Yöntem makalesi

FIM Görüntüleme ve FIMtrack: Yüksek verim ve Maliyet Etkili Hareket Analizi izin İki Yeni Araçlar

13.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52207

⸱

24 Aralık 2014

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuro and Behavioral Biology, Westfälische Wilhelms-Universität Münster, 2Department of Mathematics and Computer Science, Westfälische Wilhelms-Universität Münster

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

FIM C gibi küçük hareketli nesneleri izlemek için tasarlanmış bir roman, maliyet etkin bir görüntüleme sistemi elegans, planaria veya Drosophila larvaları. Ekteki FIMTrack programı hızlı ve verimli veri analizi sunmak için tasarlanmıştır. Birlikte, bu araçlar davranışsal özelliklerin yüksek verim analizi sağlar.

Özet

nöronal ağ fonksiyonu analizi davranışsal özelliklerinin güvenilir bir ölçüm gerektirir. Serbest hareket eden hayvanlar arasında, belirli bir zaman bir dereceye kadar değişken olduğu için, pek çok hayvan istatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için, analiz edilmesi gerekir. Bu da hareket desenleri bir bilgisayar destekli otomatik ölçümü gerektirir. Neredeyse saydam ve küçük hareketli nesnelerin yüksek kontrastlı görüntüler elde etmek için, FIM denilen sinirli toplam iç yansıma dayalı yeni bir görüntüleme tekniği geliştirilmiştir. Bu ayarda, hayvanlar sadece altta yatan tarama yüzeyi ile temas çok özel konumda kızılötesi ışık ile aydınlatılmış. Bu metodoloji çok yüksek kontrastlı görüntüler elde edilir. Daha sonra, bu yüksek kontrastlı görüntüler kurulan kontur izleme algoritmaları kullanılarak işlenir. Buna göre, kantitatif hareket yeteneği büyük bir çeşitlilik tanımlamak için gerekli olan bir dizi özellik elde etmek için karşılık vermektedir FIMTrack yazılımı geliştirmiştirözellikleri. Bu yazılım paketinin geliştirilmesi sırasında, biz daha fazla modüllerin kolay eklenmesini sağlayan bir açık kaynak mimarlık bizim çabaları yoğunlaşmıştır. Program platform bağımsız çalışır ve veri analizi ile kullanıcıya rehberlik sezgisel bir kullanıcı arayüzü eşlik ediyor. Tüm hareket parametre değerlerinin daha fazla veri analizleri izin csv dosyaları şeklinde verilmiştir. Buna ek olarak, izleme yazılımına entegre bir Sonuçları Görüntüleyici etkileşimli gözden ve uyarıcı entegrasyonu sırasında gerekebilecek gibi, çıkışını ayarlamak için fırsat sağlar. FIM ve FIMTrack gücü Drosophila larvalarının lokomosyon inceleyerek gösterilmiştir.

Giriş

Çoğu hayvanlar son derece sofistike ve kontrollü bir şekilde hareket yeteneğine sahip. Genetik temeli altta yatan hareket kontrolünden deşifre kantitatif farklı davranış kalıpları değerlendirmek zorunludur. Bu bağlamda, Drosophila ideal bir model olarak hizmet edebilir. Özgürce uçan Drosophila Takip vermeyen 1-4 ama oluşur nispeten düşük hızda iki boyutta Drosophila larva tarama ve böylece kolayca izlenebilir edilir. Uygun aydınlatma ile birlikte kamera tabanlı kurulumları görüntüleri 5 elde etmek için kullanılır. Olay veya iletilen ışık ikisi de davranışsal deneyler 6,7 istihdam edilmektedir. Ancak, larva ve larva hareketlerin tarama yüzeyi sadık kayıt olası ışık yansımaları yarı-saydam vücut için zor olabilir. Bu tür sorunların üstesinden gelmek için bazı karmaşık yöntemler geliştirilmiştir. Son zamanlarda, karanlık alan aydınlatma ön / arka cont geliştirmek tanıtıldırast 8. Kamera tabanlı kayıt, lens daha az optik görüntüleme ve alternatif olarak görüntü sensörü-az on-chip satın alma teknikleri 9-11 tanıtıldı.

Çeşitli izleme programları piyasada mevcut yazılım 12 ve özel çözümler de dahil olmak üzere, son zamanlarda getirilmiştir. Yüksek verimli izleme programları için örnekler Çok Worm Tracker (MWT) olan 13 ve Multianimal Yürüme Ve Parça (MAGAT) 8. Çarpışan hayvanlar çok sayıda yeni hayvan kimlikleri yol böylece ikisi de ortak, birden fazla hayvan, tek bir açık alan arenada izlenebilir var. Bu sınırlamayı aşmak için, bir çok iyi Kur bireysel kuyuların 14 içine 12 hayvan ayıran tanıtıldı. Tek tek bireylerin lokomosyon kesin miktar mikroskop 15 ile birlikte hareketli bir izleme aşaması kullanılarak elde edilebilir. Ancak, tüm bu yaklaşımlar, ya maliyet verimsiz, eksikliği yeterli yenidençözüm veya yüksek verimli fenotipleme için alıcı çok zaman.

Sinirli Toplam İç Yansıma (FTIR) 16 (Şekil 1) dayalı, yukarıda belirtilen sınırlamaları aşmak için, biz geliştirdik FIM (FTIR-tabanlı Görüntüleme Yöntemi). Bu yeni görüntüleme yaklaşımı benzeri görülmemiş bir yüksek kontrast sağlar ve hatta hayvanların 16 emekleme çok renkli kaydedilmesini sağlar. Bu kullanışlı ve etkili bir yöntem yatan prensibi kolaydır. Akrilik cam plaka ışığı ile sular altında (örneğin, 875 kızılötesi nm). Nedeniyle akrilik cam ve hava farklı kırılma endekslerine göre, ışık tamamen cam / hava sınırında yansıtılır. Akrilik cam Isıtma yok 16 olduğunu kaydetti. Daha yüksek bir kırılma indeksine sahip nesneler aydınlık bir tablo dokunmayın Sadece eğer, bu nesneleri girebilirsiniz ışık olabilir. Hayvanlar yüzeye dokunursanız, ışık yansır ve (Şekil 1) aşağıdan yakalanabilir. Sonuç olarak, sadece kontakHayvanların alan genel bir siyah arka plan ile ayrıntılı görüntüleme sağlayan bir parlak nokta olarak görünür. Böylece, FIM-görüntüleme, bilgisayar görme algoritmaları için mükemmel filmler kaydetmenize olanak verir. FIM basit ve sağlam kullanımı artık erişemeyeceği içine karmaşık hayvan davranışları ayrıntılı yüksek kapasiteli analizini getiriyor ve işleme bilgisini çalışmak için kullanılabilir: örneğin, koku alma duyusunu 8, 16; vizyon 17 veya thermosensation 18.

figure-introduction-1
Isı-uyaran entegrasyonu ve altta yatan fiziksel ilkeler 1. FIM kurulum Şekil. (A) FIM kurulum. Aydınlatma yoğunluğu ön panelde kontrol edilebilir. (B), bir ısı uyaran sunmak için, siyah, alüminyum levha boyalı her iki yanında sıcak ve soğuk su ile perfüze agar yüzeyi üzerinde 2 mm yerleştirildiğikendisi 2 mm kalınlığındadır. gradyan sıcaklık farkları ile radyatör plaka ve agar üzerine kurulmuştur (C) sinirli toplam iç yansıma fiziksel prensibi:. Bir akrilik cam plaka kızılötesi ışık ile aydınlatılıyor. θ 1, θ 2, θ ve 3 ışık yansıması açıları göstermektedir. n, A, 1, n = 2 ve n = 3 n, sırasıyla hava, akrilik cam, agar ve larva kırılma indislerine gösterir ve eşitsizliği n A 1 2 3 yerine getirmektedir. Nedeniyle kırılma için, yansıma açısı geçişi sırasında değişir. Açı kritik açı altında ise, ışık artık yansıtılmamıştır katmanları geçebilir ve aşağıdan yakalanabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

spFIM ile analiz edilebilir işlemlerin ectrum geniştir. Başka ayarlamalar olmadan FIM görüntüleme Drosophila (Şekil 5B) tüm larva evreleri izlemek için kullanılabilir veya Drosophila 19 yetişkin taban izlerine takip etmek için kullanılabilir. C. Aynı şekilde, yörüngeleri elegans veya planarian flatworms hareketi kolayca (Şekil 5C) kaydedilebilir. Mantar hif veya kök saç büyüme bile analizi mümkün 19 belirir. Mevcut FIM kurulumunda, 4 x 16 kızılötesi ışık yayan diyotlar (LED'ler IR) (Şekil 1) izleme tablosu olarak adlandırılan, 32 x 32 cm 2 akrilik cam plaka içine entegre edilmiştir. IR LED yoğunluğu kolaylıkla darbe genişlik modülasyonu (PWM) ile devresine bağlı bir mikro kontrol cihazı tarafından yapılabilir izleme masanın üzerine yerleştirilmiş, ağırlığına bağlı olarak ayarlanır. FIM aydınlatma şiddetleri geniş bir yelpazede üzerinde çok yüksek kontrastlı görüntüler verir. Önemlisi, bu genzaten düşük toplam kızılötesi irridation mükemmel sonuçlar, kalkış sırasında.

Kızılötesi filtre ile bir kamera kurulum içine ek uyaranların entegrasyonunu sağlayan izleme masası, aşağıda yer almaktadır. Isı uyarıcı kolayca radyatör plakası ile uygulanabilir ve hafif uyaran bir LCD projektör tarafından uygulanır. Ayrıca odorants basit kapak 8 ile geçişlerini bulunan edilebilir. Isı gradyanı deneyleri için, radyatör plaka, sırasıyla her iki tarafında, sıcak ve soğuk su ile perfüze edildi ve larvaları (Şekil 1B) 2 mm yukarısında, yerleştirilir.

yüksek kontrast, yüksek kaliteli filmleri nesil gelişmiş bilgisayar tabanlı görüntü analizi için olasılığını açar, böylece biz görüntülerden özellikleri büyük bir set ayıklamak için (Şekil 2) FIMTrack yazılımını uyguladı. İlk altı temel özellikleri hayvanın (Şekil 3A) ve konturdan tanımlanmıştır. Bu özellikler temel sağlarBelirli bir zaman noktasında (Şekil 3B) de hayvanlar şekil ve bazı uyaranlar onun konumunu tanımlayan altı ikincil özellikleri daha hesaplanması için. Şu anda, dokuz üçüncül özellikleri zamansal yönlerini entegre ve dolayısıyla birincil ve ikincil özellikleri (Şekil 3C) ile birlikte hayvan lokomosyon karakterize olduğu hesaplanmaktadır.

figure-introduction-2
Şekil 2. FIMTrack genel bakış, algoritmik iş akışı ve larva gösterimi. (A) Nasıl FIMTrack kullanmak için. görüntüleri yüklenir. Gri değer eşik ve tek larvaları tanımlayan larva boyut eşikleri ayarlanması gerekir. larva alan [min-boyutu, maksimum boyut] olmalıdır. Takip Vurgulanan düğme ile başlatılır. (B) İzleme iş akışı. Start düğmesine tıkladıktan sonra, arka plan görüntüsü cayeniden hesaplanır (zaman içinde en az yoğunlukları). Sürece sol kare olduğu gibi, larva gri eşik ve min- ve maksimum boyutu eşiğine göre segmentlere ayrılmıştır. Larva temsiller hesaplanır tüm segmentlerinin için ((C) karşılaştırmak). Her yeni model geçerli parça mevcut ise, belirli bir yörünge için ilişkilidir. Son kare ulaşılırsa, sonuçlandırılması sonrası işleme çıkış kuşak tarafından takip yapilir. (C) Larva temsil. Hayvan bir baş ve kuyruk noktası (h t) oluşur. Bu noktalar arasında omurga noktaları s keyfi bir tek sayı i r yarıçaplı i ayarlanabilir. Ayrıca, kütle m ve açı γ bükme ana gövdenin merkez hesaplanır. Birkaç hareket ile ilgili parametreler mor çizgilerle çizilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


FIMTrack tarafından hesaplanan 3. Özellikler Şekil. Hayvanların kontur dayalı (A) Birincil özellikleri. (B) İkincil özellikleri, birincil özelliklere dayalı. (C) Tersiyer özellikleri, ardışık çerçeve ve ek girişler birincil özelliklerine göre bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.

Protokol

NOT: Burada, FIM kullanımı serbest hareketli koşullarında ve ısı uyaran etkisi altında tarama için larva lokomosyon kullanışlı yüksek verimlilik analizi için sunulmuştur. Böyle koku uyaranlara bağımlı hareket veya talep üzerine temin edilir protokol, ince değişiklikler gerekebilir haddeleme veya diğer davranışların yüksek çözünürlüklü görüntüleme analizi gibi diğer uygulamalar.

Deney 1. Set-up

  1. Istatistiksel olarak anlamlı değerler elde toplam (gerekli 1 saat süre) genotip başına yaklaşık 100 larva kullanın. NOT: Birkaç genotipleri karşılaştırılmış ve farklı günlerde kaydedilen gereken durumda, günde genotip başına larva aynı sayıda kaydedin.
  2. Çoğu uygulama için, parametre analizi için, 10 Hz, kaydı. Gerekirse yüksek çözünürlüklü görüntüleme uygulamaları için, görüntüleme hızı değişir.
  3. Üçüncü evre larvaları, yumurtlama sonrasında 120 saat hakkında davranış deneyleri izleme için. Sur yapKültürler deney süresi (4.3 bakınız) yeterli larvaları elde e.
  4. Olmayan teşvik uygulamalar için, yarı saydam agar ihtiva eden bir tarama yüzeyinin hazırlanması (bölüm 2). Isı degrade uygulama için uyaran aralığında larvaları ihtiva etmek, caydırıcı bir tuz agar engeli (bkz bölüm 3) ile görüş alanını kuşatır.
    NOT: Diğer uygulamalar farklı yüzeyler gerektirebilir.
  5. Sabit çevre koşullarında (sıcaklık, ışık, hava akımı, hava nem vb) ile bir oda kullandığınızdan emin olun.

2. Crawling Yüzey Hazırlama (Saydam Agar)

Not: FIM ayarda bir agar yüzeyinin nemli bir tarama yüzey temin etmek üzere ilave edilir. Buna ek olarak, aynı zamanda aydınlatma özelliklerini iyileştirir.

  1. Deiyonize ultra saf su içinde% 0.8 gıda sınıfı agar kaynatın. Tarama uygulaması için 400 ml hazırlamak.
  2. Ayrı bir 33 cm x 33 cm ac 50 ° C (el-sıcak) de ağar dökünasirilik-cam levha. agar yüzey gerilimi ve böylece sıcaklık, agar kütüğün kalınlığını belirleyecektir. 50 ° C'de, 2 mm kalınlığında, agar levhalar elde edilmiştir. Kaynadıktan sonra ajitasyon ve kabarcıkları önlemek için sürekli dökmeyin. Yaklaşık 4 saat her görüntüleme süre taze ağar döşeme hazırlayın.
  3. Temiz, sıralamak ve deney öncesinde (genotip başına 1 tabak) ile larva alıştırarak kalan% 0.8 agar solüsyonu ile standart 6 cm petri kapları doldurun.
  4. Caydırıcı bir ağar bariyer uygulaması için gerekli olan durumda, bölüm 3 geçin.
  5. Kayıt için bir düzlem kare yüzey elde etmek ağar levhanın çevresinin yaklaşık 2 cm keserek. Fazla agar çıkarın.
    NOT: büyüklüğü uygulamaya bağlıdır.
  6. Doğrudan hafifçe akrilik cam levhanın kenarına kayma agar iterek soğutulduktan sonra FIM kurulum agar slab aktarın.

3. İsteğe bağlı: kursak bir Caydırıcı Agar Bariyer eklemeling Yüzey (Tuz Agar)

  1. Deiyonize ultra saf su içinde 3 M NaCl ile% 2.5 agar gıda sınıfı kaynatın. Bir ısı degrade tarama için 200 ml hazırlamak.
    NOT: hacim uygulamaya bağlıdır.
  2. Daha önce de 2 cm genişliğinde bir çentik kesin görünüm (22 x 22 cm) alanını çevreleyen emekleme yüzey döktü.
    Not: Farklı bir bariyer meydana getirmektedir ve bakış alanları uygulamaya bağlı olarak gerekli olabilir.
  3. Izleme yüzeyinden daha 0,1-0,3 cm daha yüksek tuz ağarı ile çentik doldurun.

4. Fly Taşıma

  1. Arka% 65 hava nemi standart sinek gıda denemenin zaman ayarlandı 12 saat ışık / karanlık döngüsü ile 25 ° C inkübatör uçar.
  2. Haçlar için, CO 2 ile 30 bakire kadın sinekler ve 8 erkek uyutmak ve 35 ml gıda ile 130 ml kültür şişeleri onları çapraz.
    Not: 35 mi gıda ile bir 130 ml kültür şişesi yaklaşık 20-30 l verecektir4 saat görüntüleme aralığı içinde üçüncü evre larvaları yedik. Tüm larva evrelerinde Görüntüleme ve izleme çalışmaları.
  3. Geç Üçüncü dönem larva hareketi sürücü ve küçük bir fırça kullanarak flakon duvarlardan en büyük larvaların toplamak için kültür şişeleri biraz su bırakın.
  4. Kayıt öncesinde 2-5 dakika, alıştırarak ve bunları temizlemek için deiyonize ultra saf su içinde% 0.8 gıda sınıfı agar içeren bir Petri-çanak bir video için transfer larvaları.

5. Kayıtlar için FIM Görüntüleme Kur (Non Teşvik Şartları) ayarlanması

  1. Gerekirse kamera lensi odak ve diyafram ayarlayın. İlgili kamera için pozlama süresini ayarlayın.
    NOT: Bu ayarlar bir deney sırasında değiştirilmesi gerekmez.
  2. Bir larva görüntüleme ile iyi kontrast elde etmek için aydınlatma yoğunluğunu ayarlayın.
  3. Kayıtları sırasında oda sabiti çevre koşulları tutun. Yönlü ışık ile larva rahatsız değil oda karartmak.

6. İsteğe bağlı: Kayıtlar için FIM Görüntüleme Kur (Kademeli Sıcaklık Uyarıcı Koşullar) ayarlanması

NOT: Isı degrade cihazı üst sitede bir mat siyah boya ve yalıtım malzemesi ile 42 x 42 x 0.2 cm 3 alüminyum plaka. Plaka iki ucunda kalorifer / soğutucular ve pompalara bağlı iki farklı devreler su ile perfüze (Şekil 1B bakınız). sıcaklıklar -5 den +50 ° C ayarlanabilir.

  1. Deneyler öncesinde ısı degrade cihazı 1 saat açın ve dengelenmeye istenen sıcaklık profili ve bileşenleri kuran izin kurulum üzerine yerleştirin.
  2. Kurulum için bir tuz bariyeri ile tarama yüzeyi agar aktarın.
  3. Agar üzerinde radyatör plakasını yerleştirin ve (~ larvaları üzerinde 1 mm) plakası ve 2 mm tarama yüzeyi arasındaki mesafeyi ayarlayın.
  4. Arasındaki bir doğrusal eğimi oluşturulmasıen az 0.8 ° C ile 34 ° C (yaklaşık. görüş alanında bir engel 2 cm) ile 18 ° C (yaklaşık. görüş alanında karşı yerinde bariyerden 2 cm) ile ayarlanarak / cm 1 ° C ve 45 ° C su devresi sıcaklığı.
    NOT: metal plaka Farklı degrade özellikleri ampirik tespit edilmesi gereken farklı sıcaklıklar gerektirir. Bu ayarlar deneyler sırasında değiştirilmesi gerekmez.
  5. 5. bölümünde açıklandığı gibi ayarları yapın.
  6. Tarama yüzeyi 20 dakika için deney öncesinde gradyanı dengelenmeye bırakın. Bir sıcaklık ölçer ile sıcaklık değişimini test edin.
  7. Bölüm 8 ile devam edin.

7. FIM Görüntüleme (Non Uyarıcı Koşullar)

  1. Yavaşça alışkanlık petri 15 larva toplamak ve izleme yüzeyinin merkezine aktarmak için küçük bir ıslak fırça kullanın. Gıda kalır ya da çok fazla havale etmeyinsu (7.8 bakınız).
  2. Kayıt 1 - 22 cm x 22 cm izleme alanında 50 larva. (Istatistiksel nedenler genotip başına en az 100 birey kullanmak için), en tarama uygulamaları için video başına 15 hayvan kullanın.
  3. Yavaşça larvaları ayrı ve tüm larvalar kayıt önce düz hareket başlayana kadar yaklaşık 10-20 saniye bekleyin.
  4. Olmayan uyaran koşulları için saniyede 10 kare 2 dakika larva lokomosyon kaydedin. Çıkış biçimi olarak sıkıştırılmamış tif görüntüleri kullanın.
  5. Kayıt sırasında, onları alıştırmak için şişeleri sonraki video için larvaları toplamak Kritik:. Işık kaydedilen larvaları rahatsız etmeyin.
  6. Kayıttan sonra, büyük bir fırça ile larva kaldırmak ve yerel güvenlik ve mevzuat kurallarına uygun olarak atın.
  7. Larvaları çıkardıktan sonra, temiz ve ultra saf deiyonize su ile tarama yüzeyini nemlendirmek için fırça kullanın.
  8. Kritik: her zaman nemli yüzeye tutun, ancak aşırı mo önlemekhaleler veya kayıtları larva çevreleyen damla ve rahatsız izleme gibi görülebilir isture.

8. İsteğe bağlı: FIM Görüntüleme (Kademeli Sıcaklık Uyarıcı Koşullar)

  1. Sıcaklık gradyanı (bkz bölüm 6) kurulduktan sonra, (8.2), örneğin tarama yüzeyinde larvaları yerleştirdikten sonra 20 saniye içinde kayıt anlık kayıt yazılımı hazırlamak, video başına kare sayısını ayarlamak ve tasarruf yolunu tanımlar.
  2. Biraz radyatör plakasını kaldırın ve tuz bariyer 33 ° C 2 cm larva yerleştirin. Daha fazla genel talimatlar için 6. ve 7. bakın. Tekrar radyatör plakasını indirin ve larva düz hareket etmeye başladı hemen sonra 3-4 dakika kaydetmeye başlayın.
  3. Kayıttan sonra, doğrudan temiz larvaları kaldırmak ve yüzey nemlendirir. NaCl yayılmasını önlemek için tuz agar dokunmayın.
  4. Kritik: her zaman nemli yüzeye tutun ama kaçınınhaleler veya kayıtları larva çevreleyen damla ve rahatsız izleme gibi görülebilir aşırı nem,.
  5. Görüntüleri kaydetme ve sonraki video için hazırlamadan önce yeni hayvan toplarken, ağar yüzey 1-2 dakika nemlendirici sonra yeniden dengelenmeye izin verin. Bir pyrometer her 5 videoları kullanarak sıcaklık değişimini kontrol ve gerekirse (izleme yüzeyine göre su sıcaklığını, yükseklik ve xy yönlendirme) sıcaklık cihazı ayarlayın.

Larvaların Locomotion 9. İzleme

NOT: Daha fazla detay FIMTrack (ek) için ekli kılavuzuna bakın. Bir program akış şeması için Şekil 2'ye bakınız.

  1. Önizleme seçeneği kullanılarak ilgili deneyler için izleme parametrelerini ayarlayın.
    1. Kamera ve görüş alanına göre cm başına piksel ayarlayın.
    2. Kamera ayarlarına bağlı olarak saniyede kare ayarlayın.
    3. Inci böylece parlaklık eşikleri ayarlayınTüm hayvanlarda (geribildirim önizleme verilmiştir) doğru tespit edilir.
    4. Larva alan boyutu eşikleri ayarlayın. Önizleme geribildirim seçeneği Not: Tek hayvanlar kırmızı vurgulanır ve her hayvanın alan mavi verilmektedir larvaların çarpışan, sarı vurgulanır.
  2. Sağ alt düğmesini kullanarak izleme başlayın.
    NOT: Başarılı izleme sonra, larva parçaları ve hesaplanan hareket ve duruş özelliklerini içeren bir csv dosyası içeren bir görüntü, görüntü dizininde saklanır.
  3. Izleme sonuçlarını gözden elle ayarlamak için FIM Sonuçları izleyici modülü (Düzen> Sonuçları Görüntüleyici ...) kullanın. Gerekirse, bir odorant kaynağına ısı gradyanı veya mesafe açısından yönünü emekleme, uyaran rejimi örneğin bakımından verileri değerlendirmek için teşvik bölgeleri tanımlamak. Daha fazla ayrıntılı bilgi için manuel (ek) kullanın lütfen.

Verilerin Değerlendirilmesi 10.

  1. Excel, Matlab içine CSV dosyası veya ileri istatistiksel analizler için başka bir program aktarın.

Sonuçlar

Farklı çözünürlük özelliklerine sahip birkaç farklı kamera görüntüleme için (Şekil 4) test edilmiştir. Uygun bir IR filtresi ile donatılmış tüm kameralar. Bu testte en düşük fiyatlı kamera düşük çözünürlükte göre, görüş alanı 10 cm x 10 cm ile sınırlıdır. En iyi sonuçlar, bir 4 megapiksel (MP), kamera kullanılarak elde edildi. Bu üçüncü evre larva uzunluk başına 100 piksel çözünürlüğe yol açar ve kolayca iç yapıları tanımak için izin verdi. Buna ek olarak, hayvan peristalsis kolayca (Şekil 4A) elde edilebilir. Ancak, hala da FIMTrack tarafından analiz edilebilir az pahalı kameralar kullanarak yüksek kontrast filmleri elde edebilirsiniz. 8 bit derinliği ve 1.392 x 1,040 piksel çözünürlüğe sahip 1.4 MP kamera kullanarak yaklaşık yarı fiyatına ve görüş alanında Üçüncü dönem larva uzunluk başına 45 piksel çözünürlüğe izin verir. Baş ama diğer iç yapılar kabul edilebilir (Şekil 4B). İzleme ve peristaltizm tespiti mümkün ama doğruluk (Şekil 4B) azalır.

1.4 MP kamera ile karşılaştırılabilir bir mekansal çözünürlüğe sahip daha ucuz 0.8 MP kamera ile, larva kafa (Şekil 4C) artık sadakatle kabul edilemez. İzleme ve peristaltizmin analizi mümkün ancak artan gürültü dayalı daha fazla titremeleri dahil. Şaşırtıcı, hatta düşük çözünürlüklü USB web kamerası (20 €, Şekil 4D altında, 0.3 MP kamera) larva yörüngeleri hesaplamak için yeterli kalitede filmler sağlar. peristaltizmin alanından hesaplanabilir ancak ölçümler çok gürültülü.

Bizim kurulum biz rutin 4 MP kamera kullanın. Tarama için, bu kamera besbelli yüksek kapasiteli analizi mümkün olduğunu böylece aynı anda hayvanların çok sayıda analiz fırsatı sağlayan 22 cm x 22 cm arena, izleme sağlar. Bu ayarı kullanarak, larva uzunluk iHala kayıt ve peristaltizm analizine olanak 40 piksel tarafından temsil s. Bir ısı derecesinde 15 larva yörüngeleri örnek bir görüntü Şekil 5A'da verilmiştir. Buna ek olarak, bir makro lens kullanımı birçok iç organlar görünür hale gelir ve baş tanıma ayrıca (Şekil 5B) artırıldı çok yüksek çözünürlüklü görüntü larvaları sağlar. Ayrıca, bu geniş bir aralıkta 20 davranışlarının daha detaylı bir analizi için kullanılabilir. Aynı kurulumu kolay görüntü C tarama için de kullanılabilir elegans solucanlar (Şekil 5C).

figure-results-1
Şekil farklı kameralar için 4. FIM görüntüleme ve izleme sonuçları. Sol (A): 10 fps ile 4 MP kamera kullanılarak çekilen bir 10 cm x 10 cm izleme sahnede tarama üç larva FIM görüntüleme. Orta:Kırpma ve bir tek larva kütle yörünge merkezi. hayvanın alanı gösterilir. Sağ: larva Alan 100 kare üzerinde çizilen. (A) eşdeğer ancak 0.8 MP kamera kullanılarak çekilen kırmızı ok kısaltıldı görüntünün zaman noktasını gösterir. (A) Eşdeğer ama 1.4 MP kamera kullanılarak çekilen (B). (C). (D) Eşdeğer ( A) ama 0.3 MP kamera kullanılarak çekilen. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 5. Isı uyaran ve yüksek çözünürlüklü uygulamalar. (A), ısı uyaran uygulaması (Şekil 1 ile karşılaştırınız). Yörüngeler FI üzerinden hesaplananMTrack. (B) makro lens kullanarak, üçüncü, ikinci ve birinci evre larva Yüksek çözünürlüklü görüntü uygulaması. Üçüncü evre larva uzunluğunda ve 2.5 x 2.5 cm bir görüş alanı 400 pikseller ile temsil edilmektedir. (C) C elegans solucan FIM görüntüleme kullanarak ele geçirdi. Ölçek çubukları gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

Davranışsal nörobilim kantitatif karmaşık davranışsal özellikleri deşifre zorunludur. Bu nedenle, çok sayıda insanın, yüksek çözünürlükte görülen ve otomatik gereken işlemler istatistiksel analiz için ihtiyaç vardır. Burada, FIM görüntüleme, hayvanların geniş bir hareketlilik izlemek için araçlar temin eden bir yeni, basit ve sağlam bir görüntü kurulumu tarif edilmektedir. FIM görüntüleme kurulum etkinliği Drosophila larvaları, planarian flatworms ve C kullanılarak test edilmiştir elegans solucanlar. FIM teknoloji, beyin, trakea, bağırsak veya proventriculus gibi hayvanların bile iç yapılarını tespit etmek özünde yüksek kontrast sağlar. Otomatik hayvan 19 yönünü belirlemek için hizmet edebilir, böylece önemlisi, bu iç yapılar sağlam tanımlanır.

filmlerin kalitesi tarama yüzeyi üzerinde suyun aşırı miktarı ile etkilenebilir. Bu nedenle, çok önemlidiragar nem kontrolü. Yüzeyde Çok eski agar veya çok fazla su eserler neden olabilir. Benzer şekilde, herhangi bir hava kabarcığı tarama yüzey dahil olduğundan emin olun. Genel olarak, iyi hazırlanmış agar yüzeyi 4 saat film kaydı sağlar.

Nedeniyle yatan fiziksel ilkelere FIM görüntüleme mükemmel bir görüntü kalitesi elde, neredeyse gürültü ücretsiz resim kayıtları üretir. Bu da, daha sonra, bilgisayar tabanlı imaj analizi kolaylaştırır ve yüksek verim sağlar. Ancak, bu yöntemin doğrudan agar yüzeyine temas hayvanları analiz sınırlıdır. izleme yazılımı çörek şekli oluşturan hayvanlar tarafından meydan. Ikili gösterge çörek şekli tanır rağmen, yanlış omurga hesaplanır olabilir.

Nedeniyle izleme tablosu ikili ve üçlü renk görüntüleme modüler inşaat ulaşmak olduğunu. Ayrıca, ek uyaranlar (ışık, koku verme maddeleri, elektrik veya mekanik uyarıcılar) kolayca olabilir delYukarıda ivered. FIM görüntüleme gücünü maç için tasarlanmış FIMTrack programı kolayca Drosophila larvaları, C izlemek için kabul edilebilir elegans veya planarya. Böylece nedeniyle onun basit ve ucuz inşaat (http://FIM.uni-muenster.de bakınız), FIM görüntüleme biyomedikal uygulamalarda geniş bir yelpazede için uygun olan ve özellikle acilen yüksek verimli çalışmaları gereklidir sağlar.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok

Teşekkürler

Biz FIM kurulum yapımında yardım için bu projeyi başlattı S. Thomas J. Hermann ve U. Burgbacher müteşekkiriz. Bu çalışma DFG (SFB 629 B6) tarafından finanse edildi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
FIM kurulumuÖzel kurulumların inşası veya satın alınması için detaylar istek üzerine mevcuttur
Akrilik cam plakaÖzel Agar dökme için ek
Isı radyatör plakasıÖzel Ayarlanabilir montaj ile karşılıklı bölgelere perfüze edilebilir alüminyum levha (mat siyah boya)
Su kaloriferi/soğutma pompaları ve hortumlarıÖzel GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) ve Dr Bruno Lange GmBH (Tipik: LTG013) temel alınmıştır
Standart Kamera (4 MP)BasleracA2040-25gmFIM kurulumu için varsayılan olarak kullanılan
kamera Test Kamerası (1.4 MP)Büyütme  1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO)Karşılaştırma için kullanılan kamera
Test Kamerası (0.8 MP)Point GreyDragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS)Karşılaştırma için kullanılan kamera
Test Kamerası (0.3 MP)SonyPS Eye USB2.0 kameraKarşılaştırma için kullanılan kamera
BilgisayarÖzel en az i5 Intel işlemci veya daha iyisi, 16 GB RAM ve yeterli HDD depolama alanı ile donatılmış [>1TB]
Standard Fly foodCustom 
Standart Fly şişeleri 135 mlSarstedt AG& Co, Nü mbrecht, Almanya78.895
Petri kabı 9 cmSarstedt AG& Co, Nü mbrecht, Almanya821,473
Ultra saf deiyonize suMerck Millipore, Darmstadt, AlmanyaSynergy 
NaClCarl Roth GmbH, Karlsruhe, Almanya3957.2
Gıda sınıfı agarAppliChem GmbH, Darmstadt, AlmanyaA0917,5000
Boya fırçası (küçük ve büyük)MilanAquarell 310 Boyut 0 ve 2
PirometreTrotecBP20

Kaynaklar

  1. Maimon, G., Straw, A. D., Dickinson, M. H. A Simple Vision-Based Algorithm for Decision Making in Flying Drosophila. Current Biology. 18 (6), 464-470 (2008).
  2. Frye, M. A., Dickinson, M. H. Closing the loop between neurobiology and flight behavior in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 14 (6), 729-736 (2004).
  3. Fry, S. N. The Aerodynamics of Free-Flight Maneuvers in Drosophila. Science. 300 (5618), 495-498 (2003).
  4. Risse, B., Berh, D., Tao, J., Jiang, X., Klette, R., Klämbt, C. Comparison of two 3D tracking paradigms for freely flying insects. EURASIP Journal on Image and Video Processing. 2013 (1), 57(2013).
  5. Yilmaz, A., Javed, O., Shah, M. Object tracking: A Survey. ACM Computing Surveys. 38 (4), (2006).
  6. Pistori, H., et al. Mice and larvae tracking using a particle filter with an auto-adjustable observation model. Pattern Recognition Letters. 31 (4), 337-346 (2010).
  7. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PloS one. 3 (5), e2208(2008).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature Methods. 9 (3), 290-296 (2012).
  9. Cui, X., et al. Lensless high-resolution on-chip optofluidic microscopes for Caenorhabditis elegans and cell imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10670-10675 (2008).
  10. Heng, X., et al. Optofluidic Microscopy - a Method for Implementing a High Resolution Optical Microscope on a Chip. Lab on a chip. 6 (10), 1274-1276 (2006).
  11. Liu, P., Martin, R. J., Dong, L. Micro-electro-fluidic grids for nematodes: a lens-less, image-sensor-less approach for on-chip tracking of nematode locomotion. Lab on a chip. 13 (4), 650-661 (2013).
  12. Spink, A. J., Tegelenbosch, R. A., Buma, M. O., Noldus, L. P. The EthoVision video tracking system--a tool for behavioral phenotyping of transgenic mice. Physiology. 73 (5), 731-744 (2001).
  13. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  14. Yu, C. -C. J., Raizen, D. M., Fang-Yen, C. Multi-well imaging of development and behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of neuroscience methods. 223, 35-39 (2014).
  15. Wang, S. J., Wang, Z. -W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PloS one. 8 (7), e69653(2013).
  16. Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nature communications. 2, 441(2011).
  17. Kane, E. A., et al. Sensorimotor structure of Drosophila larva phototaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (40), E3868-E3877 (2013).
  18. Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. Journal of Neuroscience. 30 (12), 4261-4272 (2010).
  19. Risse, B., Thomas, S., Otto, N., Löpmeier, T., Valkov, D., Jiang, X., Klämbt, C. FIM, a Novel FTIR-Based Imaging Method for High Throughput Locomotion Analysis. PLoS one. 8 (1), e53963(2013).
  20. Risse, B., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C. Quantifying subtle locomotion phenotypes of Drosophila larvae using internal structures based on FIM images. Comput Biol Med. 14, (2014).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

FIMtrack Yaz l mDrosophila LarvalarEngellenmi Toplam Yans maKontur Takip AlgoritmalarIs Gradyan CihazCSV Veri kt sSonu G r nt leyici Mod lY ksek Kapasiteli Tarama
FIM Görüntüleme ve FIMtrack: Yüksek verim ve Maliyet Etkili Hareket Analizi izin İki Yeni Araçlar
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.