Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fenotiplendirme Fare Solunum Fonksiyon İn Vivo Akciğer Yayıcı Kapasite

10.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52216

⸱

6 Ocak 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental Health Sciences, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2Department of International Health, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 3Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Farelerde akciğer yayılma kapasitesini hızlı ve basit bir şekilde ölçmenin bir yolunu tarif ediyoruz ve bunun birden fazla yaygın akciğer patolojisindeki fenotip değişikliklerine yeterince duyarlı olduğunu gösteriyoruz. Bu nedenle bu metrik, fare modellerine doğrudan öteleme ilgisi getirir, çünkü yayılma kapasitesi insanlarda da kolayca ölçülür.

Özet

Fare hemen akciğer hastalıklarının çeşitli modellemek için kullanılan birincil bir hayvandır. Bu tür patolojiler altında yatan mekanizmaları incelemek için, fenotipik yöntemler patolojik değişiklikler ölçmek ki ihtiyaç vardır. Bundan başka, fare modelleri ile translasyon uygunluğu sağlamak için, bu ölçümlerin kolaylıkla hem insanlarda hem farelerde yapılabilir testler olmalıdır. Ne yazık ki, bu literatürde akciğer fonksiyonunun birkaç fenotipik ölçümleri insanlara doğrudan uygulama var. Tek istisna rutin insanlarda yapılan bir ölçüm olan karbon monoksit için difüzyon kapasitesi. Bu yazıda, hızlı ve basit farelerde bu difüzyon kapasitesini ölçmek için bir araç açıklar. Prosedür 1 dk gazı analizi zaman izlediği bir anestezi fare izleyici gazları ile kısa akciğer enflasyon, içerir. Bu amfizem, fibroz, akut akciğer yaralanması ve influenza da dahil olmak üzere pek çok akciğer hastalıkları, tespit etmek için bu yöntem yeteneğini test ettikmantar enfeksiyonları akciğer, yanı sıra genç yavrular izleme akciğer olgunlaşmasının. Sonuçlar önemli tüm akciğer patolojileri düşüşler yanı sıra, akciğer olgunlaşması ile difüzyon kapasitesinde bir artış göstermektedir. Akciğer difüzyon kapasitesi Bu ölçüm, böylece mevcut patolojik akciğer modellerinin çoğu ile fenotipik yapısal değişiklikleri tespit yeteneği ile geniş bir uygulama olan solunum fonksiyon testi sağlar.

Giriş

Fare hemen akciğer hastalıklarının çeşitli modellemek için kullanılan birincil bir hayvandır. Bu tür patolojiler altında yatan mekanizmaları incelemek için, fenotipik yöntemler bunu patolojik değişiklikler ölçmek ki ihtiyaç vardır. Havalandırma mekaniği ölçülür birçok fare çalışma olmasına rağmen, bu ölçümlerin genelde normal insanlarda yapılan akciğer fonksiyonunun standart değerlendirmelere ilgisiz. Bu insan hastalığı için fare modellerinde sonuçların çeviri kolaylaştırabilir fareler ve insan deneklerde eşdeğer ölçümleri gerçekleştirmek için yeteneği beri, talihsiz bir durumdur.

Insan deneklerde en yaygın ve en kolay yapılan ölçümlerin bir karbon monoksit (DLCO) 1,2 difüzyon kapasitesi olduğunu, ancak bu ölçüm sadece nadiren fare modellerinde yapılmıştır. Prosedürler genellikle hantal veya req olabilir çünkü 3-7 bildirilmiştir bu çalışmalarda, kısmen, hiçbir izlem çalışmaları olmuşturkarmaşık bir ekipmana uire. Başka bir yaklaşım bilinçli farelerde CO difüzyon ölçümü mümkün olmanın avantajına sahip bir sabit devlet sisteminde, bir CO, yeniden soluk yöntemi kullanmaktır. Ancak bu yöntem çok hantal ve sonuçları farenin havalandırma düzeyi yanı sıra O 2 ve CO 2 konsantrasyonları 8,9 ile değişebilir. Bu zorluklar onun çeşitli avantajlara rağmen, farelerde akciğer patolojileri tespit etmek difüzyon kapasitesi rutin kullanımını engellemiştir gibi görünüyor.

Farelerde difüzyon kapasitesi ölçümü ile ilgili sorunları aşmak için, basit araçlarla ayrıntıları farelerde ölçmek için son 10 bildirilmiştir. prosedür hızlı bir şekilde tüm ilham gaza eşit bir hacim örnekleyerek kirlenmemiş alveol gaz örnekleme zor sorunu ortadan kaldırır. Bir çok tekrarlanabilir ölçüm Bu prosedür sonuçları, pa bir dizi duyarlı karbon monoksit (DFCO), difüzyon faktörü olarak adlandırılanAkciğer fenotipinde thologic değişir. (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), c ve 9 indisler enjekte kalibrasyon gazların yoğunlaşması ve 9 sn nefes tutma süresinden sonra kaldırıldı gazlara bakın - DFCO böylece 1 olarak hesaplanır sırasıyla. DFCO 1 tüm CO tam alımını yansıtan ve 0 CO hiçbir alımını yansıtan, 0 ve 1 arasında değişen bir boyutsuz değişken vardır.

Bu sunumda bu difüzyon kapasitesi ölçümü yapmak için nasıl göstermek ve neredeyse tüm amfizem, fibrozis, akut akciğer hasarı, ve viral ve mantar enfeksiyonları dahil olmak üzere mevcut fare akciğer hastalığı modellerinin değişiklikleri belgelemek için nasıl kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Tüm hayvan protokolleri Johns Hopkins Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. Hayvan hazırlanması

  1. Aşağıdaki adımda 2.3 belirtildiği gibi ketamin ve xylazin ile anestezi yoluyla, DFCO ölçümü için 6 C57BL / 6 fareler kontrol hazırlayın.
  2. Kontroller için olanla aynı yöntem kullanılarak, Tablo 1 'de gösterilen farklı akciğer patolojisi olan diğer tüm fareler hazırlayın. Bu modellerin her biri kurmak için gerekli belirli detaylar ilgili referanslar bulunmaktadır. Kontrol fareleri ve diğer patolojik kohortlarda bu çağın tüm 6-12 haftadır.

Karbon monoksit için Difüzyon Faktörü 2. ölçümü (DFCO)

  1. Azot, oksijen, neon, ve karbon monoksit için zirveleri ölçmek için makine ile birlikte verilen gaz kromatografisi modülünü kurmak. Bu uygulama için sadece neon ve CO veri.
    NOT: Bu cihaz bir moleküler s kullanırBir 12.00 mikron film 320.00 mikron kimliği ve 10 metre uzunluğunda taşıyıcı gaz olarak helyum ile ieve sütunu. kromatografi kolonu 0.8 ml bir hacme sahiptir, fakat örnek ile bağlantı boruları yeterli temizleme sağlamak için 2 ml kullanıldı.
  2. Her deney gününde başlangıcında, küçük farelerden gelen numuneler ölçümleri yapmadan önce, yaklaşık olarak% 0.5 Ne,% 0.5 CO ihtiva eden bir gaz karışımı, torbadan doğrudan 2 ml lik bir numuneyi almak ve hava denge ve kalibre etmek için bu örneği kullanmak Gaz kromatografisi.
  3. Ketamin (90 mg / kg) ve ksilazin (15 mg / kg) ile fareler anestezi ve refleks hareketinin olmaması ile anestezi teyit etmektedir. Kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem sürün. (Çok genç farelerde erişkinlerde 18 G veya 20 G) bir taslaktır iğne kanül ile fareler Tracheostomize.
    NOT: DFCO anestezi sonrası en az 10 dakika tamamlandı ve herhangi bir mekanik havalandırma veya diğer prosedürler öncesinde olduğu.
  4. 6 haftalıkken daha büyük farelerde, bir 3 ml'lik bir enjektör t kullanımıo gaz karışımı çantasından gaz 0,8 ml çekilme. Trakeal kanül için şırınga bağlayın ve hızlı bir şekilde akciğer şişirmek. Bir metronom kullanarak, 9 sn saymak, ve sonra hızlı bir şekilde 0.8 ml (üfledi hava) çekilme.
  5. Bu geri 0.8 mi oda havası ile 2 ml kadar nefes vermeyle oluşan seyreltin, en az 15 saniye boyunca dinlenmeye bırakın. Sonra analiz için gaz kromatografisinde içine bütün örnek enjekte.
  6. Bu ilk DFCO örneği analiz birlikte, gaz karışımı, torba, ikinci bir 0.8 ml fare akciğer şişirmek ve ilk örneğe benzer bu örnek işlem. İki DFCO ölçümleri ortalama.
    Not: 0.8 ml hacmi çok küçük farelerin akciğerlerinde ölçümler yapmak için çok büyük olduğu için 2 haftalık olarak genç farelerde ölçümleri için, 0.4 ml bir hacim kullanılır. Bu 6 hafta daha yaşlı fareler için 0.8 ml hacmi kullanmak daha iyidir, ve 0.4 ml hacim bazı fareler için gerekli ise, bu çalışılan kohort tüm fareler için sürekli kullanılması gerektiğini söyledi.
  7. DFCO hesaplayın(CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), c ve 9 indisler enjekte kalibrasyon gazları konsantrasyonları sırasıyla, 9 saniye nefes tutma süresinden sonra kaldırıldı gazlara bakın - 1 olarak.
  8. Analiz ve tek yönlü ANOVA ile farklılıkları karşılaştırmak ve tüm kohort farelerde çoklu karşılaştırmalar için Tukey düzeltme ile anlamlılık düzeyini değerlendirmek. P <0.05 anlamlı olarak değerini düşünün.
    NOT: Burada kullanılan farelerin tamamı burada rapor değil akciğer ventilasyonu, mekanik, akciğer lavaj veya histoloji birkaç sonraki ölçümleri içeren deneysel çalışmaların bir parçası idi. Yöntem, kontrol fareleri, yukarıda yapıldığı gibi her deneysel modellerde aynı olduğu için buna ek olarak, çeşitli patolojik modellerden sadece sonuçlar sunulmaktadır. Bu modellerde daha fazla bilgi ek tabloda yer almaktadır.
  9. Derin anesthe tarafından hayvanları Euthanizetic aşırı doz servikal dislokasyon veya başları kesilerek izledi. Gerekli yerlerde, daha fazla biyolojik veya histolojik işleme ve analiz için ölü farelerin akciğer hücreleri ve / veya dokuları kaldırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1, var Aspergillus ve influenza enfeksiyonu hem önemli düşüşler, hem de fibrotik amfizematöz önemli düşüş vardı ve akut grupları A, B, C, D, E ve F yetişkin farelerden DFCO ölçümlerini göstermektedir Akciğer hasarı modelleri. Şekil 2 2-6 hafta fareler yaş olarak zamanla DFCO'da G Grubu gelişimsel değişiklikleri gösterir. Bu sefer boyunca akciğer gelişimi ile hafif fakat anlamlı bir artış vardı. küçük bir enflasyon hacmi kullanılarak etkisi de 6 haftalık bir zaman noktasında oldukç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, biz fare akciğer gaz alışverişi yeteneğini ölçmek için yeni bir metrik tanımladı. Bu metrik difüzyon kapasitesi, yani, akciğer birincil işlevi ölçen bir genel klinik ölçüm, gaz alışverişi yeteneği benzerdir. difüzyon kapasitesi kolayca ve hızlı bir şekilde fareler ve insanlar hem de yapılabilir ancak akciğer fonksiyonel bir ölçüdür. Farelerde akciğer hastalığı tespiti için önemli bir hedef kontrol ve deney kohort arasında akciğer fonksiyon değişiklikleri ölçmek için. Bu amaca ulaşmak için, tanımlanmış ve a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Ilgi ve hiçbir şey yok çatışmalar ifşa.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH HL-10342 tarafından desteklenmiştir

.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Gaz KromatografıInficonMicro GC Model 3000AAgilent karşılaştırılabilir bir model yapar
18 G Luer saplama iğnesiBecton DickensonDiğer birkaç olası satıcı
3 ml plastik şırıngaBecton DickensonDiğer birkaç olası satıcı
Polipropilen gaz numune torbalarıSKC1 veya 2 L kapasite iyi çalışıyorDiğer gaz geçirmez çantalar iyi çalışacaktır
Gaz tankı, %0,3 Ne, %0,3 CO, denge havası; (boyut ME)Airgas, IncZ04 NI785ME3012DLCO için kullanılan standart
karışımdır.
Domuz pankreas elastazıElastin Ürünleri, Owensville, MO5.4 U
BleomisinAPP İlaçları, Schaumburg, IL0.25 U
Escherichia coli< / em> LPSSigma L28803 & mu; g/g vücut ağırlığı; O55:B5
Aspergillus fumigatus (izolat Af293) conidia, patates dekstroz agar üzerinde yetiştirilen olgun kolonilerden toplanmıştır.
Bu, fosfat tamponlu salin içinde seyreltilmiş insanlarda 25 TCID50 / influenza virüsü A / PR8 faresinde

Kaynaklar

  1. Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
  2. Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
  3. Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
  4. Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
  5. Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
  6. Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
  7. Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
  8. Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
  9. Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
  10. Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
  11. Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
  12. Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
  13. Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
  14. Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299(2012).
  15. Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
  16. Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
  17. Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Gaz Kromatografı AnaliziKarbonmonoksit AlımıNeon İzleyici GazAnestezize Fare EnflasyonuAmfizem Fibrozis TespitiAkciğer Olgunlaşma ÖlçümüPulmoner Fonksiyon TestiSolunum Yolu Hastalığı Modelleri
Fenotiplendirme Fare Solunum Fonksiyon İn Vivo Akciğer Yayıcı Kapasite
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.