Doğru Algılama Fare B Lineage Hücreleri IgE-ifade

Özet

Farelerde sınıf anahtarı rekombinasyonunun in vitro analizi, B hücrelerinin yüzeyindeki Fc reseptörlerine bağlı sitofilik IgE molekülleri nedeniyle zordur. Sitoplazmik floresan boyama için fiksasyon ve geçirgenlikten önce yüzeye bağlı IgE'nin tripsin aracılı bölünmesini kullanarak IgE tespiti için bir yöntem tarif ediyoruz.

Özet

B lenfosit immünoglobulin ağır zinciri (IgH) sınıf anahtarı rekombinasyon (CSR) ilk olarak, IgM IgA, IgE ve IgG olarak diğer IgH izotiplerinden geçer ifade edildiği bir süreçtir. In vitro IgH CSR ölçümü, moleküler ve hücresel immünoloji yönlerine DNA yeniden birleştirmesinden ve onarım kadar biyolojik süreçlerin bir dizi çalışma için bir temel yöntem. In vitro CSR deney aktive B hücreleri üzerindeki akış sitometrik ölçüm yüzey Ig ifade içerir. IgA ve IgG alt sınıflarının ölçümü kolay olmakla birlikte, bu yöntemle IgE ölçümü, çözünür IgE FcεRII bağlanma nedeniyle sorunludur / CD23 aktive B hücrelerinin yüzeyi üzerinde ifade edilmiştir. Burada kültür CSR geçirmiş fare B hücreleri, IgE üreten doğru bir şekilde ölçülmesi için benzersiz bir işlem tarif eder. yöntem cy ile sağlanan B tipi hücrelerin IgE üreten tespiti için izin hücre yüzeyleri üzerindeki IgE-CD23 komplekslerinin tripsin-sebepli bölünme dayanırtoplasmic lekelenmesi. Bu prosedür IgE KSS akış sitometri analizi için uygun bir çözüm sunuyor.

Giriş

Fare ve insan immünoglobulin ağır zinciri (IgH) sınıf anahtarı rekombinasyon (CSR) sırasında, IgH, sabit bölge ekzon (Cμ) silindi ve aşağı doğru sabit bölge eksonların çeşitli kümelerinin bir (Cı _lH ler) (örneğin, Cγ değiştirilir μ Ig sınıflarına (örneğin, IgG, IgE ya da IgA) üretimine IgM üretimi ile ilgili bir anahtar elde Cε ve Ca'sına). CSR _CH s, ¹ her bir grubu için 5 'bölgesinde yer 1-10 kb sekansları anahtarı (s) bölgeleri içinde gerçekleşir. Aktivasyon Bağlı Sıtıdın Deaminaz (AID) enzim sitidinin deaminasyon etkinliği yoluyla CSR başlatır.

IgE allerjik hastalık ² anahtar arabulucu ve IgE üretilen ve atopik hastalığı için yeni tedavi yaklaşımları kapılarını açabilir düzenlenir nasıl büyük bir anlayıştır. Farelerde ve insanlarda olarak IgE, en sıkı bir şekilde düzenlenmiş Ig izotiptir. IgE normal tim düzeyleri binlerce tespit edilires diğer IgH daha az ³ isotypes, ama çok hastalık durumlarında ⁴ yükselmiş olabilir. Bununla birlikte, IgE CSR tam olarak anlaşılamamıştır. B hücrelerinin in vitro aktivasyonu, IL-4, anti-CD40 veya LPS ile kombinasyon halinde her iki IgG1 ve IgE ⁵ CSR indükler kullanılmıştır. Aktive B hücreleri çözünebilir IgE CSR sonra kültür salgılanan bağlayan düşük afiniteli IgE reseptörü FcεRII / CD23 ^2,6, ifade eder. Akış sitometrisi ile analiz, bu nedenle, reseptör bağlı IgE lekesi ile B hücreleri benzer endojen IgE ⁷ sentezleyen B hücreleri için. O fare B biliniyor olsa da hücreler IgG1 sınıf anahtarlama ölçümü ile müdahale görünmüyor deneyimlerimiz düşük afinite IgG reseptörü FcγRIIB1 (CD32) ^8, ifade eder. Kültür içinde, B hücresi aktivasyonu sonrası IgE geçiş ölçüm Ancak, spesifik olmayan yüzeyine bağlı IgE analizi gizleyebilir. Yaygın boyama yöntemleriyle olmayan IgE ifade eden hücreler IgE için pozitif leke.

Burada özetlenen fareler ⁹ arası gerçek IgE ifade B hücreleri KSS tahlilleri yapmak ve tespit etmek için kullanılmıştır bir stratejidir ^{- 11.} Tripsin ile aktive B hücrelerinin tedavisi, ortak bir laboratuar reaktif protein sindirimi, cytophylic ve membran hem de bağlı yüzey Ig kaldırır. Sitoplazmik IgE için sonraki permeabilization ve boyama, böylece gerçek IgE üreten hücreleri ortaya koymaktadır.

Protokol

NOT: Burada açıklanan tüm deneyler Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) kurallarına uygun olarak ve Hayvancılık Araştırma Hastanesi Çocuk (ARCH), Boston, Mass tarafından onayladı.

Reaktifler 1. Hazırlık

1. 1,000x, IL-4 Stok: H _2, O ya da% 0.1 bovin serum albümini (BSA) içinde 20 ug / ml olacak şekilde seyreltin, IL-4, sitokin. -20 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine ve saklamak için 200 ul alikolar içinde dağıtın.
2. 1,000x anti-CD40: 4 ° C 'de, 1.0 mg / ml arasında, mağazada üreticisinden elde edilir.
3. B hücre uyarılmasını ortamı: RPMI-1640 ortamı içinde 425 ml'lik, ekleme 75 taze çözülmüş fetal buzağı serumu mi (FCS), 1.0 M HEPES tamponunda, 5 ml L-glutamin stokunun 10 mi, 5 ml Penisilin: Streptomisin stoku, 5 2-merkaptoetanol mi Asgari Temel Ortam Aslî Olmayan Amino Asitler (MEM-NEAA) ve 3.5 ul. Bir haftaya kadar 4 ˚C Ortamı tutun. IL-4 (20 ng / ml) ve anti-CD40 (1.0 ug / ml), kullanılmadan hemen önce eklemesadece gerekli ortamın hacmi.
4. % 2 FCS-FACS Tampon: 1x PBS 490 ml FCS, 10 ml ilave edilir. 4 ° C'de tutun.
5. 2x tripsin-EDTA çözeltisi: 1x PBS, 20 ml 10 x tripsin-EDTA stok çözeltisi (5.0 gr, tripsin, litre başına 2.0 g EDTA) 5 ml seyreltin. Mağaza tripsin-EDTA 2x 4 ° C'de alikotları çalışma. Kullanmadan önce oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
6. Cenin buzağı serumu: en fazla iki hafta boyunca 4 ° C'de eritilmiş FCS tutun. Sitoplazmik boyama prosedürü önce buz 15 dk yerleştirin.
7. Nötr-tamponlu formalin:% 10 formalin solüsyonu (% 3.7 paraformaldehid) hazırlayın. Formalin toksik ve uygun KKD giyerek bu nedenle laboratuar davlumbaz altında tutun. Bir kimyasal depolama kabini oda sıcaklığında saklayın formalin.
8. Metanol: -20 ° C'de saklayın mutlak metanol (% 100) hücreleri geçirgenleştirildi hazır olana kadar. Bu, metanol yanıcı ve uygun bir dondurucuda saklanabilir gerektiğine dikkat ediniz.

2.Saflaştırılması ve B hücrelerinin aktivasyonu

1. Taze hasat fare dalak kaynaktan, dikkatli bir şekilde 3 ml lik bir enjektör pistonuna sahip 70 mikron hücre süzgecinden organı basarak tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. 15 ml konik santrifüj tüpü içinde, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de 1x 10 ml PBS hücrelerin ve santrifüj toplar.
2. 5 dakika boyunca alyuvar parçalanması Tamponu, 1 ml yüzer madde ve tekrar süspansiyon pelet süzün. 5 dakika boyunca 300 xg'de 13.5 1x PBS ml ve santrifüj ile nötralize edin.
3. (İsteğe bağlı) Manyetik üreticinin talimatlarına göre MACS arıtma protokolü takip edilerek, boncuklar, anti-CD45R (B220) ile B hücreleri -etiketli ayırın.
4. 37 ° C 'de, IL-4 (20 ng / ml) ve 5 gün boyunca bir anti-CD40 (1.0 ug / ml) ihtiva eden ısıtılmış B hücre uyarılmasını ortam içinde 1.0 x 10 ⁶ hücre / ml'de, saflaştırılmış B hücrelerini stimüle eder. 6 oyuklu bir kültür plakasına (4 mL) içinde 2 kuyu ayrılmıştır kültür 8 ml ile başlar.
5. Cultu edin1.0 x 10 ⁶ hücre / ml'de korumak için günlük olarak tekrar. Diğer kuyulara bölme ve taze IL-4 ve anti-CD40 ihtiva eden B hücre uyarılmasını ortamı ile kültür seyreltilerek konsantrasyonu ayarlayın.

3. tripsinizasyonu, Fiksasyon ve Permeabilization

1. Trypsinization
   1. 5 dakika boyunca 300 xg'de, 15 ml konik tüp içinde santrifüj kültür hücrelerinin kadar 1.0 x 10 ⁷ toplayın, ve süpernatant süzün.
   2. Hücre toplama ortamından artık proteinin ayrılması için 10 ml PBS ile yıkayın. Santrifüj adımı tekrarlayın ve süpernatant süzün.
   3. (Yaklaşık 100 ul) boşaltılarak sonra rezidüel hacim hücre pelletini.
   4. Dikkatlice hücreler, oda sıcaklığında,% 0.1 (2x) tripsin-EDTA, 800 ul ilave edin. Konik tüp tarafında aşağı 45 ° açıyla yavaşça koyun.
   5. Tüp kapatın ve sıvı tüp 5-6 kez uzunluğu boyunca uzanan bu yüzden tüp eğerek hafifçe karıştırıns. Bir tel, beyaz bir çökelti çözeltisi içinde meydana gelebilir. Bir dakika altındaki trypsinization zamanı sınırlayın.
   6. Soğuk FCS, 1 ml tripsinizasyon reaksiyonu söndürün. Hemen soğuk PBS 10 ml ilave etmek suretiyle FCS ile seyreltilir.
   7. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj, ardından süpernatan süzün ve buz tüpleri döndürür.
2. Tespit
   1. Boşaltılarak sonra rezidüel hacim hücrelerin tekrar. Gerekirse, soğuk PBS ile 100 ul hacmi getirmek.
   2. Bir çeker ocak içinde, hücrelere% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi 800 ul ve yukarı ve aşağı pipetleme ve. Tüp formalin ilavesi üzerine sıcak olacak. 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
3. Permeabilizasyon
   1. Hafif sallayarak hızında bir tezgah üstü vorteks karıştırıcı ayarlayın.
   2. 10 ml'lik bir serolojik pipet içine soğuk (-20 ° C) metanol içinde 9 ml çizin.
   3. Vorteks mikser üzerinde hücreleri içeren tüp tutun ve yavaşça sallıyor başlangıçg kadar hücre.
   4. Tüp hala çok titriyor metanol sürekli karıştırma olduğunu iken hücreleri üzerine damla damla düşer, böylece tüp soğuk metanol ekleyin. Metanol ilk 2 ml sonra dağıtma hızı yavaş bir akışla kadar arttırılabilir.
   5. 30 dk permeabilization tamamlamak için tüp buz üzerinde bekletin. Seçenek olarak ise, hücreler, bir aya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

IgG1 ve IgE sınıf değiştirme 4. Floresan Boyama

1. Santrifüj 5 dakika boyunca 300 xg'de örnek ve metanol çözüm süzün. Beyaz bir çökelti hücreleri ile pelet olabilir.
2. 5 dakika Hücreleri yıkamak için 300 x g'de oda sıcaklığında PBS 1x ve santrifüj 10 ml ilave edilir. Kez tekrarlayın. Not: oda sıcaklığı PBS ile pelet yıkanması adım 4.1 sonra oluşabilecek ekstra çökelti çözer.
3. % 2 FCS-FACS tamponu 10 ml ek yıkama yapın.
4. Yuvarlak tabanlı plaka 96 çukurlu numuneleri dağıtmave 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Süpernatant süzün ve buz üzerinde tabak koydu.
5. Aşağıdaki antikor seyreltmeleri ile oyuk başına% 2 FCS-FACS tamponu 60 ul Leke: Anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-lgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP Cy5.5 @, 1: 200
6. Boyama 5 dakika sonra, 300 x g, 5 dakika boyunca% 2 FCS-FACS tamponu ve santrifüj 150 ul plakayı yıkayın.
7. 5 ml'lik bir FACS tüpü içine, bir 40 um naylon hücre süzgecinden% 2 FCS-FACS tamponu ve pipet 400 ul içinde süspanse.

5. Aşağıdaki Yolluk Strateji kullanın:

1. FSC / SSC arsa (Şekil 1) bulunan patlatma lenfosit nüfus CD45R (B220) pozitif hücreleri izole.
2. B220 pozitif hücrelerden, ilgili popülasyonları ortaya IgE ve IgG1 arsa kullanın.

Sonuçlar

Bu prosedür başarıyla fare B hücrelerinde IgE CSR çalışma uygulamaya konmuştur. Daha önce tarif edildiği gibi ¹¹ CSR ölçüm etkinliği tespit etmek için, anti-CD40 ve IL-4 ile birlikte fare dalak B hücreleri stimüle. Stimülasyon beş gün sonra, hücreler toplandı ve protokol floresan-etiketli IgM, IgG1, IgE ve B220 (CD45R) antikorlar ile, yukarıda tarif edilen ve lekeli kullanılarak işlenmiştir. (Şekil 1), IgE + hücrelerin net bir nüfusu temiz tripsin tedavi (Şekil 2a) olmadan ay...

Tartışma

Anti-CD40 ve IL-4 ile kültürde fare dalak B hücreleri uyarımı IgG1 ve IgE ^5, T yardımcı tip 2 _(Th2) etkileşimi teşvik edici sınıf değiştirme simule eder. B hücreleri, toplam splenositler ¹² ya da saflaştırılmış ve splenik B hücrelerinin ¹¹ bağlamında CSR etkinleştirilebilir. Protokol (adım 2.3) de belirtildiği gibi, B hücresi zenginleştirme isteğe bağlıdır, ve yararlı olurdu olmadığını belirlemek için deneyci takdirine bağlıdır. CD45R (B220) kullanılarak B hücrelerinin pozitif...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anti-Fare IgE FITC	BD Pharmingen	553415	klonu R35-72
Sıçan Anti-Fare IgG1 PE	BD Pharmingen	550083	klonu A85-1
Metanol	BDH	BDH1135-4LP	-20 ve derecede tutun; C
Falcon Hücre Süzgeci 40 & m Naylon	Corning	352340
Falcon Hücre Süzgeci 70 & m Naylon	Corning	352350
Anti-Hu / Mo CD45R (B220) PerCP-Cy5.5	eBioscience	45-4052-82	klon RA3-6B2
anti-Fare / Sıçan CD40	eBioscience	16-0402-85	klon HM40-3
RPMI Orta 1640	Gibco	11875-093
HEPES (1M)	Gibco	15630-080
MEM-NEAA (100x)	Gibco	11140-050
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (10x)	Lifetechnologies (Corning)	46-013-CM
MACS CD45R (B220) mikro boncuklar	Miltenyi Biotec	130-049-501
MACS arıtma kolonu	Miltenyi Biotec	130-042-401
IL-4	PeproTech	214-14	Suda veya% 0.1 BSA
Formalin Çözeltisi, Nötr Tamponlu,% 10	Sigma Aldrich	HT501128-4L
Tripsin-EDTA Çözeltisi (10x)	Sigma Aldrich	T4174-100 ml	5.0 g Tripsin, 2.0 g EDTA• Litre başına 4 Na% 0.9 NaCl
Penisilin-Streptomisin	Sigma Aldrich	P0781-100 ml	10.000 U Penisilin; 10 mg / ml Streptomisin (100x)
L-Glutamin 200 mM	Sigma Aldrich	G7513
2-merkaptoetanol (% 99)	Sigma Aldrich	M6250-100 ml
Kırmızı hücre lizis tamponu	Sigma Aldrich	R7757
Sıçan Anti-Fare IgM RPE/Cy7	SouthernBiotech	1140-17	klon 1B4B1
HyClone Fetal Buzağı Serumu	Termo	SH30910.03
B hücreli Stimülasyon ortamı			B hücre stimülasyon ortamı, fetal buzağı serumu (%15), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2.0 mM L-glutamin,   1x Penisilin-Streptomisin (Penisilin: 100 U/ml, Streptomisin: 100 & mikro; g / ml), Beta-merkaptoetanol (7 & mikro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) ve anti-CD40 (1 & mikro; g/ml)