Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Özet

Embriyonik fare iç kulağından koklear eksplantların izolasyonunu ve kültürünü tanımlayan bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, kare dalga elektroporasyon yoluyla koklear eksplantlara gen transferi için bir yöntem gösteriyoruz. Gen transfer tekniği ile birleştirilmiş in vitro eksplant kültürü, araştırmacıların gelişim sırasında gen ekspresyonunu değiştirmenin etkilerini incelemelerini sağlar.

Özet

Corti'nin fare organında bulunan işitsel tüy hücreleri, ses bilgisini algılar ve merkezi sinir sistemine iletir. Mekanosensoriyel saç hücreleri, kokleanın bazal eksenine kadar uzanan bir sıra iç saç hücresi ve üç sıra dış saç hücresi halinde hizalanır. Burada tarif edilen eksplant kültür tekniği, koklear eksplantları embriyonik fare iç kulağından izole etmek ve korumak için etkili bir yöntem sağlar. Ayrıca, koklear eksplant kültürleri içindeki duyusal tüy hücrelerinin ve duyusal olmayan destekleyici hücrelerin morfolojisi ve moleküler özellikleri, in vivo olarak gözlemlenenlere benzer ve içsel hücresel ortamında incelenebilir. Koklear eksplantlar, hücresel spesifikasyon ve modellemede yer alan moleküler ve genetik yolakların tanımlanması ve karakterizasyonu için önemli deneysel araçlar olarak hizmet edebilir. Transgenik fare modelleri, gen ekspresyonu çalışmaları için etkili bir yaklaşım sağlasa da, önemli sayıda fare mutantı embriyonik gelişim sırasında ölür ve böylece gelişimsel fenotiplerin analizini ve yorumlanmasını engeller. Doğumdan önce ölen mutant farelerden alınan Corti organı, in vitro gelişimleri ve farklı faktörlere tepkileri analiz edilebilmesi için kültürlenebilir. Ek olarak, embriyonik koklear eksplantların ex vivo elektropoze edilmesi için bir teknik açıklıyoruz, bu da belirli gen(ler)i aşağı regüle etmek veya aşırı eksprese etmek ve potansiyel endojen fonksiyonlarını analiz etmek ve memeli koklear gelişimini etkilemek için belirli bir bağlamda spesifik gen ürününün gerekli veya yeterli olup olmadığını test etmek için kullanılabilir^1-8.

Giriş

Corti'nin memeli organı, iki tip mekanosensoriyel tüy hücresinin yanı sıra en az dört tip duyusal olmayan destekleyici hücre de dahil olmak üzere özel hücre tiplerinin bir mozaiğinden oluşur ve bu da onu proliferasyon, kader spesifikasyonu, farklılaşma ve modelleme gibi normal hücresel süreçleri incelemek için ideal bir model sistem haline getirir. Ek olarak, bu farklı hücre tiplerinin normal gelişimi, normal işitme fonksiyonu için çok önemlidir. Bu nedenle, gelişimlerini düzenleyen hem moleküler hem de hücresel faktörleri anlamak çok önemlidir. Bununla birlikte, fare kokleasının küçük boyutu ve erişilemezliği, gen ekspresyonu çalışmaları için özel bir zorluk teşkil etmektedir. Ayrıca, hücre kaderi spesifikasyonu ve modelleme olaylarının çoğu embriyonik zaman dilimlerinde meydana gelir ve çoğunlukla doğumdan önce tamamlanır. Bu nedenle, embriyonik zaman periyotlarında sinyalleşme olaylarının tanımlanması ve karakterizasyonu, koklear morfogenezin moleküler temeli hakkında bilgi edinmek için gereklidir.

Burada, embriyonik fare iç kulaklarından in vitro olarak sağlam koklea kültürü için bir yöntem gösteriyoruz. Bu tekniğin kullanılmasının ardındaki mantık, kültürlenmiş kokleaların moleküler ve morfolojik özelliklerini korumaları ve böylece potansiyel aday genlerin araştırılması ve koklear morfogenezde yer alan mekanizmaların araştırılması için değerli bir model sağlamasıdır. Transgenik fareler gen ekspresyonu çalışmaları için kullanılabilse de, spesifik gen fonksiyonlarını izlemek için genellikle bir in vitro sisteme ihtiyaç vardır. Ayrıca, transgenik fare embriyolarından koklear kültürler oluşturulabilir, böylece in vitro gelişimleri ve çeşitli çözünür faktörlere ve antagonistlere yanıtları incelenebilir. Bu protokolde 13. gündeki embriyolar (E13) kullanılsa da, E12 veya E14'ten erken postnatal iç kulaklara kadar olan kültürler benzer sonuçlar verebilir.

Kare dalga elektroporasyonu kullanılarak kültürlenmiş embriyonik koklear eksplantlarda da bir gen transfer tekniği sunuyoruz. Koklear eksplantların izolasyonunu takiben, koklear kanal içindeki tek tek hücrelerde ilgilenilen gen(ler)in DNA plazmitlerini eksprese etmek için elektroporasyon kullanılabilir. Bu teknik, hücresel fenotipin altında yatan moleküler yollar hakkında bilgi edinmek için transgenik fareleri kullanan çalışmalara tamamlayıcı bir yaklaşım olarak hizmet eder. Bu gen transferi yöntemi kullanılarak, embriyonik koklea içindeki çeşitli epitel hücre tipleri transfekte edilir, böylece tek hücre düzeyinde fonksiyon kaybı ve kazancı analizleri mümkün olur. Ayrıca koklear eksplant kültürlerinde elektrofizyolojik çalışmalar da yapılabilmektedir⁸. Bu in vitro elektroporasyon yöntemi nispeten basit ve anlaşılırdır, dokuya minimum hasar ile birleştiğinde, bu tekniğin hızlı bir şekilde genişlemesine neden olmuştur.

Protokol

NOT: canlı hayvanlar kullanarak tüm protokolleri gözden ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve resmi laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için yöntemler onaylı takip gerekir gerekir. Bütün tahlil temiz bir laminer akış tezgahı üzerinde, steril tekniği kullanılarak yapılmalıdır. Eldiven ve maske, istenirse, bu işlem sırasında giyilmelidir.

Embriyonik Fare İç Kulak 1. Diseksiyon

1. Corti eksplant kültürlerin organ için ayarlama:
   1. Yaklaşık 30 dakika, UV ışık yakarak laminer akış doku kültürü kapağı sterilize ve kullanımdan önce% 70 etanol ile bir yüzeyin dezenfekte edilmesi. Buna ek olarak, ince diseksiyon araçları ve otoklav yoluyla embriyo diseksiyon veya kullanımdan önce en az 20 dakika süreyle% 70 etanol iliklerine Sylgard kaplı yemekleri dahil olmak üzere tüm diseksiyon aletleri sterilize. Temiz bir laminer akış clea hava kurumaya yemekleri ve araçlar% 70 etanol dökün ve izinn tezgah kullanmadan önce.
   2. Hazırlama steril Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) / (4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit), HEPES 10x HBSS ve% 0.5% 10 eklenmesi ve yaklaşık pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve filtre sterilizasyonu ile (HEPES) karışımı 4 ° C'de, nihai çözelti saklayın. Daha iyi prosedür boyunca doku korumak için soğutulmuş HBSS / hepes çözeltisi içinde tüm diseksiyonları uygulayın.
   3. 15 ml'lik steril bir polipropilen tüp içinde taban membran matrisi bir 300 ul'lik bölüntü, steril (4 ° C) soğuk Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) 5 ml ilave etmek suretiyle taban membran matrisi ile kaplayın cam alt yemekler. Içeriğini vorteks ile karıştırın ve kasesinin ortasına kadar mevcut tüm kültür kapsar, böylece her bir kültür kabı merkezine bazal membran matris DMEM karışımından 150 ul ilave edin. Kullanımdan önce en az 45 dakika süre ile 37 ° C inkübatör yemekleri ve mağaza örtün.
   4. Th içine HBSS soğutulmuş 4-5 ml dökünSteril polistiren petri kapları REE ve kaput kapalı bırakın.
   5. DMEM 9 ml N2 takviyeleri 100 ul, 10 ug / ml Cipro ve FBS, 1 ml ilave edilerek steril bir 15 ml'lik polipropilen bir tüp içinde kültür ortamı hazırlanır.
2. Embriyoların izole edilmesi:
   NOT: embriyonik farelerden alınan koklear eksplantlarm Bu prosedürde, hasat iç kulaklar embriyonik gün (E) den gübreleme gün sonra 13 temporal kemik E1 ⁹ olarak kabul ediliyor. protokol de E12 dan E18 başlayan embriyonik fare iç kulakları ile kullanılabilir.
   1. CO ₂ ile zamanlanmış gebe fare Euthanize ve servikal dislokasyon veya uygun onaylanmış protokoller ile hayvan kurban. Doku kültürü odasında sterilite korumak için uzak laminer akış doku kültürü kaputu gelen euthanization yürütmek.
   2. Yukarı bakacak şekilde karın kağıt havlu üzerine ötenazi fare koyun ve% 70 etanol ile karın dezenfekte edin.
   3. Cildi kapma karın boşluğu açınBaşka bir el kullanılarak makas ile orta hat boyunca kavisli bir eliyle forseps ve kesme epidermis ve kas ile. Her iki tarafta iki dik kesim yapmak ve forseps ile bilateral uterin boynuz kaldırarak dikkatle rahim çekin ve bağ dokusu kullanılarak makas altından ayırmak.
   4. Laminer akışlı temiz bir tezgah soğutulmuş diseksiyon çözeltisi (HBSS / hepes karışımı) ve transfer ihtiva eden bir petri tabağına embriyonik zinciri yerleştirin.
   5. Plasenta dikkatlice embriyolar çıkarın ve diseksiyon çözeltisi içeren steril Petri kapları birine yerleştirin. Çözüm kanlı dönerse, yeni bir Petri kabı taşıyabilirsiniz.
      NOT: Bu noktada, embriyolar, bir Theiler evreleme kılavuzunu kullanarak sahnelenecek edilebilir.
   6. Temiz forseps veya makasla ile boyun bölgesinde kısma embriyolar başını kesmek ve soğutulmuş diseksiyon çözeltisi içeren taze Petri kabındaki başkanları yerleştirin.
3. İç kulak Diseksiyon:
   1. Yeri oSoğuk diseksiyon içeren bir steril sylgard çanak ne embriyo baş
   2. Çözelti. ~ 1.6x bir büyütmede bir mikroskop altında çalışarak, göz bölgesi (Şekil 1A) etrafında ya da daha yakın Minutien işaretçilerini yerleştirerek embriyo baş hareketsiz.
   3. Steril forseps iki çift kullanarak dikkatli bir şekilde cilt kaldırmak ve orta hat (Şekil 1B) boyunca sırt tarafında kafatasını açmak. Kranial kavite ve temporal kemiklerin içinde yer alan iç kulaklar, bu aşamada (Şekil 1C, D) tespit edilebilir beyni çıkarın. Genellikle, iç kulak çevresine mevcut kan damarı, astar, bu aşamada (Şekil 1D), iç kulak belirlemek için bir işaret olarak kullanılabilir.
   4. Dokuda altına forseps yerleştirerek ve soğuk diseksiyon çözüm içeren yeni bir çanak kafatası ve transfer tabanından iç kulak izole ederek zamansal kemiklerden iç kulak incelemek (Şekil 1E, F).

Corti Eksplant Kültürler Organ 2. Nesil

NOT: Bu gelişme aşamasında, doku kıkırdak ve kolayca forseps kullanılarak disseke edilebilir.

1. Orient ventral yüzü (Şekil 2A) yukarı bakacak ve yavaşça iç kulak (Şekil 2B) vestibüler bölümü ile Minutien pim keskin ucunu takarak iç kulak stabilize böylece iç kulak.
2. Kullanımı ultra ince forseps koklea (Şekil 2C) kıkırdak kaldırmak dikkatlice oval pencereye yakın forseps bir ucunu kullanarak ve bir kesi yaparak örten kıkırdak kesip.
   NOT: Bu örten kıkırdak bazen altına kazıma ile altta yatan koklear kanal gelen kıkırdak serbest bırakmak için kapalı forseps kullanmak yararlı olduğu durumda koklear kanal ile kaynaşmış olarak forseps kıkırdak içine çok derin takılı olmadığından emin olmak için önemlidir sKıkırdak, sert bir yere. Bu gelişme aşamasında, koklear spiral uzunluğu bir dönüş sadece dörtte üçü olduğunu.
3. Sonraki baz ya da çok apeks de ya koklear kanal tercih edilen bölgede forseps koyarak duyusal epitel maruz ve yavaşça koklea (Şekil 2B) çatısı çekerek.
   NOT: Kokleanın çatı o analizini engelleyen duyusal epitel maske gibi tamamen kaldırılmalıdır.
   NOT: duyusal epitel gözyaşı kolay olduğu gibi bu işlem nazikçe yapılmalıdır.
4. Koklear eksplant tabanı eşit düz böylece son adım olarak, dikkatle maruz duyusal epitel yatan bağ doku kaldırmak.
5. Forseps kullanarak iç kulak vestibüler kısmından disseke koklea izole edin. Bu, daha önce ya da aşama 2.4 (Şekil 2E) sonra gerçekleştirilebilir.
6. Bir bodrum membra içine disseke koklear duyusal epitel aktarınne matris kaplı kültür de bir 1,5 mm steril scooper (Şekil 2F) kullanılarak.
7. Orient epitel lümenal yüzeyi ile koklear eksplant yukarı bakacak ve dikkatle doku dümdüz ve hafifçe çanak ekleyerek taze kültür ortamı 150 ul ile değiştirmek için bazal membran matris-DMEM çözüm aspire. Bakım, her eksplant kaplamalı cam lamel iyi yapışır ve kültür ortamı içinde yüzen olmadığından emin olmak için alınmalıdır. Koklear eksplant zarar vermemek için cam kuyuya yapıştırılması sırasında forseps ucu kadar sivri olduğundan emin olun.
8. Yavaşça İstenilen bir zaman, in vitro olarak, genellikle 3-6 gün (DIV),% 5 _CO2 ile 37 ° C 'de, bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde bir steril 150 mm kültür çanağı ve yerine kültür kaplarına transfer. 1 DIV sonra, koklear eksplant kültürü çanak iyi yapışmış emin olmak için bir mikroskop altında kültürleri incelemek.
9. Sonrasıistenen zaman uzunlukları için in vitro cubation, kültürler imünohistokimya için işlenir.
   Not: eksplant kültürleri genellikle gelişim aşamasına, P0 eşdeğerdir 6 DIV için inkübe edilir. In vitro inkübasyondan sonra, kültürler, immünohistokimya gibi, daha aşağıda uygulama (Şekil 3B) için işlenebilir, RT-PCR, in situ hibridizasyon ve / veya Western blot.

3. Elektroporasyon aracılı gen transferi

1. Elektroporasyon için ayarlama:
   1. Otoklavda veya yaklaşık 20 dakika boyunca% 70 etanol içinde ıslatılarak bir 100 mm Sylgard kaplı cam tabak sterilize ve kullanımdan önce temiz bir tezgah içinde kurumaya bırakın.
   2. Uygun maksi veya Midi-prep kitleri kullanılarak seçim bir ifade vektörü DNA hazırlayın. Bu protokolde kullanılan ifade vektörleri pIRES2-Atoh1.EGFP ve pCLIG-NeuroD1.EGFP vardır. DNA nihai konsantrasyon steril DNA, en az 1 ug / ul olmalıdır /RNAse içermeyen su.
2. Embriyonik koklear eksplantlarından içine DNA electroporating:
   1. Taze 100 mm Sylgard kaplı çanak plazmid DNA çözeltisinin 10 ul ekle ve DNA çözeltisi (adım 2.5 de elde edilmiş), tam kesilmiş koklear eksplant aktarın.
   2. Çanak düzlemine dikey olacak şekilde yukarı bakacak şekilde epitelyum lümenal yüzeyi ile hafifçe koklea yatırın.
   3. Duyusal epiteli ve koklea tabanına bitişik bulunan pozitif raket (anot) doğru negatif kürek (katot) ile koklea iki tarafında elektrot kürekler yerleştirin.
      Not: DNA, negatif yüklü olduğu için, pozitif elektrot ve duyu epitel bitişik sonda katot ucuna yerleştirilerek negatiften göç; DNA, çoğunlukla duyusal epitel yüzeyine geçer.
   4. Elektro-kullanma, 24 mV 9-10 darbeler teslim, t ayak pedalı ile 30 msn darbe süresiO Electroporator ve ardından Electroporated cochlea'ya sıcak kültür ortamı 100 ul ekleyin.
   5. Tekrar tüm koklear eksplant ve ilgi tüm genlerin DNA için 3.2.1-4 adımları ve (adım 2.7) kaplama için bazal membran matris kaplı çanak içine electroporated cochleae aktarın. Daha sonra, bağışıklık kimyası için işlenecektir arzu edilen bir zaman uzunlukları için 37 ° C,% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde kültür Electroporated cochleae.
      NOT: CD1 fare (yaklaşık 8-12 yavru) bütün bir çöp gelen koklea, izole microdissected, Electroporated ve <4 saat içinde kaplama olabilir.

4. Analiz Koklear Eksplantın Kültürlerin

Not: kültürleri genellikle gelişim aşamasına, P0 eşdeğerdir 6 DIV için inkübe edilir. In vitro inkübasyondan sonra, kültürler sabitlenmiş ve immünolojik hücre kimyası için işlendi.

1. Inc istenilen uzunlukta sonraubation, kültür ortamı çıkarın ve hızlı bir şekilde fosfat-tamponlu salin (PBS) 'de koklear eksplant yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (PBS içerisinde hazırlanmıştır)% 4 paraformaldehid içinde inkübe edilir.
2. 15 dakika boyunca üç kez ekleyerek PBS ile fiksatif yıkayın ve PBS içinde durulayın.
3. % 10 keçi serumu içeren PBS-T ile bloke önce 30 dakika için PBS-T (PBS +% 0.5 Tween) ile geçirgenliği.
4. 4 ° C de bir gece boyunca,% 1 keçi serumu ile PBS-T ile primer antikor ihtiva eden birincil antikor çözelti içinde inkübe edilir.
5. Uygun Alexa-konjuge sekonder antikor ilave edilmeden önce PBS-T her biri 15 dakika kullanılarak oda sıcaklığında koklea üç kez yıkayın.
6. Koklear eksplant cam lamel kültüre olduğundan, çanak lamel izole ve bir slayt monte edilerek tek tek ele alınabilir. Bu, oda sıcaklığında en az 1 saat için çözücü, OS30 kültür çanağı ıslatılmasıyla elde edilebilir. Steril jilet kullanarak, d lamel ayırmakish ve bir slayt monte ve bir floresan mikroskop altında görselleştirmek.

Sonuçlar

Embriyonik iç kulaklardan kokleayı izole etmek ve duyusal epiteli ortaya çıkarmak için mikro diseksiyon yapmak için bir yöntem açıklıyoruz. Diseke edildikten sonra, sağlam bir koklear kanal olarak kaplanabilir ve kültürlenebilir (Şekil 3) ve immünohistokimya ile analiz edilebilir. Kültürlenmiş koklear eksplantlar, çeşitli çözünür faktörlerin ve farmakolojik ilaçların koklear gelişim üzerindeki etkisini incelemek için yararlı bir test sağlar. Koklear eksplantların diseksiyonunu takiben, ilgilenilen genler...

Tartışma

Dahil olmak üzere, bir fare, iç kulağın membranöz labirent içindeki tüm hücreler duyusal duyunun ve spiral gangliyon nöronlarının her E8 ^10-14 civarında, ektodermin Beyin bitişiğinde yer otocyst placodally türevi elde edilir. E11 içinde otocyst ventral bölgesi koklear kanal oluşturmak üzere uzanır ve geliştirme devam ederken haline koklea içindeki epitel hücreleri yanı sıra otocyst diğer bölgelerinde bir grup, daha sonra ortaya çıkaracaktır prosensory yamalar olarak belirtilen mechanosensory saç hücreleri ve ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HBSS	Gibco	14065-056
HEPES	Gibco	15630-080
Dulbecco' s Modifiye Orta	Gibco	12430-054
Fetal sığır serumu	Gibco	10082
N-2 Takviyesi (100x)	Gibco	17502-048
Siprofloksasin hidroklorür	Cellgro	61-277-RF
Cam Tabak 60 mm	Kimble Chase	23062-6015/23064-6015
Cam Tabak 100 mm	Kimble Chase	23064-10015 / 23062-10015
Minutien pimleri	Güzel Bilim Araçları	26002-15
Dumont #5 forseps	Güzel Bilim Araçları	11251-10
Darbe üreteci	Protech International Inc	CUY21Vivo-SQ
Cam alt kültür kapları	MatTek	P35G-0-10-C
Matrigel matrisi	BD Biosciences	356237
Kültür kabı, 60 x 15 mm	Becton Dickinson	353037
Doku kültürü kapları	Greiner Bio-one	639160
Fosfat tamponlu tuzlu su	Gibco	10010-023
OS-30	Dow Corning	4021768
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01
Konik tüpler, 15 ml	Greiner Bio-one	188261
Miyozin 6	Proteus Biyobilimler A.Ş	25-6791
Miyozin 7a	Proteus Biyobilimler A.Ş	25-6790
TuJ1	Sigma	T2200