Burada, genetik olarak tasarlanmış farelerin geliştirilmesinde duyusal akson büyüme fenotiplerini değerlendirmek için etkili bir yöntem olarak, tüm hayvanda periferik nosiseptör akson projeksiyonlarının görüntülenmesi için fetal fareleri genotiplemek, boyamak ve hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme
Bu makalede
Özet
Özet
embriyolarda tam uzunlukta nöronal projeksiyonlar görselleştirme nöronal ağlar nasıl geliştiğini memeli bir anlayış kazanmak esastır. Burada yerinde birkaç genetik manipüle fare hatları kullanarak fenotipik özelliklerini değerlendirmek için dorsal kök ganglion (DRG) akson projeksiyonlar bir alt kümesini etiketlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. TrkA pozitif nöronların ağrı sinyallerinin iletimi için özel nosiseptör nöronlar vardır. Biz sağlam fare embriyo tüm TrkA-pozitif çevresel akson yörüngeleri etiketlemek için bir TrkA taulacZ fare hattını kullanmak. Biz daha bağımsız nöronal sağkalım üzerine genetik manipülasyonlar olası etkilerinin büyüme ile ilgili soruları değerlendirmek amacıyla, esasen nöronal apoptoz ortadan kaldıran bir Bax boş bir arka plan üzerine TrkA taulacZ hattını doğurmak. Daha sonra, ilgi genetiği değiştirilmiş fareler TrkA Taul ile yetiştirilenACZ / Bax boş hattı ve daha sonra burada tarif edilen teknikler kullanılarak çalışma için hazırdır. Bu sunum, tüm montaj hazırlanmasında tam uzunlukta aksonal yörüngeleri görünüm için izin diseksiyon, doku hazırlanması, boyama ve temizleme sırasında detaylı fare üreme planları hakkında bilgi, genotiplendirmesi içerir.
Giriş
Kesin nöronal ağların kurulması sinir sisteminin işlevselliği için gerekli karmaşık bir gelişimsel süreçtir. Bu süreçte sorunlar olduğu insan nörolojik hastalıklar 1-3 implike edilmiştir nöronal fonksiyon bozukluğuna yol açar. Memelilerde akson büyümesi ve hedef innervasyon yatan moleküler mekanizmaları incelemek için, iki genetiği değiştirilmiş fare hatları bir arada kullanarak duyusal nöronlar TrkA-ifade aksonal yörüngeleri görselleştirmek için bir protokol geliştirmiştir.
TrkA sinir büyüme faktörü NGF için bir alıcı, ve nosiseptif duyu nöronlarının 4 fonksiyonel bir işaretleyici olarak kullanılabilir. TrkA derece ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Tüm işlemler Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ve Bakımı NIH Kılavuzu ile uyumlu. Hayvan protokolü Weill Cornell Medical College IACUC tarafından onaylanmıştır.
1. Doku Hazırlanması
- Servikal dislokasyon 15 ile zamanlanmış-gebelik kadın Euthanize. Ayrı ayrı soğutulmuş fosfat tamponlu tuz (PBS) ile doldurulmuş bir 6-yuvalı plakasının gözenekleri içinde zamanlanmış hamilelik kadın ve yer embriyolardan E18 embriyoları - embriyonik E16 ayır.
- Soğuk PBS embriyolar durulayın.
- Daha sonra genotipleme için önceden hazırlanmış bir proteinaz K solüsyonunda embriyo ve yer amniyotik zarın küçük bir kısmını ç....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
TrkA ağ / taulacZ genotipleri: Bax - / - ve TrkA taulacZ / taulacZ: Bax - / - embriyolar açıkça standart PCR genotipleme ile tespit edilebilir (Şekil 1). X-gal lekeleme görüntüler geleneksel lekeli embriyolar (Şekiller 2, 3a) 'da deri altından periferik aksonal milleri ayrıntılı ve doku temizleme sonra embriyo boyunca (Şekil 3b, 4).
- / - Hattı nörona özgü Nestin promotör 17 k.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Embriyonik TrkA taulacZ farelerin yukarıda tarif edilen X-gal lekeleme prosedürü sağlam, sabit embriyo uzun mesafe akson çıkıntıların hızlı ve ayrıntılı olarak gösterebilir. Bu fareler akson büyümesi ve nöronal hayatta hem de katkıda bulunabilir mekanizmalar sinyal tarama izin Bax boş arka plan Çünkü. Ilgi transgenik veya nakavt fareler ile çiftleşme aksonal fenotip kapsamlı değerlendirilmesi için izin verir ve daha detaylı bir şekilde akson büyüme sinyalini incelemek için gelecek deneyler i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden çıkarların olmadığını beyan eder.
Teşekkürler
Yazarlar anlayışlı tartışma ve önerileriniz için TrkA taulacZ fareler Dr. Annette Markus Dr. Louis Reichardt teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Burke Vakfı yanı sıra Whitehall Vakfı araştırma bursu 2010-08-61, Yaşam Vakfı (WFL-ABD-028/14) için Wings bir araştırma hibe başlangıç fonları tarafından desteklenen, gelen ZB1-1102-1 hibe Christopher & Dana Reeve Vakfı, ve JZ Ulusal Göz Enstitüsü hibe 1R01EY022409 ve 3R01EY022409-01S1. KJO bir Goldsmith üyesidir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| PFA | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| PBS | Life Tech | 10010-023 | |
| Doku Durulama Solüsyonu A | Millipore | BG-6-B | |
| Doku Durulama Solüsyonu B | Millipore | BG-7-B | |
| Doku Leke Baz Solüsyonu | Millipore | BG-8-C | |
| X-gal | Sigma-Aldrich | B4252 | |
| Cam sintiallasyon şişesi | Kimble Chase | 74500-20 | |
| İnkübatör | Labline | Model 120 | |
| Böcek pimleri | FST | 26000-30 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 6 kuyulu çanak | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Primerler | IDT | özel DNA primerleri | |
| Takara dNTP karışımı | Takara | 4030 | |
| Takara LA tamponu | Takara | RR002A | |
| Takara LA Taq | Takara | RR002A | |
| PCR makinesi | Bio-Rad | DNA Motor Dyad | |
| Benzil alkol | Sigma-Aldrich | B-1042 | |
| Benzil benzoat | Sigma-Aldrich | B-6630 | |
| Diseksiyon mikroskobu | Leica | M205A | |
| Kamera | Leica | DFC310FX | |
| Halka ışık | Leica | MEB110 | |
| Photoshop | Adobe | Photoshop 4.0 |
Kaynaklar
- Verze, L., et al. Cutaneous innervation in hereditary sensory and autonomic neuropathy type IV. Neurology. 55, 126-128 (2000).
- Sethna, N. F., Meier, P. M., Zurakowski, D., Berde, C. B. Cutaneous sensory abnormalities in children and adolescents wi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
