Yöntem makalesi

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/52242

⸱

4 Ocak 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University, 2Department of Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 3Biology Program, Iowa State University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, sinir sistemi kurtarma ve onarımı için uzun süreli in vivo nakil çalışmalarında uygulanmadan önce tasarlanmış kök hücreleri ve davranışlarını hızlı bir şekilde karakterize etmek için deneysel bir platformu tanımlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) güçlü bir hücresel kaynaktır ve çeşitli hastalıkların tedavisi için stratejiler geliştirmek için potansiyel adaylar olarak çok sayıda çalışmada kullanılmıştır. Bu çalışmanın amacı, MSC'leri, hasarlı veya hastalıklı sinir sistemini kurtarmak için nöroprotektif bir stratejinin parçası olarak terapötik faktörlerin verilmesi için tasarlanmış hücresel araçlar olarak geliştirmek ve karakterize etmekti. Bu çalışmada, yeşil floresan proteini (GFP) ile birlikte beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) veya glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) kodlayan lentiviral vektörler kullanılarak genetik olarak modifiye edilmiş fare MSC'leri kullanıldı.

İn vivo nakil çalışmalarına devam etmeden önce, genetik modifikasyonun normal hücre davranışının yönlerini değiştirip değiştirmediğini belirlemek için tasarlanmış hücreleri karakterize etmek önemliydi. Farklı kültür substratları, tasarlanmış MSC'lerin dört alt popülasyonunun hücre yapışmasını, proliferasyonunu, hayatta kalmasını ve hücre göçünü destekleme yetenekleri açısından incelendi. Yüksek içerik taraması (HCS) yapıldı ve görüntü analizi yapıldı.

İncelenen substratlar şunları içeriyordu: poli-L-lizin, fibronektin, kollajen tip I, laminin, entaktin-kollajen IV-laminin (ECL). Hücre proliferasyonunu araştırmak için Ki67 immünoetiketleme kullanıldı ve hücre canlılığını araştırmak için Propidium İyodür boyaması kullanıldı. Hızlandırılmış görüntüleme, yüksek içerikli tarama sistemi üzerinde iletilen bir ışık/çevre odası sistemi kullanılarak gerçekleştirildi.

Sonuçlarımız, genetiği değiştirilmiş MSC'lerin farklı alt popülasyonlarının, genel olarak orijinal, değiştirilmemiş MSC'lerinkiyle karşılaştırılabilir benzer davranışlar sergilediğini gösterdi. Farklı kültür substratlarının hücre büyümesi ve hücre göçü üzerindeki etkisi, farklı MSC alt tiplerini ve kültür substratlarını karşılaştıran gruplar arasında önemli ölçüde farklı değildi.

Bu çalışma, sinir sistemi kurtarma ve onarımı için uzun süreli in vivo nakil çalışmalarında mühendislik kök hücreleri ve davranışlarını uygulanmadan önce hızlı bir şekilde karakterize etmek için deneysel bir strateji sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinir sistemi bozukluklarının tedavisi için yararlı tedavilerin uygulanması ile ilgili bir ana sorunu daha da dejenerasyonu önlemek ve aynı zamanda fonksiyonlarının eski haline gelmesini kolaylaştıran etkili yöntemler geliştirmek bulunmaktadır. Yenilikçi bir strateji öncesinde nakli için nöro-koruyucu faktörler, üretimi için genetik olarak kök hücreleri ex vivo olarak etmektir. Gen terapisi, bir tür ile birleştiğinde hücre bazlı Tedavinin bu kombinasyonu, sinir sistemi hastalık veya hasar kaynaklı nöron ölümünün tedavisi için güçlü bir yöntem sunar.

Nörotrofik faktörler, olgun nöronların büyümesi ve gelişmekte olan sinir hücrelerinin hayatta kalma olarak bakım ve plastisite için gereklidir. Bir dizi çalışma, merkezi ve periferik sinir sisteminde nöronların (sinir sistemi ve periferik) ilk büyümesini ve farklılaşmasını teşvik nörotrofik faktörlerin önemli roller göstermiştir ve ayrıca, in vitro olarak ve rejenerasyonu uyarabilirsinir yaralanması 1 Nimal modelleri. Beyin-türevli nörotrofik faktör (BDNF) yüksek CNS ifade ve nöral gelişimi, sinaptik plastisite ve onarım 2. düzenleyen önemli roller oynar. Glial hücre çizgisi türevli nörotrofik faktör (GDNF), dopaminerjik ve nörotoksinlerini 3 de dahil olmak üzere çok çeşitli nöronların hayatta kalmasını teşvik eder. Bu nedenle, sinir tamiri için önemli bir stratejidir sinir sisteminin zarar gören ya da hastalıklı bölgelere nörotrofik faktörlerin dışsal kaynaklarını sağlamaktır.

Multipotent kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücreler (MKH) hasarlı ya da hastalıklı sinir sistemini tedavi etmek için terapötik proteinlerin teslimat için büyük bir potansiyele sahip. Onlar, 2) multipotansiyel kapasite, 3) küçük etik kaygılar, 4 izolasyon ve bakım 1) göreli kolaylığı da dahil olmak üzere bir çok avantaj var çünkü MKH transplantasyonu hastanın uyumlu hücre tabanlı tedaviler geliştirmek çabalarında de dikkat çekti) Hayatta ve otolog transplantasyon 4,5 için nakli ve 5) potansiyeli aşağıdaki göç yeteneği. Ümit verici sonuçlar, omurilik yaralanması, 6,7, felç 8,9, miyelin yetmezliği 10 ve retinal dejenerasyon 11-13 dahil olmak üzere farklı nörodejeneratif koşullar, bir dizi hayvan modellerinde naif ve genetik olarak MSC kullanımı ile bildirilmiştir. Genetik olarak kök hücrelerden nörotrofik faktörlerin teslim hücre nakli Kaplin yeni ve önemli sinir onarım stratejisidir.

Hücre tabanlı tedavi faktör teslim sistemlerinin geliştirilmesinde önemli bir adım mühendislik hücrelerin normal sağlığını belirlemektir. Gibi, bu çalışmanın temel amacı, genetik olarak erişkin kök hücrelerin genel büyüme parametrelerini değerlendirmektir. Hızla birden fazla hücre parametrelerini değerlendirmek için önemli bir yaklaşım hücresel görüntü tabanlı yüksek yoluyla Ekranlanması istihdam etmekg (HTS), genellikle yüksek içerik tarama (HCS) prosedürleri 14 anılacaktır. Bu teknoloji otomatik görüntü toplama ve analiz sağlar ve bu yaklaşım kök hücre araştırma uygulamaları için özellikle uygundur. Bu projede genetik mühendisliği erişkin kök hücreler HCS sistemi kullanan hücre tabaka tercihleri ​​ve hücresel fonksiyonların hızlı karakterizasyonu ve optimizasyonu sağlayan bir profil platformu geliştirdi.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

96 oyuklu plakalar, 1. Yüzey Hazırlama

  1. Farklı alt tabakalar ve hücre tiplerini açıklayan 96 oyuklu plaka bir haritası oluşturma (Şekil 1) incelenecek.
  2. Farklı alt tabakalar [poli-L-lisin, fibronektin, I, laminin ve entactin-kolajen IV-laminin (ECL) kollajen tip], 96 oyuklu bir çok oyuklu bir plaka ve steril bir hücre kültüründe, bir çalışma istasyonu hazırlamak stok çözeltilerinin elde edilmesi davlumbaz.
  3. (Bu konsantrasyon, önceden hücrelerin büyümesi ve çoğalması için bir alt-tabaka konsantrasyona bağlı bir deneye göre belirlenmiştir) 5 ug / ml'lik bir son konsantrasyona kadar, steril fosfat tamponlu salin (PBS) 'de stok seyreltilmesi ile tek tek tabakaları hazırlayın. Steril bir rezervuar içine dökülmeden önce bir vorteks ile karıştırın.
  4. 96 oyuklu harita (Şekil 1) 'e göre, her bir oyuğa substrat çözeltisi 100 ul ekle (12 ya da 8-kanallı bir mikro pipet bir 96 oyuklu bir plakaya micropipetting için uygun). Parafilm bir şerit kullanılarak 96 oyuklu plakaya kapağı kapatın ve 4 ° C de bir gece boyunca muhafaza ediniz.

2. Hücre Kaplama ve Time-lapse Görüntüleme

Not: Fare MKH'ler yetişkin C57BL / 6 farelerinin kemik iliğinden izole edilmiş ve bir yapışkan hücre hattı olarak muhafaza edilmiştir. Lentiviral vektör en kodlayan BDNF (LV-BDNF kullanılarak ve glial hücre kökenli nörotrofik faktör (insan cDNA GDNF), MKH beyin kaynaklı nörotrofik faktör (insan cDNA BDNF) salgılaması için onlara mühendisi lentiviral vektörleri kullanılarak enfekte edilmiş CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP) ve yeşil floresan protein (GFP, LV-GFP, CMV-GFP).
Not: Fare mezenkimal kök hücreleri için kültür ortamı (MSC'ler), 10 mg / ml streptomisin,% 10 hibridom nitelikli fetal sığır serumu,% 10 at serumu, 2 mM L-glutamin ve 10,000 U / ml penisilin, ihtiva eden Iscove Modifiye Dulbecco ortamı olan . Fare MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-M beş farklıSC'ler ve BDNF / GDNF-GFP MSC'ler), T75 hücre kültürü şişelerinde% 30 birleştiği kaplandı.

  1. Hücre Ekimi
    1. Iki kez Ertesi gün, aspirasyon ile alt-tabaka çözüm çıkarın ve steril PBS yaklaşık 200 ul her bir yıkayın. Nihai PBS durulama sonra her bir oyuğa Hücre kültür ortamı (200 ul / oyuk) ilave edin. 37 ° C'de ve% 5 dengeleme için CO2 ayarlanmış bir hücre kültürü inkübatöründe içine 96 oyuklu plaka koyun.
    2. 96 gözlü plaka inkübatör içinde dengelemeden birlikte, hücreler hasat büyüme ortamı toplayarak (T75 şişeleri içinde hasat MKH'ler / kaplama sırasında yaklaşık% 70 konfluent olmalıdır), T75 şişesi (koşullu ortam adlandırılır) ve steril koşullar altında 15 ml'lik konik bir tüp içinde depolanması (bu koşullu ortam aşağıda adım 2.1.4 kullanılacaktır).
    3. Şişeye steril PBS 8 ml ilave edilir ve yavaşça girdap ve daha sonra PBS pipetle ve% 0.05 tripsin 1 ml ve% 0.01 ilaveEDTA çözeltisi T75 şişesinin kültür yüzey hücreleri ayırmak için. Faz kontrast optik ile donatılmış bir ters mikroskop kullanılarak balon görüntüleyerek hücre dekolmanı izleyin.
    4. Hücreler müstakil zaman, hemen şişeye (adım 2.1.2 toplanan) klimalı ortam 8 ml ekleyin. Hücre süspansiyonu toplayın ve topak hücrelere 450 x g'de, 4 dakika için 15 ml konik santrifüj tüpüne ve santrifüj aktarın.
    5. Süpernatantı ve taze 200 ul hücre pelletini ve (37 ° C) hücre kültürü ortamı ısıttı.
    6. Bir hemasitometre kullanarak bir tripan mavisi canlı hücre sayımı gerçekleştirilerek hücre süspansiyonu hücre sayısını belirler. Yaklaşık 300 hücre / kuyucuk içine 96 oyuklu plaka ihtiva eden uygun oyuklara hücreleri Plate.
    7. Hücrelerin her nüfus için bu adımları yineleyin.
  2. Time-lapse Görüntüleme
    1. MKH tüm kaplama edildikten sonra, yer2 saat süre ile bir inkübatör içine 96 oyuklu plaka MKH'ler alt tabakaya eklemek için izin verir.
    2. HCS sistemini başlatın ve sistemin dengeye için 2 saat bekleyin. 37 ° C çevre denetleyicisi ayarlama, sabit bir hava kaynağı temin HCS sistemi çevre odasında, hava içinde% 5 CO2 ihtiva eden bir gaz karışımı silindiri bağlanır.
    3. 2 saat bir dengeleme süresinden sonra, aşağıdaki inkübatör 96 oyuklu plaka çıkarın ve HCS sisteminin hücre büyüme odasına doğrudan yer. Dengeleme plakası herhangi bir ısı ile ilgili genişleme için hesap ve sonra plaka ayarlarını yapılandırmak için görüntü toplama ve analiz yazılımı başlatmak için 30 dakika bekleyin.
    4. Görüntüleme için 20X objektif seçin. [Yani, vb FİBRONEKTİN GFP-MKH (x 2 çoğaltır 30 şartlarda = toplam 60 kuyu toplam 6 yüzeyler x 5 MSC alt tipi)] time-lapse görüntüleme kurmak için koşul başına iki kuyu seçin. Ile görüntüleme için iki site seçinHer çukurda.
    5. Görüntüleme için doğru ışık dalga boylarını seçin.
      NOT: İki farklı dalga boyları (Faz kontrast ve GFP floresan) time-lapse görüntüleme için seçildi.
    6. Lazer otofokus kullanarak kuyu dibinde odaklanın ve optimize odak düzlemi bulmak için birden fazla site ve çoklu kuyular test görüntüleri çekmek.
    7. Odak kurulduktan sonra, 60 kuyuları (120 site) için 48 saat boyunca görüntüleri her 5 dakikada yakalayan başlar.
    8. HCS sistemi için 96 oyuklu bir plaka kaldırılarak hücreleri her 24 saatte besleyin. Her ortam, 75 ul iyi çıkarın ve her bir oyuğa taze ortam, 100 ul (37 ° C ve% 5 CO bu taze ortam dengeye 2).
    9. Time-lapse Deneyin sonunda, HCS sisteminden 96-plaka çıkarın. Steril koşullar altında, her bir oyuktan koşullu ortam örnekleri toplamak ve başka bir 96-çukurlu plaka Bu örnekleri aktarın.
      NOT: Bu örnekler ayrıca analizi kullanılmıştır için kullanılabilirnörotrofik faktörler için ELISA performans gereğidir.
    10. Bu tür Ki67 hücre çoğalması tahlilinde veya propidyum iyodid ölü / canlı boyama tahlilinde (ayrıntılar aşağıdadır) gibi ek tahliller için kültürlenmiş MSC 96 oyuklu plaka hazırlanması.
    11. Aşağıdaki bölüm 5'de tarif edildiği gibi hücre göçü / hücre takibi için zaman atlamalı görüntüleme analizi.

3. Ki67 Hücre Çoğalması ve Propidium Iodide Canlı / Ölü Deneyi

  1. Ki 67 Hücre Proliferasyon Deneyi (İmmünositokimya)
    1. 0.1 M fosfat (PO 4) bir dakika için iki kez tampon hücre kültürleri durulayın. Oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 paraformaldehid (PFA) ile kültür sabitleyin. PFA çıkarın ve yedi dakika üç kez PBS ile kuyu durulayın.
    2. Son durulama sonra, her bir göze bir karşı bloke edici çözeltisi 100 ul (fosfat tamponlu tuzlu su,% 5 normal eşek serumu,% 0.4 sığır albümin serumu ve% 0.2 Triton X-100) ekleyinBurada nd 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 200: 1 bir çalışma oranında bloke çözeltisi içinde seyreltilmesi ile primer antikor, tavşan anti-Ki67, hazırlayın.
    3. Bloke edici çözelti çıkarın ve her bir oyuğa birincil antikor solüsyonu, 100 ul de geçerlidir. 96 oyuklu plaka örtün ve bir gece süreyle 4 ° C'de inkübe örnekleri.
    4. Ertesi gün, antikor çözeltisi çıkarın ve 7 dakika, 3 kez PBS ile yıkayın.
    5. Ikincil antikor hazırlayın, eşek anti-tavşan Cy3 1 bir çalışma oranında çözüm engelleme: 500. 1: 100 seyreltisinde ikincil antikor çözeltisine DAPI nükleer leke ekleyin. Son PBS durulama çıkarılmasından sonra her bir sekonder antikor / DAPI çözeltisinin 100 ul uygulanır. 90 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe edilir.
    6. İkincil antikor / DAPI çözeltisi çıkarın ve 7 dakika, 3 kez PBS ile her bir yıkayın. Görüntüleme kadar 4 ° C'de 96-çukurlu plaka ve mağaza örtün.
  2. Propioniloksidium iyodür Canlı / Ölü Deneyi
    1. Aşağıda tarif edildiği gibi propidyum iyodür (PI), dışlama deneyi ile hücre ölümü ölçün.
    2. Kültür ortamı içinde, 1.5 uM'lik bir konsantrasyonda propidyum iyodür leke çözelti hazırlayın.
    3. Bu hücreleri öldürmek amacı ile 2 dakika için MSC nin bir oyuğuna% 70 etanol içinde 100 ul ekle. Bu pi leke için bir pozitif kontrol olarak hizmet etmektedir. MKH çoğunluğu PI-lekeli hücre ölümünü gösteren olacaktır. Etanol çözeltisini çıkarın.
    4. Her oyuğa propidyum iyodür leke çözeltisi 100 ul ilave edin ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 20 dakika inkübe edilir.
    5. 1 dakika sonra 2 kez 0.1 M fosfat tampon maddesi ile hücreleri durulayın. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 0.1 M P0 4 tampon maddesi içinde% 4 PFA hücreleri saptamak. 7 dakika boyunca üç kez PFA çıkarın ve PBS ile yıkayın.
    6. Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici çözelti içinde seyreltildi DAPI çözeltisi (01:50) ile inkübe edin. Tüm kuyuları durulayın7 dakika sonra 3 kez PBS ile yıkandı.
    7. DAPI çözeltisi çıkarın ve 7 dakika, 3 kez PBS ile her bir yıkayın. Görüntüleme kadar 4 ° C'de 96-çukurlu plaka ve mağaza örtün.

4. Otomatik Görüntüleme ve Multiwavelength Puanlama Analizi

  1. 96-plaka yükleyin HCS sistemine (daha önce Ki67 immunolabeling veya propidyum iyodür lekeli için işlenmiş) ve 20 dk HCS sistem görüntü toplama ve analiz yazılımı açın için plaka gelmesini sağlayınız.
  2. Hücreler Otomatik Pozlama fonksiyonu kullanarak ikamet ve ilgi her dalga boyu için ofset hesaplamak Z'nin-düzlemi bul 1'den binning kamera ve 2 bir kazanç ayarını kullanarak 10X objektif için satın alma ayarlarını seçin. Bu analiz için, DAPI (W1), Cy3 (W2) ve FITC (W3) için yakalama görüntüleri. Negatif kontrol kuyuları görüntü elde etmek için hiçbir sinyal gösteriyor ki maksimum yoğunluk düzeyini seçin. Bu ayarı onaylayın pos için uygunitive kuyular.
  3. Plaka Edinme. Görüntü yakalamak ve görüntü elde etme ve analiz yazılımının veri tabanında saklayabilirsiniz.
  4. Görüntüleri elde edildikten sonra, görüntülerden açık görüntü toplama ve analiz çevrimdışı yazılım ve inceleme plakası verileri yukarıda satın aldı.
  5. Çok dalga boyu puanlama analizi seçin. Her dalga boyu için minimum ve maksimum yoğunluklar yapılandırın.
    NOT: DAPI tespiti her görünür çekirdeğin etrafında boyama işaretlemeniz gerekir. Cy3 Ki67 immünoreaktivitesinde (IR) ile pozitif hücrelerini tespit edilmeli ve negatif kontroller altında kızılötesi tespit etmemelidir. Cy3 Ki67 IR için, yaklaşık minimum genişlik yaklaşık maksimum genişlik 30 mikron idi, 7 mikron idi, yerel arka plan üzerinde yoğunluk 150 gri düzeyi idi, ve minimum lekeli alan 50 mikron 2 oldu.
  6. Tüm pozisyonlar için çalıştırın analizi. Elektronik tabloda görüntülemek için veri verir.

5. Hücre Takibi

  1. Açık görüntü acquisition ve analiz programı ve üzerine tıklayın "Değerlendirme Plaka Veri [DB] ...", ilgi plaka seçme.
  2. "Well vs Time" gibi verileri görüntüleyin.
  3. İstenilen seçimi sol tıklayarak "Yer" bölümünden sitelerinden birini seçin. Seçin altında "... Bulaşan" "dalga boyundaki:". Sağ 96-plaka şablonunda hedefin üzerine tıklayın ve "Yük Images" üzerine tıklayın.
  4. "Apps" ve ardından "Parça Nesneleri" üzerine tıklayarak hücreleri izleyin.
  5. Kullan "Dinamik Veri Değişimi (DDE)" gibi verileri, Microsoft Excel ihracat biçimi seçin.
  6. Kökeni, delta x ve delta y örneğin ihracat, geçen zaman, nesne numarası, mesafe, zaman aralığı, hız, mutlak açı, mesafe izleme verilerini seçin.
  7. Hedef hücreler üzerinde "Ctrl tuşu + sol klik" ile ilgi her hücre Etiketi.
  8. Parça hücreleri. Gerekirse, / durdurma "Esc" tuşu ile hücrelerin uygunsuz izleme değiştirmek ve ardından ayarları.
  9. Hücre izleme tamamlandıktan sonra, "Log Data" ile verileri kaydetmek.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSC büyüme parametreleri farklı yüzeylerde MKH farklı popülasyonlar kültürlenmesiyle incelendi. MSC alt tipleri (MSC, GFP MSC'ler BDNF-GFP MSC'ler, GDNF-GFP MSC'ler ve BDNF / GDNF-GFP MSC'ler) beş farklı popülasyonlar 96 oyuklu doku kültür plakalarına farklı ile önceden kaplanmış kaplanmıştır Şekil 1 'de gösterildiği gibi, alt-tabakalar. kültür dört gün sonra, plakalar sabittir ve imüno-ve / veya uygun reaktifler ile boyandı ve daha sonra HCS sistemi kullanılarak incelendi ve görüntü elde etme ve analiz yazılım programı ile yapılan analizleri yapıldı.

figure-results-1
Şekil 1:. Şablon gösterilen deney tasarımı için 96 oyuklu plaka şablonu 96-yuvalı plakalar, çeşitli substratlar ve kuyu ile kaplandı projelendirilmiş kök hücreleri ile tohumlanmıştır. Bir örnek olarak, sadece welsatırlar BF mı bu deneyde kullanıldı. Satırlar A, G ve H boş bırakılmıştır. Kısaltmalar - MKH: mezenkimal kök hücreler; GFP-MKH: yeşil floresan protein ifade MKH; BDNF-GFP-MKH: Beyin nörotrofik faktör-GFP ifade MKH türetilmiş; GDNF-GFP-MKH; Glial nörotrofik faktör-GFP-ifade MSC hücre-türevi; BDNF / GDNF-GFP-MKH; BDNF ve GDNF- GFP ifade MSC'ler; ECL: entactin-Kollajen IV-laminin).

DAPI counterstaining ardından Anti-Ki67 immünoyaftalama, farklı yüzeyler mühendislik MSC (Şekil 2A) farklı popülasyonlar çoğalmasını etkilemiş olup olmadığını değerlendirmek için kullanıldı. Ki67 antijen ifadesi hücre döngüsünün G1, S, G2 ve M, geç aşamalarında, tercihen oluşur ve dinlenme fazında hücreler (G 0) tespit edilmez ve dolayısıyla proliferasyon 15 hücresel marker olarak yararlı olan . 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), yaygın olarak kullanılan bir nu olanDNA 16 bölgelere AT bağlanması üzerine mavi floresan yayar açık ve kromozom counterstain. bir alandaki hücre sayısı DAPI lekeli çekirdeklerin sayısını sayarak tespit edilebilir. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, bir varyasyon çoğalan MSC yüzdelerinde olmasına rağmen, bütün alt tabakalar yine MSC alt tiplerinin her biri için önemli bir hücre çoğalmasını desteklenir.

figure-results-2
Şekil 2: Ki67 hücresi çoğalma tahlili. (A) Birleştirilmiş, Ki67 immunolabeling (kırmızı) ve DAPI (mavi) nükleer boyanma çift floresan görüntü. MSC çoğu Ki67 antikor (kırmızı) ile immunolabeled edildi. Ölçü bar = 50 um. Polistiren (PS) üzerinde büyümüş MSC alt tipi imüno-Ki67 yüzdeleri, poli-L-lisin (PLL) gösteren (B), çubuk grafik, fibronektin, kolajenin vitro (DIV) 5 gün boyunca ben, laminin, ya entactin-kolajen IV-laminin (ECL) yüzeylerde yazın. N bir deney =. Her çubuk, her durum için 2 kuyudan 8 görüntülü sitelerden toplanmış verileri ortalama temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Propidyum iyodür (PI) boyama farklı alt-tabakalar, hücre hayatta kalma (Şekil 3) etkileyip etkilemediğini değerlendirmek için kullanıldı. Propidium iyodür yaygın olarak kullanılan bir kırmızı floresan nükleer ve kromozom counterstain olduğunu. Propidium iyodür membran geçirgenliği olmayan ve genellikle canlı hücreler dışında, ve böylece popülasyonda ölü hücreleri tespit etmek yararlıdır. bir alan içinde tüm hücreleri belirlemek için örneğin DAPI gibi genel bir nükleer etiket ile bir araya getirildiğinde, belirli bir durum içinde Ölü hücrelerin oranı tespit edilebilir. PI-pozitif hücrelerin yüzdesi incelenen tüm yüzeylerde düşük (Şekil 3). PI reaktif için pozitif bir kontrol olarak MSC içeren birkaç kuyu,% 70 etanol içinde Şekil 3B ve 3C'de gösterildiği gibi, PG-işaretli hücrelerin yüksek oranda ortaya çıkan en hücrelerini öldürmek için bilinen bir durum kuluçkalanmıştır (etanol pozitif tedavi kontrol).

figure-results-3
Şekil 3: Propidyum iyodür hücre ölümü deneyi. (A) Birleştirilmiş, propidyum iyodür (kırmızı) ve DAPI (mavi) boyama için çift floresan görüntü. Canlı hücreler tüm çekirdekleri DAPI (mavi) ile boyandı, ancak hiçbir propidyum iyodid lekeleme MSC. (B) hemen hemen tüm MSC'ler,% 70 etanol maruz kaldıktan sonra, propidyum iodid ile boyanmış saptandı. A Ölçek çubukları ve B = 100 um. Propidyum iyodür (PI) yüzdelerini gösteren (C), bir bar grafiktir lekeli MSC alt tipipolistiren (PS), poli-L-lisin (PLL), fibronektin, in vitro (DIV), 5 gün boyunca kollajen tip I, laminin veya entactin-kolajen IV-laminin (ECL) alt-tabakalar üzerinde büyüdü. Etanol Kontrol: Bu durum, PI boyama reaktif için bir pozitif kontrol olarak görev yapmıştır. PI leke aşağıdaki etanol muamelesine tabi Çoğu hücreler ölü ve böylece olumlu PI reaktif lekeli. N bir deney =. Her çubuk, her durum için 2 kuyudan 8 görüntülü sitelerden toplanmış verileri ortalama temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

, Hücre göçü time-lapse dijital mikroskopi ve HCS sistemine iletilen ışık / çevre odası sistemi kullanılarak analiz edilmiştir mühendislik MSC davranışları farklı yüzeylerde olası etkisini araştırmak için (Ek video 1). Çoklu siteleri / kuyu time-lapse görüntülendive görüntü elde etme ve analiz yazılım programı kullanılarak farklı yüzeylerde büyüyen MSC farklı alt popülasyonlar için hücre göçü oranlarını hesaplamak için kullanılan. Şekil 4C'de gösterildiği gibi, genel olarak, MSC her alt tipi, hücre dışı matris kaplı yüzeyler için (fibronektin, kolajen, laminin ve ECL) ve non-kaplamalı polistiren yüzeylerde yavaş en hızlı göç oranı göstermiştir.

figure-results-4
Şekil 4:. Hücre izleme ve göç MKH görüntü elde etme ve analiz yazılımı ile takip etti. 29 saat sonra time-lapse görüntüleme oturumun sonunda en time-lapse görüntüleme ve (B) (A) baştan iletilen ışık ve floresan görüntülerin Bindirme görüntüleri (Ek video 1). Hücre göç izleri renkli li gösterilirnes. Ölçek çizgisi:. 50 um (C), bir bar grafiktir ortalama geçiş oranlarını gösteren (mm / saat olarak ifade edilir), MSC alt-tipleri için (PS), polistiren üzerinde yetişen, poli-L-lisin (PLL), fibronektin, kolajen tip I, laminin in vitro (DIV) 2 gün süreyle veya entactin-kolajen IV-laminin (ECL) yüzeylerde. N bir deney =. Her çubuk, her durum için 2 kuyulardan en az 10 görüntülü hücrelerin ortalamasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar GDO'lu MKH bu subpopülasyonunun benzer büyüme özelliklerini görüntülemek yönünde ön kanıtlar sağlamıştır. Bu sonuçlar Lentiviral bu tarama platformu kullanılarak incelenmiştir büyüme parametreleri üzerinde dramatik saptanabilir zararlı etkileri kaynaklı bu MKH genetik değişiklikler aracılı dair güçlü kanıtlar sunmaktadır.

Ek Video 1. Time-lapse dijital video. göç yolu, iki MSC için var [1 (yeşil hat izleme) ve 2 (Mavi izleme hattı) olarak belirtilmiştir] gösterilmiştir. Video, 29 saat süresince ele geçirdi. Görüntüler her 5 dakikada yakalandı. GFP-ifade MSC floresans görüntüleri video hazırlama zaman atlamalı görüntüleme için kullanılmıştır. Kalibrasyon çubuğu 50 mikron =. Bu tip bir analiz, hücre göçü ve hücre bölünmesi de dahil olmak üzere hücre davranışlarını araştırmak için yararlıdır.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yetişkin mezenkimal kök hücreler (MKH) hücresel ve gen teslimi bazlı tedavi birleştiren deneysel bir stratejinin geliştirilmesi için cazip bir hücre tipi vardır. MKH 17,18 paradigmalar / ayırt uygun indüksiyon ile nöronal ve glial soy içine transdifferentiating, mezodermal kökenli hücrelerin içine ayırt edebilen Multipotent, ve önemli plastisite görüntüler. Ayrıca, MSC'ler, transplante edilmiş ve nörodejeneratif koşulların 19 gibi hastalıkların bir dizi için klinik öncesi çalışmalarda etkili olduğu kanıtlanmıştır. MSC terapötik etkinliği de bunların faydalı anti-proliferatif, anti-enflamatuar ve anti-apoptotik faaliyetleri 20 dolayı bilinmektedir. MSC'ler da muhtemel yaralanma ya da hastalık 21. bölgelerinde transplantasyonundan sonra saf MSC ile bağlantılı nöro-koruyucu özelliklerine katkıda çeşitli nörotrofik büyüme faktörleri üretmek ve salgılamak için bilinmektedir. Importantly, MSC'ler genetik Birleştirilen hücresel ve gen terapisi tabanlı uygulamalar için nörotrofik faktörlerin sürekli verilecek şekilde modifiye edilebilir ve merkezi sinir sistemi 11,19,22 yaralanma ya da hastalığının hayvan modellerinde bir çok kullanılmaktadır.

Bir birleştirilmiş hücreli ve gen tedavisi bazlı stratejisinin geliştirilmesinde, bu hücrelerin, sağlık dikkatli bir şekilde in vitro bunların yaygın kullanımı öncesi ve özellikle in vivo uygulamalarda değerlendirilmiş önemlidir. Kavramının bir kanıtı olarak, biz bir yüksek içerik tarama (HCS) yaklaşımı kullanılarak hücre sağlık ve fitness genetik değişikliklerin sonuçlarını incelemek amacıyla tasarlanmış ve kontrol MSC hatlarının birden popülasyonları araştırdık. Genel olarak, HCS hücresel görüntü tabanlı yüksek verimli tarama 14 anlamına gelir. Bu tarama yaklaşımı mekansal çok düzeyde (gün milisaniye) (hücre içi hücre) ve temporal res hücresel fenotip bir nicel değerlendirmesini izinÇeşitli deneysel koşullar arasında lere. Hücre proliferasyonu, yeşil flüoresan protein (GFP), hücre ölümü ve hücre hareketi / göç: aşağıdaki parametreler üzerinde alt-tabaka tercih olası farklar girip Bu yaklaşım kullanılarak. Deneyler, 96-iyi hücre kültür plakası biçiminde tasarlanmıştır. Tek bir plaka içinde rutin lentiviral-transduced hücrelerin farklı MSC popülasyonları için her parametreye göre olası substrat ilgili farklılıklar araştırıldı ve orijinal ile mühendislik MKH'lerin olmayan transdüse MKH karşılaştırdık. Bu da doğrudan bir zaman atlamalı dijital görüntüleme gerçekleştirerek propidyum iyodür boyaması kullanılarak Ki 67 immün, ölü / canlı hücre canlılığı deneyi kullanılarak, hücre proliferasyonu gibi in vitro testlerin pil ve hücre davranışı farklı MSC alt tiplerinin sonuçları karşılaştırmak için bir araç temin . Bir de bireysel w toplanan klimalı ortam örnekleri üzerinde ELISA'lar gerçekleştirebilirsiniz bu HCS bir uzantısı olarakarşın kantitatif nörotrofik faktörlerin salgılanmasını tespit etmek için. Farklı MSC alt tipleri elde edilen koşullu ortam ayrıca salgılanan faktörler 11,23 biyolojik aktivitesini belirlemek için in vitro biyo-deneyler kullanılabilmektedir. HCS platformun Bu tür, aynı zamanda primer nöron kültürleri ve nöral kök hücre hatları 24 nörit büyümesinin in vitro ölçümü için kullanılabilir. Genel olarak, bizim sonuçlar genetiği değiştirilmiş MKH subpopülasyonunun olmayan değiştirilmiş MSC karşılaştırıldığında benzer davranışları görüntülenen gösterdi. hücre büyümesi ve hücre göçü üzerinde çeşitli kültür yüzeylerde etkisi dramatik MSC alt tipleri arasında farklı yanı sıra, kültür substratları değildi. Gibi, test hücre dışı matris yüzeyler bu farklı projelendirilmiş MSC hücre davranışı bu yönlerini modüle kritik bir rol oynamaya görünmedi.

Bu çalışma, ayırıcı analiz etmek için bir HCS sisteminin kullanımını gösterirHücre davranış t yönleri. Bununla birlikte, görüntü analizi ile ilgili sınırlamaları karşılaşmaya bir durum değildir. Floresan görüntüleri analiz ederken vesilesiyle, bu immunolabeled veya lekeli hücreler gibi pozitif lekeli / etiketli sayılır olacağını yukarıda doğru eşik değerini belirlemek için biraz zor oldu. Bu durumda, ilgili verevi en aza indirmek için, eşik değerlerinin belirlenmesi kontrolleri ile bir karşılaştırma (floresans görüntüleme için negatif kontroller birincil ya da ikincil antikor ihmal bütün işlem esnasında paralel olarak yapılmıştır) bağlı idi. Başka bir sınırlama zamana atlamalı sayısal görüntüleme kullanarak hücre göçü analizi sırasında karşılaşıldı. Bazı durumlarda, görüntü programı aslında sadece çok kısa bir mesafe giden bir hücre karşı bir hücrenin rastlantısal Brown hareketi arasında ayırt etmek mümkün değildi. Analiz yazılımı multip varlığını ayırt etmek mümkün değildi nerede ek sınırlamalar durumlarda belli oldubir-bir çok yakın le hücreleri. Analizi yerine tam otomatik analiz sırasında bu sınırlama gerekli manuel hücre seçimi üstesinden gelmek için. Hücre kaplama yoğunluğu, aynı zamanda, birbirinden ayrı olarak büyür hücrelerine karşın yığınlarda büyümesini daha fazla tercih kullanmaz hücre popülasyonları arasında hücre göçü veri eğriltme neden olabilir. Farklar Bu tür bir parçası muhtemelen hücre-hücre tercihleri ​​karşı hücre alt-tabaka bir yansıması içindedir.

Görüntü elde ve veri analizi gerçekleştirmek için bir HCS sistemi kullanarak verimli ve hızlı araçlar birden fazla hücre parametrelerini değerlendirmek için sağlar. Ayrıca, 30 farklı koşullar (6 yüzeyler ve 5 farklı MSC alt tipleri) için hızlandırılmış dijital videolar rutin çevre odasını kullanırken saat gün (48 saat) arasında değişen sürelerle elde edildi. Bu veriler, daha sonra, farklı ECM çeşitli hücre çizgileri boyunca hücre göçü oranlarındaki farklılıkları hesaplanması ve belirlemek için kullanılmıştırmoleküller.

Bu yazıda, hücre sağlığı ve fonksiyonlarını değerlendirmek için bir içeriği yüksek tarama platformu uygulanmasını sermiştir. Bu tip analiz daha yönlendirilmiş hücre büyümesini ve sinir yeniden oluşumu kolaylaştıran hücre türlerini ve aynı zamanda, polimer alt tabakaları tasarımı için rasyonel stratejiler geliştirilmesi için kullanışlıdır. Bu hücre nakli stratejilerini kullanarak in vivo klinik öncesi çalışmalarda önce geniş terapötik faktörlerin kök hücre tabanlı teslimat uygulaması yönünde önemli bir adımdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video makalede için yayın ücretleri Molecular Devices, LLC tarafından desteklendi.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırmanın finansmanı ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Malzeme Komutanlığı (Hibe hesap no. W81XWH-11-1-0700) ve Kök Hücre Araştırma Fonu tarafından sağlanmıştır. PAB ve EMP, Ames Laboratuvarı Yaz Lisans Laboratuvarı Stajlarının (SULI) alıcıları oldu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 kuyulu plakalarGreiner Bio One655090ImageXpress'te kullanılmak üzere seçilmiş 96 kuyulu plaka
Sığır serum albümini (BSA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)A9647
Tavşan anti-Ki67 antikoruAbcam (Cambridge, MA)Ab166671:200 seyreltme
Kollajen tip ISigma-Aldrich (St. Louis, MO)C7661Sıçan kuyruğundan
DAPIInvitrogen (Carlsbad, CA)D3571
Eşek anti-Tavşan Cy3Jackson İmmün Res Laboratuvarı (West Grove, PA) 711-165-1521:500 seyreltme
ECL (Entaktin-Kollajen-Laminin)Millipore / Chemicon (Temecula, CA)08-110
Fetal sığır serumu (FBS)Hyclone (Logan, UT)SH30071.03
At serumuHyclone (Logan, UT) SH3007403
EtanolKimya Mağazası (Ames, IA)12003510100%, 200 kanıt
FibronektinFisher Bilimsel (Hampton, NH)CB-40008
Iscove' s Modifiye Dulbeccos Orta (IMDM)Hyclone (Logan, UT)SH30396.03
KH < alt > 2 < / sub > PO < alt > 4< / alt >Fisher Scientific (Hampton, NH)P285PO < alt > 4< / alt> tampon
K < alt > 2 < <> alt > < >Fisher Scientific (Hampton, NH)P288PO 4 < / sub> tampon
L-GlutaminGibco / Invitrogen (Grand Island, NY)için 25030-081
Laminin (fare)Trevigen (Gaithersburg, MD)3400-010-01
Yetişkin C57BL / 6 farelerin fare MSC'leriGen Terapisi için Tulane Cent (New Orleans, LA)Kemik iliğinden izole
Genetik olarak değiştirilmiş MSC'ler (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/ GDNF)Bu hücreler önceki çalışmamızdan elde edildi: Ye ve ark. (hazırlık aşamasında)
Normal eşek serumu (NDS)Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) 017-000-121
Paraformaldehit (PFA)Fisher Scientific (Hampton, NH)O40420.1 M PO < alt > <4 / alt> tamponunda %4 PFA
Penisilin-StreptomisinSigma-Aldrich (St. Louis, MO)P0781
Fosfat tamponlu salin (PBS)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)P4417
Poli-L-lizinSigma-Aldrich (St. Louis, MO)P4707
Propidyum iyodür (PI)İnvitrojen (Carlsbad, CA)P1304MP
Triton X-100Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)X100
Tripsin% 0.05 (EDTA 1x)İnvitrojen (Carlsbad, CA)25300-054
Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortaİnvitrojeni (Carlsbad, CA)12440 ve ndash; 046
Hibridoma nitelikli FBSHyclone (Logan, UT)SH30396.03
At serumuHyclone (Logan, UT)SH3007403
ImageXpress MicroMoleküler cihazlar (Sunnyvale, CA)ImageXpress microYüksek içerikli tarama sistemi
MetaXpress 4.0Moleküler cihazlar (Sunnyvale, CA)MetaXpress 4.0Görüntü elde etme ve analiz yazılım
kollajen edilmiştir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
  2. Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
  3. Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
  4. Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
  5. Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
  6. Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
  7. Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
  8. Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
  9. Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
  10. Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
  11. Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
  12. Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
  13. Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
  14. Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
  15. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
  16. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
  17. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
  18. Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
  19. Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
  20. Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
  21. Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
  22. Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
  23. Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
  24. Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mezenkimal K k H crelerY ksek erikli TaramaLentiviral Vekt rlerBeyin T revli N rotrofik Fakt rGlial H cre T revli N rotrofik Fakt rZaman Atlamal G r nt lemePropidyum yod r BoyamaKi67 mm nlekelemeH cre Proliferasyon AnaliziH cre Migrasyon Analizi

İlgili makaleler