Yöntem makalesi

Plazmid vektörler oluşturulması Gibson tertibatı kullanılarak insan uzama faktör-1α bir promotörün regülasyonu altında FLAG-etiketli Proteinlerinin İfade

DOI:

10.3791/52235

⸱

9 Şubat 2015

 , 
1Department of Cell Biology and Biochemistry, Texas Tech University Health Sciences Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Özel plazmitlerin sentezi emek ve zaman alıcıdır. Bu protokol, özel DNA klonlama prosedürünün işini ve süresini azaltmak için Gibson montaj klonlamasının kullanımını açıklar. Açıklanan protokol ayrıca, geleneksel kes ve yapıştır DNA klonlamasına benzer maliyetle memeli ekspresyonu için güvenilir etiketli protein yapıları üretir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gibson tertibatı (GA) klonlanması, geleneksel DNA klonlama yöntemleri için hızlı, güvenilir ve esnek bir alternatif sunmaktadır. Bu fare embriyonik kök hücreleri eksojen genin (mESCs) ekspresyonu için özel plazmitleri yaratmak için GA kullanılır. SV40 ya da insan sitomegalovirüs promotörlerin kontrolü altında ekzojen genlerin sentezlenmesi mESCs içine transfeksiyonundan sonra hızlı bir şekilde azalır. Bu azalmış ifadesi için bir çare gen sentezlenmesini tahrik etmek için, insan uzama faktör-1 alfa (hEF1α) promoteri kullanmaktır. HEF1α içeren plazmid vektörleri, SV40-veya CMV ihtiva eden plasmidler, özellikle de ihtiva eden N-terminali 3xFLAG etiketleri gibi yaygın olarak mevcut değildir. Burada açıklanan protokol hEF1α promotörünün anlatım regülasyonu altında FLAG etiketli CstF-64 ve CstF-64 mutantı ifade plazmitleri oluşturmak için hızlı bir yöntemdir. GA mümkün DNA fragmanlarının uçları üst üste bir klonlama için bir DNA ekzonükleaz, DNA polimerazı ve DNA ligazı bir karışımını kullanır.Biz mevcut vardı şablon DNA'lar dayanarak, bizim yapıları tek bir dizisi içine monte edilecek şekilde tasarlanmıştır. Tasarım, dört DNA parçaları kullanılır: pcDNA 3.1 vektör omurga hEF1α yükseltici bölüm 1 (a çift kollu sentetik DNA fragmanı olarak satın 3xFLAG-etiketi ihtiva), ve her iki CstF-64 ya da belirli CstF-64 mutant hEF1α yükseltici bölüm 2. Bu fragmanların dizileri, DNA fragmanlarının üretilmesi için uygun PCR primerlerinin tasarlanması için bir primer üretim aracına aktarılmıştır. PCR'den sonra DNA fragmanları, seçici işareti ve GA klonlama reaksiyonu ihtiva eden vektör toplandı ile karıştırılmıştır. Bağımsız dönüştürülmüş bakteri kolonilerinden gelen plasmidler izole edildi. Plazmidler başlangıç ​​ekran sekanslama ile, sınırlama sindirimi ile yapıldı. Sonuç olarak, GA bize ekranları ve doğrulama yapı dahil olmak üzere, 5 gün içinde gen ifadesi için özel plazmitleri yaratmak için izin verdi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel DNA klonlama prosedürleri birlikte, DNA parçalarını birleştirmek üzere, DNA ve DNA ligazı bölmek için kısıtlama enzimlerinin kullanımına dayanmaktadır. Farklı DNA fragmanlarını ihtiva eden özel sentezleme konstruktlarının Üretimi birine ve / veya birden fazla sınırlama endonükleazları ve ligasyon yoluyla DNA parçalarının daha sonra yerleştirilmesi ile DNA bölünmesini içeren sıralı bir işlemdir. Bu işlemin önemli bir dezavantajı imkansız ilgi tam-boy proteinin başarılı DNA klonlama oluşturma (yani, birden fazla bölme sitesi olabilir) DNA fragmanlarının biri için uygun kısıtlama enzimleri tespit etmek zor olabilir olmasıdır. Bu nedenle, özel ifade üretimi özel protein etiketleri ile etkin hücre tipine özgü promoterlerin transkripsiyonel regülasyonu altında yapıları dikkatli bir tasarım gerektirmektedir. Aynı zamanda bir zaman ve emek harcayan bir tekniktir. Son zamanlarda, birçok rapor MULTIP monte yöntemleri tarifsınırlama kullanılmadan bir ya da iki aşamalı reaksiyonla ya da aynı anda sürekli bir dizi le farklı sentetik DNA fragmanları 1-3 enzimleri. tek-aşamalı bir klonlama reaksiyonu (tüm hazırlık adımları hariç), bir DNA ekzonükleaz, DNA polimerazı, DNA ligaz, 2,3 ve DNA parçalarının bir üst üste binen uçları, (Şekil 1) 'in bir karışımı kullanımına bağlıdır. Kısıtlama enzimleri hiçbir kullanımı olduğu için, herhangi bir boyut ve (Tekrarlanan dizileri hariç) sekansı bileşimin DNA fragmanları bir kesintisiz bir yapı içinde birbirine birleştirilebilir. Son zamanlarda, bir ticari kit (Gibson montaj, GA) bir adım klonlama reaksiyonlar için kullanılabilir hale geldi. Bu kit, özel promoterler ve protein etiketleri ile tek bir vektörde herhangi bir DNA fragmanlarının hızlı ve ekonomik bir montaj sağlar.

Memeli hücre kültürü modelleri ekzojen proteinleri ifade etmek için kullanılan geniş çapta plazmid ifade vektörleri kopyalama reg altında genelliklevirüs, sitomegalovirüs (CMV) ya da Simian virüsü 40 (SV40) promoterlerin modülasyon. Bunlar, viral promoterler, memeli hücre kültürü göre büyük bir çoğunluğunda ekzojen proteinlerin sağlam geçici ifadesini sağlar. Bununla birlikte, kararlı bir şekilde ekzojen proteinleri eksprese eden hücre çizgilerinin üretimi için kuruluş süreci boyunca 4,5 'CMV veya SV40 promoterleri transkripsiyonel susturulması genellikle başarısız olur. Buna ek olarak, SV40, CMV ve viral promoterler yeterince lenfoid veya embriyonik kök hücreler, 6,7 hücreler ekzojen proteinlerin ifadesini teşvik edecektir. Viral promoterler doğasında sınırlama çözelti güçlü yapısal olmayan viral promoterlerin 8-10 kullanmaktır. Insan kökenli bir iyi karakterize edilmiş güçlü yapısal olmayan viral promoteri (hEF1α ribozom 11 aminoasil-tRNA GTP-bağlı esas nin kataliz işlemine dahil olan) uzama faktörü 1α (hEF1α) promotörüdür. Bununla birlikte,hEF1α promoterini ihtiva eden ifade vektörleri, özellikle olanlar da ilgilenilen proteinin amino terminal ucunda 3 x FLAG ihtiva eden plasmidler ihtiva eden viral promoter olarak yaygın olarak mevcut değildir.

64,000 MA bölünme uyarım faktör proteini (CstF-64) replikasyon bağlı histon mRNA 14,15 dahil olmak üzere en mRNA 12,13, 3 'ucu işleme katılır. CstF-64 somatik dokulardaki 12 olarak ifade edilir. Onun RNA tanıma motifi bölünme ve poliadenilasyon sitesi 16 aşağısında doğmakta transkript üzerinde GU-zengin RNA dizileri bağlanır. CstF-64 ön-mRNA'nın bağlanması, bu yeni oluşan transkriptin etkili endonükleolitik bölünmesini teşvik eder.

Burada, bir protokol DNA fragmanlarının PCR amplifikasyonu kullandığı açıklanmaktadır, (kimyasal olarak kompetan bakteriyel hücreleri içerir) Gibson düzeneği klonlama kiti 3xFLAG-etiketli m özel vektörler oluşturmakOuse CstF-64 ya da mutant CstF-64 hEF1α promotör 1 ifadesi altında, amino terminal ucuna.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çakışan primerlerin Silico Plasmidinin Tasarım ve Üretimi 1.

NOT: Bu aşamanın amacı, yapının tam nükleotid dizisini bir araya getirmek ve primerler, GA klonlama için uçlar üst üste gelen parçaları üretmek için kullanılmak üzere dizayn etmektir.

  1. Nihai plazmid temsil etmek sürekli bir nükleotid dizisi tasarlayın.
  2. Elde edilir ve PCR'de şablonlar olarak kullanılacak gerçek plazmidler ve DNA fragmanlarının listeler.
    Not: hali hazırda mevcut değildir DNA fragmanları, örneğin - etiketleri ve promoterler farklı kombinasyonu gibi - bir tek ya da birden fazla sentetik çift sicimli DNA fragmanları (sDNA) sipariş edilebilir. Bu fragmanlar, nispeten düşük maliyetle ticari olarak temin edilebilmektedir ve uzunluğu 2 kb (Malzeme Tablo) kadar olabilir.
  3. PCR için uygun bir DNA fragmanları içine adım 1.1 monte yapının sürekli nükleotid sekansı bölün. Teyitfragmanları mevcut plazmidler ve sDNA parçalarını eşleştirmek m. DNA nt 200'den küçük fragmanları kaçının.
  4. Astar nesil araç giriş (Ekipman Tablo bakınız). "Set Tercihler" menüsünü seçin. "Değişim Gibson Meclisi Ayarları" pop-up pencerede "DEĞİŞTİR PREFS" sekmesine tıklayarak gerekli ayarları seçin.
    NOT: Astar tasarımı da astar nesil aracı kullanılmadan yapılabilir. Ancak, primer nesil aracın kullanımı sürecini kolaylaştırır.
  5. "Construct kurmak" menüsünü seçerek yapı oluşturmaya başlayabilirsiniz. Sonunda '3' 5 ila astar üretme aracı sırayla split DNA parçalarını yerleştirin.
    Not: bir plazmid omurgası olarak kullanılan bir DNA fragmanı, uygun bir iki parçaya ayrılabilir. Nihai PCR ürünü, geçen parçasının sonuna 5 'ilk parçası ve 3' ucuna bir sürekli DN birbirine bağlanmıştırVektör omurgası temsil eden bir fragmanı.
  6. "Vektör veya Ekle Fragment Enter" pop-up penceresi içine FASTA formatında vektör DNA (nükleotid dizisinin bir metin tabanlı gösterimi) 5 'ucunu temsil eden ilk DNA fragmanını yapıştırın. DNA parçasını adı. Ya PCR, RE Digest veya Synthesis gibi, DNA fragmanını elde etmek için uygun bir yol seçin. "DEVAM" sekmesine tıklayın.
  7. "Meclise bir ekleme parçası Ekle" penceresinde verilen "İleri veya Rev astar boşluk" boşluk kullanın nihai yapının kavşakta ekstra nükleotidleri / kısıtlama siteleri eklemek için bir ihtiyaç varsa. Her iki fragmanın tek bir DNA fragmanlarının olup ekstra nükleotidlerini / kısıtlama siteleri ekleyin. "YAPILDI" sekmesine tıklayın.
  8. Yapı tamamlanana kadar parçalarının tümü için tekrarlayın. "Görünüm Astarlar" menüsünü seçin ve astar dizileri gözden geçirin.
  9. (Vektör b Tüm yapıları için tekrarlayınackbones ve ek), ya da farklı olan DNA fragmanları.

Sıcak Başlangıç ​​Redaksiyon DNA Polimeraz kullanarak PCR ile DNA parçalarının 2. Amplifikasyon (2x Master Mix)

NOT: Bu adım amacı PCR kullanılarak montaj reaksiyonu için yeterli bir DNA elde etmektir.

  1. Tuzsuzlaştınlmış ve ürün olarak bir önceki basamakta ve mümkün olan en küçük ölçekte tasarlanmış PCR primerlerini al. Su ya da TE içinde 10 uM (10 mM Tris-HCI, pH 7.9, 1 mM EDTA) ile seyreltilmesi.
  2. SDNA fragmanları olarak kolaylıkla temin edilebilir değildir DNA fragmanlarının al.
  3. Su içinde 1 ng / ul PCR reaksiyonlarında şablon olarak kullanılacak olan sDNA fragmanları da dahil olmak üzere bütün DNA fragmanları seyreltin.
  4. Oda sıcaklığında PCR reaksiyonları bir araya getirin. Kısaca, bir primer çifti karşılık gelen her bir primer model DNA fragmanının, 1 ul (1 ng / ml stok çözelti), 25 μ (10 uM bir stok çözeltiden), 2.5 ul kullanınSıcak başlangıç ​​redaksiyon DNA polimeraz ve 19 ul su (;, 2x ana karışımı DNA pol Malzemelerin Tablo bakınız). Nazik titreşmesinde ile tüp karıştırın ve kısa santrifüj sıvı damlacıkları toplayın.
  5. DNA pol için önerileri doğrultusunda benzer büyüklükte ayrı tüpler DNA parçalarının aynı anda yükseltin. 28 PCR döngüleri veya yeterli DNA verimi üreten döngü sayısını belirlemek - 25 gerçekleştirin.
  6. Etidiyum bromür (0.2 ug / ml nihai konsantrasyon) ile boyanmış, standart agaroz jel elektroforezi üzerinde PCR reaksiyon hacmi (5 ul),% 10 çalıştırın. PCR ürünü temsil eden tek bir DNA bant görünür olduğundan emin olun. DNA moleküler ağırlık standartları kullanılarak DNA parçalarının boyut ve nispi miktarını belirlemek. Gerekirse, DNA fragmanlarının yeterli miktarda elde etmek üzere PCR tekrarlayın.

PCR ürünlerinin 3. DpnI sindirimi

NOT: Bu adımın amacı dige içinBaraj + bakteri türleri yetiştirilen DNA plazmid ortaya çıktığı gibi, örneğin metile yalnızca DpnI plazmid DNA sindirir Bölüm 2'de PCR'den gelen st bakiye plazmid-DNA şablonu. Plazmid DNA, GA reaksiyonunda bir DNA fragmanı olarak kullanılacak, bu nedenle, DpnI ile tedavi yoktur.

  1. 1 saat süre ile 37 ° C 'de Bölüm 2. inkübe üretilen PCR ürünlerinin 45 ul DpnI kısıtlama enzimi 2 ul ekle. Gerekli olana kadar -20 ° C 'de Bölüm 4 ya da dondurularak devam edin.

DNA Saflaştırma Manyetik boncuklar üzerinde 4. saflaştırma ve DNA Fragments konsantre

NOT: Bu adımın amacı arındırmak ve Bölüm 2 ve 3. Diğer PCR saflaştırma yöntemleri de elde edilen PCR ürünleri de kullanılabilmektedir konsantre etmektir.

  1. Oda sıcaklığına DNA saflaştırma manyetik boncuklar dengelenmesi. Kısa vorteks boncuk yeniden askıya.
  2. PCR önceden sindirilmiş wi aktarma1.5 ml tüpler th DpnI ve her tüpe DNA saflaştırma manyetik boncuk 81 ul ekle. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı.
  3. Yaklaşık 2 dakika süre ile manyetik toplayıcı şok yerleştirin. Bir pipet kullanarak berrak bir sıvı atın. 30 saniye için% 80 etanol içinde 200 ul iki kez yıkayın.
  4. Pelet kurumasını bekleyin. Manyetik kolektör üzerinde konumlandırılmış tüpler, açık tüplerin kapağı tutun.
  5. Yeniden askıya 10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 10 ul kuru boncuk. 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Tüplerin altındaki sıvı toplamak için kısa bir süre için Spin.
  6. 2 dakika süreyle manyetik kollektör üzerinde tüpler yerleştirin. Berrak bir çözelti 10 ul ve yeni önceden etiketlenmiş tüp içine koyun - 8.5 çıkarın. UV spektroskopi ile DNA parçalarının konsantrasyonunu belirlemek (Ekipman Tablo bakınız).

E. Ürünlerin 5. Meclis Klonlama Reaksiyonu ve Dönüşüm coli

NOT: ekin 1 oranı: vektör ve montaj reaksiyonu gerçekleştirmek bu adımı objektif 3 hesaplamak için.

  1. Seçici işaretleyici taşıyan vektör omurgası ya da DNA fragmanını temsil eden DNA fragmanının en az 100 ng kullanın. Insert olarak kullanılacak DNA parçaları için 3 kat molar fazlalığı hesaplayın.
  2. Her bir ekin gerekli ng molar fazlalık dönüştürün.
    NOT: hesaplamalar yapmak için uygun bir yol (Ekipman bkz: İçindekiler) web-tabanlı bir uygulamayı kullanmak için.
  3. Bir PCR tüpü içinde DNA fragmanlarının hesaplanan miktarda karıştırıp 10 ul göre ayarlayın. GA ana karışımı 10 ul ekleyin (2x, Malzeme Tablo). 6 fragmanları ya da bir PCR termal döngü 2-3 parçalarının montajı için 15 dakika - 4 montajı için 1 saat süre ile 50 ° C 'de reaksiyon inkübe edin.
  4. Yetkili E. montaj ürünün dönüşümü ile devam edin coli -20 ürünlerini dondurmak veya° C, ihtiyaç kadar.
  5. Kimyasal veya elektro yetkili hücreleri eşlik dönüşüm prosedürü uygulayın. Çoğunlukla, dönüşüm reaksiyon başına montaj reaksiyon 2 ul kullanın.
  6. Dönüşüm tamamlandıktan sonra, uygun bir seçici antibiyotik ile takviye agar plakaları üzerinde dönüştürülmüş hücreler yayıldı.

6. Plazmid izolasyonu, kısıtlayıcı enzim dijestiyonu ve Dizi

NOT: Bu aşamanın amacı, E. plazmid DNA izole etmektir coli, sonra kısıtlama sindirim ve dizileme ile yapı doğrulamak için.

  1. Mini preps ve plazmid izolasyonu için birkaç tek koloniler yayma. Kullanım 2-5 ml gecede LB sıvı kültür uygun antibiyotik ile desteklenmiş. Kullanılan miniprep kiti açıklanan prosedür takip edilerek karşılık gelen plasmidler izole edin.
  2. Spectro kullanılarak elde edilen miktar ve Plazmidlerin konsantrasyonunu belirlemekfotometre.
  3. Bir ya da bir kaç sınırlama endonükleazı saflaştırılmış plazmid ± 0.5 ug ile sınırlama sindirimi yapın. DNA yapıları için sindirim karakteristiğinin farklı bir model temin kısıtlama enzimleri kullanın.
  4. Belirli bir ya da standart primerler kullanılarak DNA dizilemesi ile DNA klonlama başarısını kontrol edin. Doğruluk için sıralama verilerini analiz.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izledi protokolün bir iş akışı Şekil 2A'da gösterilmiştir. Biz CstF-64 ve hEF1α promotör (Şekil 2B ve Şekil 3) ve anlatım düzenleme altında 3xFLAG-etiketi kaynaşmış mutant CstF-64 proteinleri klonlamak istedi. 3xFLAG-etiketi ardından bir plazmid içeren hEF1α bizim için mevcut değildi. Bununla birlikte, aşağıdaki plasmidler elde edilmiştir: pcDNA 3.1 myc-His (A; Michaela Jansen cömert bir hediye), hEF1α içeren plazmid (Mladen Yovchev cömert bir hediye) ve fare CstF-64 plazmidleri 12 (Şekil 3). yapı (lar) için tüm dizisi nükleotid ve metin düzenleme uygulamalarını (; Ekipman Tabloya bakınız Şekil 3) kullanılarak toplandı. Daha sonra, dizi (ler), plazmid DNA'lar karşılık gelen Dört uygun parçaları (Şekil 2B, kırmızı blokları ve Şekil 3) bölündü. Amplifikasyon pnt 25 minimal örtüşme ile 6 parçalarının "Değişim Gibson Meclisi Ayarları" pop-up penceresi kurmak - rimers 4 kısıtlamaları ile astar nesil aracı (Ekipman Tabloya bakınız) kullanılarak dizayn edilmiştir. Nhel ve Notl kısıtlama bölgeleri doğru monte plazmidleri belirlenmesi amacıyla Primer tasarımı dahil edilmiştir. Nhel sitesi pcDNA 3.1 ve hEF1α promotörünün 5 'ucu arasında primer dizisinin yer almaktadır. NotI sitesi stop kodonu CstF-64 ve pcDNA 3.1 vektör omurgası (UGA) sonra yer alır. HEF1α promoteri, 3xFLAG ve CstF-64 veya mutant oluşan her iki enzim de DNA parçası ile aynı anda sindirimi üzerine CstF-64 (bkz Şekil 2B) serbest bırakılır. Astarlar mümkün olan en küçük ölçekte sipariş ve tuzdan arındırılmıştır. 3xFLAG etiket DNA fragmanını içeren hEF1α promotörün ikinci kısmı (490 bp, Şekil 2B, Şekil 3), tek bir sDNA fragmanı (ler olarak satın alındıMalzemelerin ee Tablosu). Montaj reaksiyonunda kullanılan DNA fragmanları, DNA pol (Malzeme Tablo) ile çoğaltıldı. HEF1α yükseltici bölüm 1, hEF1α yükseltici bölüm 2, tam uzunlukta mutant CstF-64 DNA fragmanları, DNA pol ilgili tavsiyelerine, 28 döngü (Şekil 4A) için ayrı tüplere eş zamanlı olarak amplifiye edilmiştir (Malzeme Tabloya bakınız her çevrim denatürasyon için 98 ° C tavlama, 55 ° C 'de 45 saniye uzama 72 ° C'de 90 saniye), 7 saniyeydi. Başlangıçta, pcDNA 3.1 omurga (72 ° C 'de 3 dakika ayarlandı uzama zamanı, haricinde yukarıdaki ile aynı koşullar kullanılarak) 22 çevrim için yükseltilmiştir. Bununla birlikte, elde edilen DNA verimi bir montaj reaksiyonunda (Şekil 4A) 'de kullanım için yeterli değildi. Bu nedenle başka bir amplifikasyon yeterli DNA elde etmek için yapıldı.

PCR ürünleri eldebir plazmid şablonundan ed aksi Sonuçta ortaya çıkan grup, reaksiyon ürünleri kontamine olur ve yanlış-pozitif ilaç-dirençli bakteri kolonileri üretecek plazmid DNA, kaldırma DpnI sınırlama enzimi ile sindirilmiş olmalıdır. Bu nedenle, PCR ürünleri yaran metillenmiş ve hemi-metillenmiş plazmid DNA baraj + E izole DpnI kısıtlama enzimi ile sindirildi E. coli suşları. Şablonları metile veya hemi-metillenmiş bazlar ihtiva etmez kimyasal olarak sentezlenmiş DNA yana DpnI sindirilebilir gerekmez PCR ürünleri, sentetik DNA parçalan kullanılarak elde edilmiştir.

PcDNA 3.1 vektör omurgası için PCR birlikte bir araya getirilmiş, protokolün adım 4'te tarif edilen ve ikinci DNA saflaştırma manyetik boncuk miktarı buna göre ayarlanır DNA fragmanları (Malzeme Tablo) saflaştırılmış ve DNA saflaştırma manyetik boncuklar üzerinde konsantre edildi. DNA verimi tespit edildiBir spektrofotometre (Ekipman Tablo 1 ve Tablo) kullanarak. CstF-64 ve mutant CstF-64 yapılar için montaj reaksiyonlar buz (Tablo 1) üzerine monte edilmiştir. "Uçlar" olarak kabul edilen DNA parçalarının bir 3-kat molar fazlalıkta (Tablo 1, Şekil 3) kullanıldı. Karışık DNA fragmanlarının nihai hacim, su ile 10 | il ve montaj ana karışımı (2x) ilave edildi ve 10 ul ayarlanmıştır. reaksiyonları karıştırılmış ve 1 saat süre ile 50 ° C'de inkübe edilmiştir. Pozitif kontrol reaksiyon da, GA kiti kılavuzuna önerisi doğrultusunda monte ve CstF-64 ve mutant CstF-64 reaksiyonları ile eş zamanlı olarak inkübe edildi. Protokolünde tavsiye edildiği üzere, montaj reaksiyonların her 2 ul kimyasal yetkili E. dönüştürülmüştür coli montaj klonlama kiti (Malzeme Tablo bakınız) ile birlikte. kitte tarif edildiği gibi dönüştürme gerçekleştirilmiştirmanuel. Pozitif klonlar, ampisilin, agar / LB plakaları üzerinde seçilmiştir. Her bir montaj reaksiyon başına 6 koloni rasgele dağıtılmasını üzere seçildi. Plasmid DNA'lar (Malzeme Tablo) bir plazmid izolasyon mini kiti kullanılarak izole edilmiştir. Sınırlama yapılarında silico sindirim Nhel ve Notl 4590 bp, CstF-64 ve 4590 bp için 3032 bp'lik boyutta iki parçalan üe sonuçlanmıştır enzimleri olarak, Mutant CstF-64 (Şekil 2B ve Şekil 4B) için 2711 bp'lik. Kısıtlama sindirim Hindlll ve Notl aşağıdaki boyutlarda üç parçalarının sonuçlandı enzimleri: (5872 bp, 1005 bp ve 745 bp (CstF-64) ve 5872 bp, 1005 bp ve 424 bp mutant CstF-64, Şekil 2B ve Şekil 4C). Gerçekten de, izole edilmiş plazmid sindirim beklenen karakteristik desen (Şekil 4B, C) ​​gösterilir. Not CstF-64 mutant Hindlll ve Notl ile sindirilerek üretilen 424 bp'lik bir DNA fragmanı,Şekil 4C üzerindeki plazmidler zayıf küçük boyutu nedeniyle lekeli. 6 izole plazmitlerin 2 sıralama için gönderildi. Biz hEF1α promotör dizilir ve CstF-64 ya da mutant CstF-64 yapıların parçaları hiçbir silmeler, eklemeler veya değiştirmelerin olduğunu doğrulamak için. Biz çok bu kaynaklanan DNA yapıları veya herhangi PCR tabanlı protokol sıralamayı tavsiye ederiz. dizilmesi, her biri dizilenmiş plazmid bir hEF1α, 3xFLAG-etiketi ve CstF-64 ya da mutant CstF-64 bölgesinde beklenen dizi içerdiğini gösterdi. Diğer plasmidlerin her biri, karşılık gelen bir DNA fragmanının çoğaltılmasında esnasında katılan bir nokta mutasyon saptanmadı. Fare embriyonik kök hücreleri CstF-64 ihtiva eden plazmid ifadesi, vahşi tip ifade 17 ile karşılaştırılabilir dışsal protein bol miktarda üretilir.

DNA montaj şeması, 5' eksonükleaz, tavlama, polimeraz uzantısı, ligaz birleştirme.
Gibson Meclisi mekanizmasının 1. şematik gösterimi Şekil. DNA fragmanlarını uçları izotermal tek bir sürekli sırayla monte edildi binme ile. üst üste ilk yavaş yavaş inaktive ısı olan 5 'eksonükleaz, geri çiğnenir bitiyor. Bu nedenle, üst üste binen uçlara sahip farklı DNA fragmanları, izotermal tavlanması olacaktır. DNA polimeraz boşlukları ve çentikler ligasyonu ısıya dayanıklı DNA ligaz dolduracaktır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Gibson montaj şeması; nükleotid dizisi, DNA sindirimi, plazmit yapım süreci.
Protokolü Şekil 2. (A), Akış düzeneği klonlanması için anlatıldığı. Plazmid (B) Temsil, PGA-CstF-64 GA kiti kullanılarak oluşturulan Kırmızı - montaj reaksiyonda kullanılan DNA fragmanlarının:. PcDNA3.1; hEF1α promotör bölüm 1 (hEF1a - 1); hEF1α promotör bölüm 2 (hEF1a - 2) sentetik DNA olarak sipariş; Fare CstF-64 (mCstF-64). Mavi - açık okuma çerçeveleri. Mor - viral ve viral olmayan promoterler. Yeşil -. Bölünme ve poliadenilasyon bölgeleri bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Gibson montaj şeması; Genetik klonlama işlemi için DNA fragmanları, plazmit kaynakları ve boyutları.
Şekil Gibson montaj CstF-64 plazmidinin 3. tasarımı. Siyah kutular siliko dizisinde bir Gibson düzeneği CstF-64 tasarlamak için kullanılabilir DNA fragmanlarının temsil eder. Daha sonra, dizi, PCR ile amplifiye edilmiştir Dört DNA parçaları, bölündü. Nedeniyle dizisi hEF1α pr birlikte sDNA olarak tasarlanmıştır 3xFLAG etiketinin küçük boyutu Not omoter bölüm 2. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Jel elektroforez sonuçları, plazmit analizi, DNA ayrımı, farklı yapılar için etiketlenmiş bantlar.
Klonlama reaksiyonlar ve elde edilen plazmidler temsilcisi kısıtlayıcı enzim sindirimi kullanılan DNA parçalarının Şekil 4. PCR (A) Temsilcisi PCR'ler sıcak montaj reaksiyonlarında kullanılan DNA parçaları için yüksek sadakat 2x ana karışımı başlatın kullanarak:. (B) Temsilcisi hEF1α, tam uzunluktaki CstF-64, pcDNA 3.1 yapı (PGA-CstF-64) ve hEF1α mutant CstF-64, pcDNA 3.1 yapı (PGA-mutCstF-64), Nhel ve Notl ile sindirilmiştir ve plazmidler. (C), B'de olduğu gibi aynı plazmidler Hindlll ve Notl enzimleri ile sindirildi."_blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

DNA fragmanlarının Adı Beklenen boyutta (bp) Kons. (Ng / | il), Seyreltilmiş (ng / ul) ul seyreltilmiş gelen GA CstF-64 kullanılan ul seyreltilmiş gelen, GA mutCstF-64 kullanılan Molar oranı (ins: vec)
pcDNA 3.1 (vektör) 4618 158 su katılmamış 1 1
hEF1_ promotör bölüm 1 825 213 75 1 1 3: 1
CstF-64 için hEF1_ promotör bölüm 2 516 229 50 1 3: 1
Cstf-64 1,796 161 su katılmamış 1 3: 1
mutant CstF-64 için hEF1_ promotör bölüm 2 516 199 50 1 3: 1
Mutant CstF-64 1,448 201 171 1 3: 1

Tablo 1. manyetik boncuk seyreltme ile konsantre edildikten sonra DNA fragmanlarının Verim ve montaj reaksiyonlar ayarlayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GA klonlama başarılı kullanımı her zaman tam yapı (Şekil 2 ve Şekil 3) dikkatli bir tasarım önünde olmalıdır.

Astar nesil aracı tarafından tasarlanan primer dizilerinin Dikkatli doğrulama da şiddetle tavsiye edilir. GA primerleri astar oluşturma aracı kullanılmadan oluşturulabilir. Ancak, aracın kullanımı, süreci kolaylaştırır, çünkü son derece tavsiye ederiz. Genel olarak, GA klonlama için, primer iki farklı fonksiyonel dizilerine sahip olmalıdır. İlk dizisi DNA fragmanı ye-özeldir, ve PCR kullanılarak fragmanının büyütülmesine olanak tanır. İkinci dizisi GA montaj için gerekli olan bitişik fragmanı ile çakışıyor. Tipik bir DNA fragmanı spesifik dizisinin uzunluğu 18-22 nt olabilir. Aynı DNA'yı büyütmek için kullanılan DNA fragmanı spesifik sekanslar benzer erime sıcaklıkları ve GC içeriğine sahip olmalıdır. Çakışan dizisi olmalıdır 15 en aznt, en az 48 ° C'lik bir erime sıcaklığına sahip uzunluğu. fazla 4 DNA parçalarının montajı en az 20 nt olmak örtüşen dizisi gerektirir. Daha uzun çakışmalar daha düzgün monte DNA fragmanları sonuçlanan tavlama artan özgüllüğünü sağlayacaktır. Bu çarpık dizileri uygun DNA düzeneğini tehlikeye olabilir çünkü, onların GC veya çakışan dizileri gelişmekte içerik AT çarpık olan dizileri önlemek için tavsiye edilir.

Ayrıca herhangi bir ilaç-dirençli bakteri kolonileri, bir GA reaksiyonunda vektör omurgası tekabül eden sadece bir DNA fragmanını üreten gereken bir negatif kontrol olarak kullanarak göstermektedir. Seçenek olarak ise, "geçme" içeren DNA parçalarının bir de herhangi bir ilaç-dirençli bakteri kolonileri ile sonuçlanmalıdır GA reaksiyonu, ihmal edilebilir. Bir compl montajını kılacak hiçbir koloniler komşu DNA parçalarının üst üste uçları eksikliği olacak büyüyecek nedeni,ete plazmid.

Protokolü tarif olarak, çünkü kullanılan DNA parçalarının sayısı (Şekil 3) nt primer seti kullanılmıştır oluşturmak için 25 dizi ile üstüste gelen. 6 DNA fragmanlarını - astar üretme aracı web sitesinin önerisi 4 araya en az 20 nt örtüşen dizileri kullanmaktır (Ekipman Tablo bakınız). Buna ek olarak, daha kısa DNA şeritlerinin düzgün tamamlanmasını sağlayacak üstüste binen doğru olarak monte ürünlerin sayısının artırılması (bakınız Şekil 1).

Şu anda, kesintisiz klonlama için çeşitli sistemler mevcuttur. Ancak, bu sistemlerin bazıları hala (yani, Golden Gate 18 klonlama) kısıtlama enzimleri kullanın. Diğer aynı biyolojik bir kaynaktan 19 gelen aşı virüsü DNA polimerazı, tek iplikli bir DNA bağlayıcı protein göre enzimlerin özel karışımlar kullanılmaktadır. Her iki sistem de shor tarafından GA karşılaştırıldığında sınırlıdırdizi ile üstüste gelen ter uzunluğu. Kısa örtüşen diziler sorunlu fazla 23 DNA parçalarının doğru montajını render bitişik DNA parçalarının tavlama aşamasında, yeterli özgüllük sağlamak olmayabilir çünkü. Bu eksiklikler, GA sistemde mevcut değildir.

(uzunluğu, yani, en az 8 kbp), PCR tarafından güvenilir bir şekilde büyütülebilir boyutu aşmayacak şekilde amplifiye edilecek olan DNA parçalarının büyüklüğü de dikkate alınmalıdır. Hatta, son 10 yıl içinde DNA polimerazların işlevinde gelişmelerle, büyük DNA fragmanları daha az etkinlik ve doğruluk ile amplifiye edilir. Gerekirse, daha geniş DNA fragmanları, plazmid izole edilmiş ve sınır enzimleri ile sindirme ile uygun bir DNA, örneğin, PCR için alternatif olarak, diğer kaynaklardan elde edilebilir. Spesifik olarak, mevcut metin içinde tarif edilen protokol için eden PCR kullanımı mantıklı daha tüm az olan mevcut DNA fragmanlarının boyutuna dayandırılmıştır5 kbç. Agaroz jel elektroforezi ile tespit birden fazla PCR ürünü, varsa, istenen parçası boyutu jel saflaştırma veriler moleküler biyoloji teknikleri ya da uygun kitlerin herhangi biri kullanılarak tavsiye edilir. Mevcut protokol termostabil DNA polimeraz (Malzeme Tablo bakınız) kullanılır. Bununla birlikte, yüksek ölçüde doğruluk ve ürün sağlayan herhangi bir DNA polimeraz, bu protokol ile birlikte kullanılmak üzere uygun olacaktır. Protokol açıklanan farklı yüksek sadakat DNA polimerazlar varsa ilgili kılavuzlarda açıklandığı gibi, yukarı belirtilen şartları kullanın. Mevcut protokolde, kimyasal yetkili E. coli hücreleri GA kiti ile birlikte olduğu kullanılmaktadır. Seçenek olarak ise, kimyasal ya da elektro kompetan E. örneğin DH5a ya da DH10B gibi coli suşları kullanılabilir.

2x ana karışımı klonlama montaj az eller zamanla kullanımı kolaydır. Ancak, doğru pipet ne nedeniyle küçük hacimli gereklidireded birlikte karıştırılır. İyi moleküler biyoloji tekniği, hem sürekli icra edilmesi gerekmektedir.

GA klonlama uzun boyutu 3 kbp'yi daha DNA fragmanları, plazmid ve vektörler, bir inşaat için sınırsız olanaklar sunuyor. Örneğin, sentezini ve montajını sağlar Buna ek olarak bu, bütün bir bakteri (Mycoplasma mycoides) genomunun ya da bir maya (Saccharomyces cerevisiae) kromozom 20,21, sentetik biyoloji alanında daha geniş bir etkisi vardır. klasik klonlama kesintisiz yapıları oluşturmak için ihtiyacı için teknik de uygulanabilir.

Sonuç olarak, GA klonlama geleneksel DNA klonlama prosedürü, hızlı, güvenilir ve esnek bir alternatif sunmaktadır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açık Erişim yayın ve üretim ücretleri New England BioLabs Inc. tarafından sağlandı.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz cömertçe veren pcDNA 3.1 myc-His (A) ve hEF1α organizatörü içeren plazmidler için, Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi, Lubbock, Teksas ve Mladen Yovchev Pittsburgh Tıp Merkezi Üniversitesi, Pittsburgh de PA Michaela Jansen teşekkür etmek istiyorum . Bu yayında bildirilen araştırma ödülü numarası (CCM için) R01HD037109 altında Çocuk Sağlığı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri İnsan Gelişimi Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Ek destek Kadın Sağlığı (CCM ve PNG) Laura Bush Enstitüsü oldu. içerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sentetik çift sarmallı DNA parçası (sDNA)Entegre DNA TeknolojileriUzunluğu 2 kb'ye kadar çıkabilen gBlocks kullandık. Bununla birlikte, birçok ticari sentetik DNA kaynağı mevcuttur.
DNA saflaştırma manyetik boncuklarıBeckman CoulterA63880Agencourt AMPure XP - PCR Saflaştırma sistemi
Plazmid İzolasyon Mini KitiOmega Bio-Tek IncD6942-01E.Z.N.A. Plazmid Mini Kiti I
Gibson Montaj Klonlama KitiNew England BioLabsE5510S
DNA polimerazNew England BioLabsM0494SQ5 Sıcak Başlangıç Yüksek Sadakat 2x Master Mix
DpnINew England BioLabsR0176S
NheINew England BioLabsR3131S
NotINew England BioLabsR3189S
HindIIINew England BioLabsR3104S
SpektrofotometreTermo BilimselNanoDrop cihazı
EditSeqDNASTARParçası Lasergene Core Suite
SeqBuilderDNASTARLasergene Core Suite Word'ün
MicrosoftMicrosoft Office
NEBuilderParçası Primer oluşturmaaracı: http://nebuilder.neb.com
NEBioCalculatorNew England BioLabsLigasyon hesaplayıcısı: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods in enzymology. 498, 349-361 (2011).
  2. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature methods. 7, 901-903 (2010).
  3. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature methods. 6, 343-345 (2009).
  4. Bowtell, D. D., Johnson, G. R., Kelso, A., Cory, S. Expression of genes transferred to haemopoietic stem cells by recombinant retroviruses. Molecular biology & medicine. 4, 229-250 (1987).
  5. Challita, P. M., Kohn, D. B. Lack of expression from a retroviral vector after transduction of murine hematopoietic stem cells is associated with methylation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 2567-2571 (1994).
  6. Lutzko, C., Senadheera, D., Skelton, D., Petersen, D., Kohn, D. B. Lentivirus vectors incorporating the immunoglobulin heavy chain enhancer and matrix attachment regions provide position-independent expression in B lymphocytes. Journal of Virology. 77, 7341-7351 (2003).
  7. Meilinger, D., et al. Np95 interacts with de novo DNA methyltransferases, Dnmt3a and Dnmt3b, and mediates epigenetic silencing of the viral CMV promoter in embryonic stem cells. EMBO reports. 10, 1259-1264 (2009).
  8. Chan, K. K., Wu, S. M., Nissom, P. M., Oh, S. K., Choo, A. B. Generation of high-level stable transgene expressing human embryonic stem cell lines using Chinese hamster elongation factor-1 alpha promoter system. Stem cells and development. 17, 825-836 (2008).
  9. Chung, S., et al. Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines. Stem cells. 20, 139-145 (2002).
  10. Qin, J. Y., et al. Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. PloS one. 5, e10611(2010).
  11. Lund, A., Knudsen, S. M., Vissing, H., Clark, B., Tommerup, N. Assignment of human elongation factor 1alpha genes: EEF1A maps to chromosome 6q14 and EEF1A2 to 20q13.3. Genomics. 36, 359-361 (1996).
  12. Wallace, A. M., et al. Two distinct forms of the 64,000 Mr protein of the cleavage stimulation factor are expressed in mouse male germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6763-6768 (1999).
  13. MacDonald, C. C., McMahon, K. W. Tissue-specific mechanisms of alternative polyadenylation: testis, brain, and beyond. Wiley interdisciplinary reviews. RNA. 1, 494-501 (2010).
  14. Sabath, I., et al. 3'-End processing of histone pre-mRNAs in Drosophila: U7 snRNP is associated with FLASH and polyadenylation factors. Rna. 19, 1726-1744 (2013).
  15. Yang, X. C., et al. A complex containing the CPSF73 endonuclease and other polyadenylation factors associates with U7 snRNP and is recruited to histone pre-mRNA for 3'-end processing. Molecular and cellular biology. 33, 28-37 (2013).
  16. Grozdanov, P. N., Macdonald, C. C. High-Throughput Sequencing of RNA Isolated by Cross-Linking and Immunoprecipitation (HITS-CLIP) to Determine Sites of Binding of CstF-64 on Nascent RNAs. Methods in molecular biology. 1125, 187-208 (2014).
  17. Youngblood, B. A., Grozdanov, P. N., MacDonald, C. C. CstF-64 supports pluripotency and regulates cell cycle progression in embryonic stem cells through histone 3' end processing. Nucleic acids research. , (2014).
  18. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PloS one. 3, e3647(2008).
  19. Irwin, C. R., Farmer, A., Willer, D. O., Evans, D. H. In-fusion(R) cloning with vaccinia virus DNA polymerase. Methods in molecular biology. 890, 23-35 (2012).
  20. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58 (2014).
  21. Gibson, D. G., et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science. 329, 52-56 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Plazmid Vekt rnsan EF1 Promot rFLAG etiketli ProteinCSTF 64 EkspresyonuFare Embriyonik K k H creleriRestriksiyon SindirimiDNA SekanslamaPCR AmplifikasyonuBakteriyel Transformasyon

İlgili makaleler