidatif patlama üzerinde duruldu. Akış alanındaki gelişmeler, sitometrisi veren yüksek işleme kapasiteli bir şekilde ⁵ hücrelerin yüksek çözünürlüklü, renkli görüntüleme kapasitesine sahip tezgah üstü aletleri üretimi ile sonuçlanmıştır. Geleneksel akışı ile görüntüleme birleştirmek için yeteneği sitometri yöntemleri sitometri mevcut akış içinde yenilik ve bağışıklık sistemi ile ilgili yeni bilgiler elde etmek gerekli teknolojik bir platform sağlayan bir gelişmeyi temsil etmektedir.

Son on yılda, diğerleri arasında, bizim laboratuar, hevesle çeşitli beslenme ve egzersiz tedavileri patte etkisi üzerinde durulmuşturDoğuştan gelen bağışıklık fonksiyonu ^6-9 RNS. Bu yazıda gösterdiği yöntem, klinik immünoloji alanındaki pratik etkileri vardır. Bu yöntem aynı zamanda bakteriyel parçacıklar ve oksidatif patlama fagositozunu ölçmek için görüntü tabanlı akış sitometri gücünü güçlendirir. Bu yaklaşımı kullanarak, bir analiz görüntü tabanlı bölümü tarafından sağlanan değişkenleri kullanarak aktive granülositleri ayırmak mümkün değildir. Bu alt kümeler bireysel granülositlere hücresel görüntüleri değerlendirirken sonra sadece tanımlanabilir vardı. Daha fazla tahlil inkübasyon süresi üç aktivasyon alt grupları ¹⁰ arasında geçişi etkilemiştir. Böylece, birden fazla inkübasyon sürelerinde kullanımı yöntemi, belirli bir deneysel tedavi aşağıdaki granülosit fonksiyonu değişikliği test etmek için izin verebilir olması akla yakındır. Bu yazının amacı, aynı anda oksidatif işlem ile fagositoz ölçmek için görüntü tabanlı akış sitometrik kullanarak değerlendiren granülosit fonksiyonu bir yöntem göstermektiive patladı.

Protocol

NOT: Bu yöntemde açıklanan tüm kan toplama işlemleri Helsinki Bildirgesi çerçevesinde yapılan ve insan denekler için UNT kurumsal inceleme kurulu (KİK) tarafından onaylanmıştır. Tüm denekler, kan normal vücut ağırlığının, görünüşte sağlıklı olmasını sağlamak için, mevcut yöntemde kullanılan toplama, ve hastalık ücretsiz yazılı izin verdi.

1. Reaktif Kaynak & Hazırlık

1. Kullanım CD66b APC (klon # G10F5, DF = 1: 50) ve CD45-APCeFluor780 (klon # 2D1 = 1 DF: 50) Bu deney için.
   NOT: Bu çalışma öncesinde, CD45 ve CD66b antikorları optimum seyreltme belirlemek için titre edildi diğer lökositler açıkça çözülmesi granülositler (CD45 + / 66b +) (CD45 + / 66b-) ^11. Boyama için seyreltilmiş antikorun ilave edilmesi üzerine tüpündeki son seyreltme 875 idi.
2. Satınalma ve stok S. çözülme aureus pHrodo kırmızı bir boya ile etiketlenmiştir bioparticles. 1 m'lik bir konsantrasyonda askıya almasteril PBS içerisinde ml başına bioparticles g. Deneyde kullanılıncaya kadar kısım seyreltilmiş bioparticles ve mağaza -20 ° C'de donduruldu.
3. Ug / ml, 10 nihai konsantrasyona kadar DMSO içinde, oksijen serbest radikal (örneğin, oksidatif patlama) mevcudiyetinde floresan etidyum bromite dönüştürülür dihydroethidium (DHE'nin) içinde çözülür.
4. 200 mg / ml / ml 17.5 mg 2 adımlı sulandırma içinde steril PBS ile (belirli bir deney kuluçkalama süresi, aşağıdaki ek fagositoz önlemek için kullanılır), N-etilmaleimit karıştırın. Tahlilinde, 15 mM'lik bir son konsantrasyon kullanılır. N-etilmaleimid çözülme sırasında N-etilmaleimid çözeltisi içinde kalmaz gibi, bir 37 ° C ısı bloğu kullanın.
5. Son tespit aşamasından sonra, nükleer DNA leke 7AAD kullanın. Önce eklenmesine, steril PBS ile stok 7AAD 01:10 sulandırmak.

2. Kan Numune Toplama

1. Bir O / N hızlı (> 8 saat) ve abstenti aşağıdaki laboratuvarda gelmesi konuları sorfiziksel aktivite (> 12 saat) üzerinde.
2. Bir alkol hazırlık pad ile cilt temizlendikten sonra, bir periferik kol damarına bir steril kan toplama iğne takın.
3. Ticari sodyum heparin ile doldurulur boşaltılmış tüpler içine kan toplayın.
4. Toplandıktan sonra, deneğin koluna bir yapışkan bandaj uygulanır.
5. 10 kez karıştırın ve daha sonra analize kadar bir rocker yerleştirmek için kan tüpleri ters çevirin.

3. fagositoz Analiz tekniği

1. Çözülme S. aureus bioparticles (RT) DHE'nin (RT) ve N-etilmaleimit (37 ° C).
2. Steril kaput çalışırken 4 ayrı 1.2 ml tüplere S.aureus bioparticles 20 L ekleyin.
3. Bioparticles ihtiva eden her tüpe DHE 40 L ekleyin.
4. Yavaşça tüpün dibinde reaktifler toplamak için tezgah yüzeyinde tüpleri dokunun.
5. Bioparticles ve DHE dolu olan her bir tüpe karıştırılmış tam kan 100 ilave edin.
6. Herhangi bir kirletici kan çıkarmak için pamuklu bir uçlu bir aplikatör ile tüplerin iç kenarını silin.
7. Kan ilave edildikten sonra üç çevrim boyunca kan ve reaktifleri karıştırmak için ayarlanmış bir elektronik pipetiyle kan ve reaktifler karıştırılır.
8. Bir buz kovası tahlil tüplerini yerleştirin ve ışıktan korumak için kapak.
9. 10, 20 ve 40 dakika için deney tüpleri inkübe edin. Tüm deney tüpleri aynı anda bitirmek sağlamak için 40 dk tüp ile başlayın.
10. Çözülme N-etilmaleimid 37 ° C boncuk banyosunda.
11. Pipet her tahlil tüpüne (1.4 olarak yukarıda tarif edilmiştir), N-etilmaleimit 15 uL, 30 dakika inkübe edilir.
12. Pipet CD66b-APC 10 L ve CD45-APCeFluor780 (1,1 yukarıda tarif edilen) ile seyreltildi antikorlar, 10 uL, 60 dakika inkübe edilir.
13. Pipet, her tahlil tüpü içine lökosit düzeltme / eritrosit lize çözeltisi 750 uL, 60 dakika inkübe edilir.
14. Santrifüj tahlil tüpleri (400 xg de 10 dakika) hücre pelet toplamak için.
15. Vakum bir kalıntı fl bırakarak, WBC lize / RBC düzeltme çözümü aspirehücre peleti üzerinde kimliği hacmi (100 uL).
16. Seyreltilmiş 7AAD (1,5 yukarıda tarif edilmiştir) çözeltisi, her deney tüpüne PBS içinde 50 L pipetleyin 10 L'dir.
17. Buzdolabında bir folyo deney tüpleri, sarma borular kalibrasyon boncuk (~ 25 L) içinde her tahlil tüpüne yer kapaklar damla ve yer ekleyin.
18. Sitometrede görüntü tabanlı akışına örnek tüp yükleyin ve önceden tanımlanmış parametreler kullanılarak 3.000 granülosit olayların en az toplamak: Otonumuneleyici, mavi (488 nm; 60 mW), kırmızı (640 nm; 100 nW), SSC (785 nm; 8.5 mW) lazerler (Şekil 1).

Şekil 1. Toplama Yöntemi ve Şablon. Örnekler (A) sitometrede bir görüntü tabanlı akış elde edildi. Iktisap sırasında, CD66b-APC vs Parlak Alan Aspect Ratio dot araziler istimal çivili kalibrasyon boncuk ayrılmış granülositlere üretildig INSPIRE v. 100.2.292.0 yazılım (B). Kırmızı, (640 nm; 100 nW), SSC (785 nm; 8.5 mW) lazerler; 5.000 granülosit az mavi bir otomatikörnekleyici'den (60 mW 488 nm) kullanarak her numuneler için elde edildi. Histogramlar bir dizi lazer ayarları ve diğer veri toplamak yönlerini izlemek için satın alma sırasında mevcut olduğunu unutmayınız. Bu histogram tüm isteğe bağlı ve laboratuar standart işletim prosedürleri kalite kontrolü gibi onları gerektiriyorsa, sadece ihtiyaç vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

4. Numune Toplama ve Analiz

1. Görüntülü dosyaları telafi (CIF) ham görüntü dosyaları (RIF) bir tazminat matris uygulamak ve oluşturmak için FİKİRLER yazılım otomatik yazılım tazminat sihirbazını kullanın.
2. FİKİRLER yazılım bireysel CIF dosyaları yükleyin ve granülosit alt kümeleri tanımlamak için aşağıdaki araziler oluşturmak:
Parlak bir alan degrade RMS (Şekil 2A) için bir histogram kullanarak odak olarak kabul edildi hücreleri belirlemek için ilk kapıları oluşturulması. Bir referans standart olarak uyarılmamış kontrol kullanılarak Her bir hasta örneği için, bu tayini yapmak.
3. Vs parlak bir alan bölgede (Şekil 2B) parlak bir alan boy oranı (genişlik vs hücre yüksekliği oranı) bir nokta arsa kullanarak enkaz ve ikili ayrı gömleğin hücrelere ikincil araziler kullanın. Bir referans standart olarak uyarılmamış kontrol kullanılarak Her bir hasta örneği için, bu tayini yapmak.
4. Hücrelerin temiz bir nüfus tespit edildiğini bir kez, olumlu (CD45 + / 66b +) granülositleri tanımlamak için CD66b vs CD45 (Şekil 2C) bir nokta arsa kurmak. S. parlak detay yoğunluğu bir kızı arsa (Şekil 3) oluştur aureus vs oksidatif patlama (DHE'nin, y-ekseni) için parlak detay yoğunluğu (x ekseni) devreye granülosit alt kümelerini belirlemek için. Br toplayınKanal 1 ve 9 ight alan görüntüleri, Kanal 2 bioparticles, DHE Channel 4, 7AAD Kanal 5, CD66b Kanal 11, ve CD45 yılında Kanal 12.

Şekil 2. Analiz Şablon. Bu rakam, odaklama (A) 'da olduğu hücreleri tanımlamak için oluşturulan parsellerin dizi, tek hücreler (B), granülositler (° C). Ek araziler aktive granülositler vs inaktif granülosit üç alt kümelerini belirlemek için kullanılmıştır. Elde edilen görüntü dosyalarının tüm analiz FİKİRLER v.6 yazılımı kullanılarak tamamlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Results

Görüntü tabanlı akış sitometrik kullanarak bize üç farklı aktivasyon alt grupları (Şekil 3) içine aktif granülosit homojen bir nüfusa ayırmak için izin verdi. Bu yöntemde, en etkili yolu, üç aktivasyon alt kümelerini oksidatif patlama vs (S. aureus) (DHE'nin) (Şekil 4 Şekil 3) fagositoz için parlak detay yoğunluğu çizerek olduğunu çözmek için. Ayrıca, FİKİRLER yazılım co-lokalizasyon sihirbazın kullanımı son derece aktif granülosit damgasını işaretidir eşzamanlı fagositoz ve oksidatif patlama varlığı, ölçümü için izin verecektir.

Aktif Granulosit Alt Grupları Şekil 3. Tanımlama. Hücre-yüzey belirteçleri (CD45 + / 66b +) kullanarak granülosit tanımlanmasından sonra, bir kızı arsa parlak detay niyet etme ile oluşturulmuşturoksidatif patlama için parlak detay yoğunluğu vs fagositoz için versitesi. Bu yaklaşım, etkin (mor), düşük aktif maddenin yüzdesi (kırmızı, A) orta aktif kullanarak (mavi, B) ve yüksek aktif (sarı, C), granülositler belirlenmiştir. Bu geçit tekniği de çeşitli aktif granülosit alt-görece bolluğu ile deney kuluçkalama süresi etkisini değerlendirmek için kullanıldı. "yüksek-aktif" granülosit yüzdesi en yüksek 40 dakika inkübasyon aşağıdaki mevcuttu. Elde edilen görüntü dosyalarının tüm analiz FİKİRLER v.6 yazılımı kullanılarak tamamlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Aktif granülosit üç farklı alt-gruplar varlığını gösteren ek olarak, bu deney, kuluçkalama süresi, her aktif granülosit alt-görece bolluğu etkilediği gösterilmiştir. Spesifik olarak, 40 dakika Inc.ubation "yüksek-aktif" granülosit büyük yüzdesi ile sonuçlanmıştır. En az üç tahlil inkübasyon süreleri dahil ederek verilen bir klinik tedavi granülosit zamansal aktivasyon durumunu nasıl değiştirdiğini belirlemek mümkün olabilir. Bu fagositoz ve oksidatif patlama, aynı anda ölçümlerin bir fonksiyonu olarak farklı aktif granülosit alt kümelerini tanımlamak için görüntü bazlı akış sitometrik kullanarak ilk yayınlanmış bir yöntemdir.

Hücresel Markerlerinin Şekil 4. Temsilcisi Görüntüler. Yüksek aktif (A) olarak sınıflandırılan hücrelerin bir resim galerisi, orta-aktif (B), ve düşük-aktif (C) Bu şekilde sunulmaktadır. S.aureus bioparticles Ch03 vardır oksidatif patlama CD66b olduğunu, yan dağılım Ch06 olduğunu, çekirdeğin için 7AAD Ch05 olduğunu, Ch04 içindeCH11 ve CD45 CH12 bulunmaktadır. Ayrıca, oksidatif patlama vs fagositoz (Ch03) (Ch04) eş-lokalize birleştirme görüntü gösterilir. Birleştirme görüntünün sarı Alanları bu fagositoz ve oksidatif patlama aynı anda aynı anatomik alanda yaşanıyor göstermek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bu yöntem ^1,3,4,12-14 flow sitometri kullanılarak granülosit fonksiyonunun değerlendirilmesi için mevcut yöntemler arıtma temsil eder. Bu deneyde kritik adım bioparticles ve DHE kan numunesinin uygun karıştırma ile ilişkili olma eğilimindedir. Eksik karıştırma doğru sonuçlara neden olur. Tam karıştırma kritik olsa da, karıştırma yöntemi doğada yumuşak olmalıdır. Bir karıştırma fonksiyonu yerine, bir girdaplı karıştırıcı ile bir elektronik pipet kullanılarak gerçekleştirilebilir karıştırma önerilmektedir. Tahlilde bir başka kritik adım her zaman tahlil borusunun üst yarısını kirlenmesine neden kan yoktur sağlamaktır. Bu kalıntı kan steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanılarak temizlenebilir. Başarısızlık un-lize kırmızı kan hücreleri ile son tahlil hazırlık kirletebilir bunu çünkü tamamen çıkarılması önemlidir.

Bu yöntemi, uygun dengeleme kontrol kullanmadan önce sp kontrol etmek için ilave edilmelidirgranülosit fonksiyonu çeşitli yönlerini tanımlamak için kullanılan reaktifler arasında ectral örtüşme. Bu yöntem için, dengeleme kontrol 40 dakika deney inkübasyon önerilen ve daha sonra tek bir işaretleyici ile etiketleme gibi kan örnekleri toplamak içerir (yani, E. coli, DHE'nin, vs.). Etiketlemeden sonra, tek pozitif vaka toplanmış ve bir telafi matris Fikirler analiz yazılımı içinde otomatik bir sihirbaz kullanarak oluşturulur. Bu deney kullanılırsa, uygun tazminat kontrolleri Uygun test performansının sağlanması için tamamlanmış olması önemlidir.

Analiz parlak detay yoğunluğu popülasyonları ayırmak için en iyi değişken olduğunu belirlemek ve aynı zamanda çok örtüşme oksidatif patlama ve fagositoz sinyalleri arasında mevcut nasıl tanımlamak için özellik bulucu ve ortak yerelleştirme sihirbazları kullanılarak gerçekleştirilir. Özellikle, görüntü tabanlı sitometri kullanımı üç alt kümeleri içine aktif granülositleri ayırmak yeteneği sağladı. TOnun alt kümesi arıza oksidatif patlama vs fagositoz parlak detay yoğunluğu kullanılarak belirlenmiştir. Tekil hücre fonksiyonlarını incelemek ek olarak, aynı anatomik konum (eş-lokalizasyonu) 'de, aynı zamanda her iki olayı sergilenen hücreler tespit edilmiştir. "Yüksek-aktif" alt kümesi içine düştü granülositler fagositoz ve oksidatif patlama arasında tutarlı ortak yerelleştirme gösterdi tek fenotip vardı. Aktive granülosit alt gruplarının Bu tanımlama giderme gerekli büyük alandır. Yeni bir kullanıcı FİKİRLER örnek süreç iş akışı anlamak için zaman ayırın ve görüntüleme bileşenini kullanarak hücre popülasyonlarının yolluk mekaniğini anlamak için çok önemlidir. Bir kullanıcı yapmak isteyebilir Diğer değişiklikler alternatif veya ek tahlil inkübasyon sürelerinde seçimini içerir. Mevcut yöntem 10-40 dakika süreleri kullanımını önerir; Bununla birlikte, deney modeline bağlı olarak, bu yöntem, buradakullanılmak üzere, daha uzun deney süreleri belirlemek için gerekli olabilir. Böyle bir değişiklik bireysel olarak değerlendirilmesi gerekir.

Ayrıca bu tahlil inkübasyon süresi üç aktive alt kümelerinin görünümü üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir. Bu raporda açıklanan yaklaşım daha önce granülosit fonksiyonu ^3,4,13,15 ilgili elde edilebilir hangi bilgilerin bir uzantısı temsil eder. Diğer laboratuvarlar dokunulmazlık ve hastalığın ^15-17 kapsamlı bir değerlendirmesinin bir parçası olarak granülosit fonksiyonu değişiklikleri değerlendirmek önemini göstermiştir. Bu tahlilin potansiyeline rağmen bu da kısıtlı tarafları yok değildir. Büyük sınırlamalar biri yüksek numune hacmi işleme ile ilişkili maliyet ve zaman talebidir. Bir çalışma tasarımı, belirli bir günde numune çok sayıda gerektirdiğinde, bu işleme tabi tutmak zor olabilir. İşleme elektronik pipetleri ve dağıtıcılar kullanımı ile aerodinamik,ancak bu pahalı olma eğilimindedir ve her laboratuarda mutlaka mevcut değildir.

Araştırma alanımız egzersiz ve beslenme alışkanlıkları bağışıklık sistemi sağlığını etkileyen ve ^6,8-10,18-20 işlev nasıl bir çalışma üzerinde duruluyor. Bu tür hedefler, insan sağlığı alanlarında çeşitli önemli pratik etkileri vardır. Fagositoz fonksiyonu izlenmesi tedavi sonuçlarının kritik olduğu egzersiz ve beslenme etkileri çalışmanın ötesinde, bu yazının gösterdiği fagositoz yöntemi klinik immünoloji diğer alanlarda yararlı olabilir. Bu deney potansiyeli ile immünolojik testler sitometrede bir görüntü tabanlı akıştan olabilir olabilir eşsiz görüntüleme bilgileri avantajlarını alarak yeniden icat edilmesi pek çok ilki.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kan alımı için kullanılan	Vacutainers	BD Yaşam Bilimleri
WBC Fiksatif / RBC Lizis çözeltisi	eBioscience	00-5333-57
CD66b-APC	eBioscience	klonu G10F5
CD45-APCeFluor780	eBioscience	klonu 2D1
S. aureus biyopartiküller	Yaşam Teknolojileri	A10010
dihidroetidyum	Sigma-Aldrich	D7008
N-etilmalemid	Sigma-Aldrich	4259
7AAD	EMD Millipor
Hematoloji Analiz Cihazı	Mindray	BC-3200
96 kanallı pipet	Integra Biosciences	ViaFlo
Boncuk Banyosu İnkübatörü	LabArmour	BeadBath
Görüntüleme Akış Sitometresi	EMD Millipore	Amnis FlowSight
INSPIRE Yazılımı	EMD Millipore	Amnis INSPIRE
IDEAS Yazılımı	EMD Millipore	Amnis IDEAS
X-Pierce Piercable Plaka Mühürleyen	Excel Scientific, Inc.	X-Pierce
Dell Precision İş İstasyonu		IDEAS analizi için Kullanılan	Çeşitli Dell Bilgisayarlar