Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

10.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52267

⸱

29 Ocak 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacological and Biomolecular Sciences, Università degli Studi di Milano, 2San Raffaele Scientific Institute and Vita-Salute University, 3CEND Center of Excellence in Neurodegenerative Diseases, Università degli Studi di Milano

Bu makalede

Özet

Bu makale, bir sinaptobrevin2-pHluorin yapısı ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu kullanarak nöroblastom hücrelerinde nörotransmitter vezikül dinamiklerini araştırmak için bir yöntem sağlar. Görüntü işleme ve veri analizi için geliştirilen strateji de raporlanmaktadır.

Özet

Sinaptik veziküller füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca kimyasal sinaps nörotransmitterlerin bırakın. Gerçek zamanlı olarak sinaptik aktivite izleme ve tek kese düzeyinde egzo-endositozun farklı adımlar diseksiyon sağlık ve hastalık sinaptik fonksiyonlar anlamak için çok önemlidir.

Doğrudan sinaptik veziküllerin ve Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (TIRFM) hedeflenen pH duyarlı problar vezikül dinamiklerini takip etmek gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan genetik olarak kodlanmış. toplam iç yansıma tarafından oluşturulan kaybolan alan sadece egzo-endositoz süreçler gerçekleşecek tam olarak nerede, hücreler uygun olan cam kapak üzerinde ince bir tabaka (<150 nm) yerleştirilen fluorophores heyecanlandırmak olabilir. Elde edilen yüksek kontrastlı görüntüler ideal izleme veziküller ve füzyon olayları kantitatif analiz için uygundur.

Bu protokolde, SH-SY5Y insan neuroblastoma hücreleri nedeniyle düz yüzeyin, TIRFM ile tek vezikül seviyesinde nörotransmitter salimim çalışmak için değerli bir model ve dağılmış veziküllerin varlığı olarak önerilmektedir. Yapışkan hücreler gibi SH-SY5Y büyüyen ve synapto-pHluorin ile transfekte edilmesine yönelik yöntemler TIRFM ve görüntüleme gerçekleştirmek için teknik olarak, hem de temin edilmiştir. Son olarak, seçmek saymak ve tam hücre ve tek kese seviyelerinde füzyon olayları analiz etmeyi amaçlayan bir strateji sunulmaktadır.

Görüntüleme işlemi ve veri analizi yaklaşımı doğrulamak için, pHluorin-etiketli kesecikler dinamikleri dinlenme altında analiz edilir ve koşulları (potasyum konsantrasyonları depolarizan) uyarılır. Membran depolarizasyon füzyon olgulannın sıklığını arttırır ve bütün hücre kaydedilen net floresans sinyalinin paralel bir zam neden olur. Tek vezikül analizi füzyon olayı davranışı (yüksek tepe yükseklik ve genişlik) değişiklikleri gösterir. Bu veriler inci öneririzpotasyum depolarizasyon bir büyük nörotransmitter salınımını uyarır, aynı zamanda vezikül füzyon ve geri dönüşüm mekanizmasını değiştiren sadece.

Uygun floresan prob ile, bu teknik yapıcı ve uyarımlı sekresyon mekanizmaları incelemek için farklı hücresel sistemlerde kullanılabilecektir.

Giriş

Nöronlar arasındaki sinaptik iletim Kimyasal sinir sisteminde iletişimin önemli bir mekanizmadır. Bu presinaptik yerinde vezikül füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca nörotransmitterlerin salınımı üzerine dayanır. Vezikül dinamikleri katılan proteinlerin çoğu tespit edilmiştir; Ancak, fenomen kendi özel katkısı 1 netleştirilmelidir.

Bizim anlayış kısmen egzo / endositoz için en yaygın kullanılan testler her zaman en uygun olmadığı gerçeği ile sınırlıdır. Çeşitli vezikül füzyon ile ilgili çalışmalar ve dinamikleri elektrofizyolojik teknikler güveniyor. Bu teknik, optimum zamansal çözünürlük sağlar ve plazma membran veziküller ilk füzyon araştırmak için mükemmel ama presinaptik işlevini destekleyen yatan moleküler olayların birçok algılayamıyor. Elektron mikroskobu, diğer tarafta, en iyi morphologica sağlarNumuneler analiz edilmek üzere tespit edilmelidir, çünkü her tekil adım, ancak olayın dinamik yönü l açıklama yakalanan edilemez.

floresan moleküler sondalar geliştirme 4-6 gelişmeler ile birlikte yeni optik kayıt teknikleri 2,3, gelişi, böylece sinaptik yapısı ve işlevi hakkında bilgi yeni seviyeleri sağlayan, canlı hücrelerde ekzositik süreçlerin görselleştirme sağlar.

İlk çalışmalar sömürülen aktivite bağımlı stiril boyalar (FM1-43 ve ilgili organik boyalar) 7,8. Devlet-sanat görüntüleme teknikleri lümen veziküller proteinler 9 gergin Yeşil Floresan Protein (GFP) (pHluorin) pH-duyarlı varyantlarını kullanır. Bu sondalar, normalde düşük olması nedeniyle lümen pH veziküllerde mevcut olduğunda kapatılır. Plazma membranı ile füzyon sonra, kese iç nötr hücre dışı alanı, pH maruz aniden artar pHluorin proton-bağımlı söndürme rahatlatır ve floresan sinyal hızla görünür. PHluorin değişim floresan artar izleyerek, füzyon olayı daha hızlı olduğu için, membran vezikül füzyon ölçülerek analiz edilebilir. Yüzey pHluorin-etiketli moleküller endocytosed olduğundan, floresans sinyali, daha sonra, bu nedenle, aynı yapı vezikül 9 dönüştürülmesi izlemek için de kullanılabilir, bazal seviyeye döner.

Vezikül etiketli pH sensörü sadece gerçekten plazma zarı ile sigorta bu keseciklerin görselleştirme sağlarken, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte görüntüleme ayrıntıları egzo / endositik süreçlerinde adımları açıklamak için gereklidir. Gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan optik bir tekniktir toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM), floresan mikroskobu 10 bir uygulamadır.

"> Toplam iç yansıma ışık yolu kritik açıdan daha büyük bir olay açısı ile cam kapak-kayma ulaşır cam kapak-slip ve örnek. Arasındaki arayüzde meydana, uyarma ışık numune içine iletilir ama değil Tamamen geri yansıtılır. Bu koşullar altında, ara yüzeyde genliği azalan bir ışık dalga formları altında ve kaybolan alan yoğunluğunun bir penetrasyon derinliği ile (arabiriminden mesafe ile katlanarak çürürken. daha az bir optik yoğunluk (örnek) ile ortam içinde ilerleyen daha uzakta sınırından bu GFP yapılar ile transfekte edilen hücrelerde. değil iken, yaklaşık 100 nm) kapak-slip en yakın olan sadece flüoroforlar uyarılırken, bu derinlik, plazma zarı üzerinde ifade edilen proteinlerin veya veziküler yapılarda tekabül Hücre iç flüoroforlar heyecanlı olamaz gibi, arka plan floresan minimize, ve bir görüntü çok yüksek sinyal / arka plan sıçan olduğunu. yaklaşanio 11 oluşturulur.

Birkaç özellikler veziküller dinamikleri izlenmesi için seçim TIRFM tekniği yapmak. Mükemmel kontrast ve yüksek sinyal-gürültü oranı tek kesecikler kaynaklanan çok düşük sinyallerin algılanmasını sağlar. Her çerçeve çip tabanlı görüntü elde etme derece dinamik süreçleri tespit etmek için gerekli zamansal çözünürlük sağlar. Son olarak, numune başka düzlemde ışık hücrelerin minimal maruz güçlü fototoksisite azaltır ve uzun ömürlü time-lapse kayıt 12 sağlar.

Veri analizi, bu tekniğin en zorlu ve önemli yönü kalır. vezikül füzyon izlemek için en basit yol, zaman 13 üzerine, hücre yüzeyinde raportör flöresan protein birikimini ölçmektir. Yanı sıra füzyon artar, net floresan sinyal arttıkça. Bununla birlikte, bu yöntem özellikle büyük hücreler ve dinlenme koşulları işlemi göz ardı edilebilir,endositoz ve photobleaching süreçleri nedeniyle kese ekzositoz için floresan yoğunluğu artışı telafi çünkü. Alternatif bir yöntem, tek tek her füzyon olayı 14 takip etmektir. Bu ikinci yöntem çok hassastır ve füzyon mekanizmaları hakkında önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Tamamen otomatik prosedürler veziküller takip etmek ve onların floresan sinyallerin dalgalanmasını kayıt her zaman mevcut değildir çünkü Ancak, tek olayların manuel seçimi gerektirir. Vezikül dinamikleri Gözlem yüksek frekansta örnekleme hücreleri gerektirir. Bu pek elle analiz edilebilir veri büyük miktarda üretir.

Bu çalışmanın her iki öneri, laboratuarda geliştirilmiş bir işlem verilerini analiz etmek için SH-5YSY nöroblastom hücre çizgisinde taban ve uyarılmış olan nörotransmitter salimim izlenmesi için TIRFM görüntüleme tekniği optimize etmek ve tanımlamak için, adım adım bir Bütün hücre ve tek vezikül seviyelerde aktivite göstermez.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu

  1. SH-SY5Y hücre kültürü
    Not: denemeleri, insan nöroblastom SH- SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15 kullanılarak yapılmıştır. SH-SY5Y hücreleri değişken kümeleri ve diğer yapışıcı hücreler bir karışımı olarak büyür. Sıkıca TIRFM için çok önemlidir cam kapak, bağlı büyümeye hücreleri için protokol (hücre yoğunluğu, yarma oranı, vb.) Rapor talimatları izleyin.
    1. Başlamadan önce, laminer akış biyo-güvenlik kabini altında, steril fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) ve kültür ortamının elverişli hacmi oluşturmak.
      1. 150 mM NaCI, 24 mM fosfat tampon maddesi, pH 7.4 konsantrasyonları ile PBS, 50 ml olun. Çözüm Filtre.
      2. Yüksek glukoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml), L-glutamin (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) hücre ortamı 50 ml yapmak 2 mM) vesodyum piruvat (1 mM). Çözüm Filtre.
    2. Tam büyüme ortamı çıkarın ve 3 ml PBS ile hücrelerin yıkayın.
    3. 37 ° C'de 5 dakika boyunca (6 cm Petri için)% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit, 2 ml (EDTA) ile inkübe hücreleri,% 5 CO2 ve pipet kullanarak hücreleri ayırmak.
    4. DMEM 2 ml ilave etmek suretiyle deaktive tripsin ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır.
    5. Tek bir hücre süspansiyonu içine hücreleri dağıtmak için aşağı yeterince Süpernatantı pelet DMEM 1 ml ekleyin ve çözüm yukarı pipet ve.
    6. Tam orta 3 ml içeren yeni 6 cm çapında Petri kabındaki 4: Onlara 1 Böl. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de, 6 cm çapında Petri tabaklarında kültür içinde hücreleri koruyun. Haftada bir kez alt-kültür ya da 80 kapalı ne zaman - yüzey alanının% 90.
  2. Görüntüleme için SH-SY5Y hücre kaplama
    1. TIRFM deneyleri için, levhaCam kapakların üzerine hücreler. İstihdam cam 0.17 ± 0.005 mm kalınlığında ve 1,5255 ± 0.00015 kırılma indeksi ile kapsar. Başlamadan önce, aşağıdaki gibi cam lamelleri hazırlamak:
      1. Temiz cam% 90 etanol, O / N kapsar.
      2. Damıtılmış su (damıtılmış su üç değişiklik) içinde iyice yıkayın. Kuru cam bir kurutma fırınında kapsar.
      3. Talep cam Petri kapları içinde kapsamaktadır ve 3 saat boyunca 200 ° C'de önceden ısıtılmış bir fırın içinde sterilize edilir.
    2. Transfeksiyondan bir önceki gün, 3.5 cm Petri için, her lamel kültür ortamının 1 ml ilave edilir ve bir% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
    3. 1.1.5, komple ortam içinde 1 ml hücre pelletini askıya ve sayısı - adımda 1.1.3 tarif edildiği gibi hücreler tripsinize. De / 3 x 10 5 hücre elde etmek için her bir Petri kabına ekleyin hücre süspansiyonu doğru hacim hesaplanır. Bu yoğunluk optimum hücre büyümesi ve etkili transfeksiyon için gereklidir. 37 ° C'de inkübe edin% 5 CO2 inkübatöründe O / N.
  3. Polietilenimin SH-SY5Ytransfection (PEI)
    Not: sinaptik kesecikler dinamikleri görselleştirmek için, synapto-pHluorin içeren pCB6 vektörü kullanılmıştır. synapto-pHluorin yeşil floresan proteini (GFP), 16 ve yapı da, yaygın olarak nöronlar 9 içinde sinaptik vezikül özelliklerinin incelenmesi için kullanılmıştır edilmiştir 2. sinaptobrevin veziküler membran proteini, bir pH'a duyarlı varyantın çerçeve füzyonu ile oluşturuldu.
    1. Transfeksiyon başlamadan önce, aşağıdaki çözümlerden 10 ml yapmak. 1 ay gibi maksimal olarak çözüm tutun.
      1. 150 mM NaCI çözeltisi olun. 0.01 N HCI ile pH 5.5'e ayarlayın.
      2. 150 mM NaCI çözeltisi içinde% 10 polietilenimin (25 kDa lineer PEI) bir PEI solüsyonu yapın. Çözeltinin pH değeri 8.8'e yükselir. 0.01 N HCI ile 7.8'e pH ayarlayın.
    2. Sonra kaplama 24 saat, orta kaldırmak ve 1.5 ml yenilemetam bir ortam. % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler tutun.
    3. Laminer akış biyo-güvenlik kabini altında, 1.5 ml mikrofüj tüpü içinde, 150 mM NaCI çözeltisi 25 ul ve 3.5 cm'lik bir Petri tabağı başına PEI solüsyonu 100 ul plasmid DNA 3 mikrogram ekleyin.
    4. Vorteks 10 sn için, daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DNA / PEI karışımı inkübe edilir.
    5. Dikkatle hücreleri ile lamelleri içeren Petri kabı DNA / PEI karışımı ekleyin ve hafifçe eşit Petri kabındaki reaktif dağıtmak için sallayın.
    6. 4 saat sonra ortam değiştirme ve bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler O / N inkübe edin. Transfeksiyondan sonra 48 saat - görüntüleme deneyleri 24 gerçekleştirin.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi 2. Hücre Görüntüleme (TIRFM)

  1. Görüntüleme set-up
    1. Şekil 1'de açıklanan set-up ile TIRF görüntüleme gerçekleştirin. Bu ters bir motorlu içermektedirmikroskop (Şekil 1, ek A), lazer kaynağı (Şekil 1, ek B) ve TIRF-kaymak (Şekil 1, ek C). Bir yüksek sayısal açıklık (NA 1.45 Alpha Planı-Fluar) 100X yağı, daldırma hedefi ile TIRFM aydınlatma ulaşır.
    2. TIRFM aydınlatma için, bir çok çizgi (458/488/514 nm) 100 mW argon-iyon lazeri kullanır. Bir tek modlu optik fiber kullanılarak, TIRF kaydırıcı yoluyla, ışın yoluna doğrusal polarize ışığı lazer tanıtmak. Yansıyan ışık huzmesi yolunun aydınlık alan diyafram düzlemine TIRF sürgüsünü yerleştirin.
      1. Geniş alan aydınlatma için, geleneksel cıva kısa ark lambası HBO beyaz ışığa mikroskop bağlayabilirsiniz. Sürgünün bir kutuplaşma-muhafaza, çift prizma TIRF aydınlatma ve beyaz ışığın eşzamanlı kombinasyonunu sağlar.
    3. Bir uyarım filtre (genişlik 488/10 nm) lazer ışığı filtre lazer yoluna yerleştirilen bir filtre tekerleği üzerine monte edilmiştir. Kullanmakyüksek hız, program kontrollü, kapak, lazer aydınlatma hızlı şekilde kontrol etmek için. PHluorin analizi için, bir grup 525/50 nm emisyon filtresi geçmek monte. Görüntü ProPlus yazılımı ile soğutulmuş Hızlı CCD kamera dijital fotoğraf (512 x 512 piksel) yakalayın.
  2. TIRF aydınlatma sağlanması (Şekil 2)
    1. Lazerler, bilgisayar, kamera, filtre tekerleği, ve deklanşör kontrolörleri açın; Daha sonra, lazerler ısınmak ve stabilize etmek gerekiyor gibi deney başlamadan önce 20 dakika bekleyin.
    2. Görüntüleme önce, aşağıdaki çözümlerden elverişli hacmi oluşturmak.
      1. 1.2 mM KH 2 PO 4, 25 mM 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) (tamponlanmış 125 mM NaCI, 5 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, Krebs (KRH) çözeltisi 50 ml yapmak pH 7.4), 2 mM CaCl2 ve 6 mM glükoz.
      2. 80 mM NaCI, 50 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH 2 PO 4'te KCI-KRH çözeltisi (pH 7.4), 10 ml yapmak25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 ve 6 mM glukoz (pH 7.4'e tamponlanmış).
    3. Transfekte hücreler cam kapağını çıkarın ve uygun görüntüleme odasının takın. Odasına monte ve cam merkezinde KRH çözeltisi 500 ul ekleyin.
    4. Amaç üzerinde yağ ekleyin. Mikroskop sahnede görüntüleme odasına yerleştirin ve cam lamel altında hedefi yerleştirin. Numune üzerinde güvenli kapağı yerleştirin.
    5. Epifloresans modunda, lamel (üst yüzey) üzerinde durulacak ve oda merkezinde yer transfekte hücreleri seçin. Olan flüoresan sinyal açıkça 80 msn altında bir pozlama süresi ile kaydedilebilir hücreleri seçin.
    6. Yazılım kontrolü altında, canlı modda TIRF aydınlatma geçiş.
    7. TIRF yapılandırmasını ayarlamak için, numune kapağı (Şekil 2B) hakkında, objektif dışarı çıkar ışınının konumunu kontrol edin. Kiriş t merkezinde konumlandırılmış zamanO objektif lens (sol Şekil 2A), bir nokta (sol, Şekil 2B) TIRF örnek kapağının ortasında görünür ve hücre Epifloresans modunda görüntülü (birkaç odak düzlemleri, yüksek eşiğe Şekil 2C, sol) .
    8. Kritik açı ulaşmak için, Y yönünde odaklı noktaya taşımak (ileri veya geri Şekil 2B, merkezi) TIRF kaymak (Şekil 1C) üzerindeki açı ayar vidası kullanarak. Kiriş (sağ Şekil 2A) kritik açıdan daha büyük bir açıyla örnek uçakta yakınsar zaman, nokta kaybolur ve düz, ince, odaklı çizgi (sağ Şekil 2B) örnek kapak ortasında açıktır.
    9. Ince ayar yapmak için TIRF açısı hücre örneği (Şekil 2C) kullanın. Bu aşamada, bir Epifloresans-benzeri görüntü hala görülebilir, video floresan görüntü izleyin. Yavaşça, TIRF con kadar vidayı hareketkoşul elde edilir: hücrenin, sadece tek bir optik odak düzlemi (yani, kapak astar ile temas halinde, plazma zarı), bu (sağ, Şekil 2C), yüksek kontrastlı bir düz görüntü ile sonuçlanan bulunmaktadır.
  3. Örnek görüntüleme
    1. Tek kanallı time-lapse deney ayarlayın. Photobleaching en aza indirmek için, düşük pozlama süresi ve yüksek kazanç kullanarak görüntüyü yakalamak. 80 msn - Uygun pozlama süreleri 40 arasındadır. 2 Hz örnekleme frekansında - 1 görüntüleri edinin. Vesikül kinetik yüksek frekansta (10 Hz) daha iyi takdir örnekleme olabilir. gözlem düzenli süresi genellikle 2 dakika olduğunu.
    2. TIRFM modunda KRH çözümü ve kayıt hücrelerinin 500 ul ekleyin. Bu dinlenme durumdur. Zaman sıralı görüntüleri kaydedin.
    3. Dinlenme aynı koşullar (lazer gücü, zaman pozlama, çerçeve sayısı) altında aynı hücrede ve kayıt odaklanın. Beş kare sonra, KCl-KRH çözeltisi 500 ul ekleyin ve odasında KCI tutun.Bu uyarılmış bir durumdur; Zaman sıralı görüntüleri kaydetmek.

3. Görüntü Analizi ve Veri İşleme

NOT: görüntüleri analiz etmek, makro görüntü analiz yazılımı mevcut fonksiyonlarına göre, laboratuvarda geliştirilmiştir; benzer makro çevrimiçi (Malzeme ve Ekipmanları Tablo sağlanan URL) bulunmaktadır.

  1. Floresans yoğunluğu ölçümü
    1. Film boyunca, görüntünün ilgi (ROI) bir bölgede floresan yoğunluğu ölçümü için bir "Dizi floresan yoğunluğu" makro kullanın.
    2. Zaman sıralı görüntüleri açın. Makro menüsüne gidin ve 'Sıra floresan yoğunluğu' seçeneğini seçin. 'Analiz' penceresinde "yatırım getirisi seçin" görünür.
    3. Yatırım getirisi oluşturmak için menüden seçim araçlarından birini seçin. Noktalar (arka plan ROI) olmadan hücre zarının bölgelerde 3 ROI'leri yerleştirin. Thi İstihdams "arka plan ROI" photobleaching değerlendirmek ve füzyon olay analizi (Şekil 3A) eşiğini ayarlamak için.
  2. Photobleaching düzeltme ve eşik tayini (Şekil 3B)
    1. Photobleaching değerlendirmek için, floresan yoğunluğu satırları "arka plan ROI", (Şekil 3BA) açın. İlk yoğunluk değerine (F0) (F / F0) (Şekil 3BB) her çerçeve içinde floresan yoğunluğu değerleri Normale. Değerlerinin ortalamasını alın.
    2. Ortalama verileri vurgulayın ve grafik menü seçeneklerini kullanarak bir çizgi grafiği oluşturmak.
    3. Veri analizi menüsünden, arsa analizi iletişim kutusunu açmak için "eğilim çizgisi" seçeneğini seçin. Regresyon türünü seçin. Set "üstel" regresyon. Sonra "grafik ekran denklemi" seçeneğini seçin. Grafik penceresinde, üstel denklem görünür ve parametre değerleri otomatik, (Şekil 3BC atanır ).
    4. Aşağıdaki gibi her çerçeve içinde yoğunluk değerlerine üstel düzeltme uygulayın:
      Fn (düzeltilmiş) Fn / exp = (-n * a)
      Fn = çerçeve n ölçülen deneysel floresan yoğunluğu; n = kare sayısı; nedeniyle photobleaching için yoğunluk kaybı oranını ifade eden = ağartma faktörü (sabit;   Şekil 3BD).
    5. Eşiğini ayarlamak için, bir normalize ve düzeltilmiş "arka plan yatırım getirisi" açmak ortalama floresan sinyali ve standart sapma (SD) hesaplayın. 3 SD artı ortalama değer eşiği (Şekil 3BE) temsil eder. Veri analizi için bu eşiği kullanın.
  3. Yarı otomatik bir prosedür kullanılarak füzyon etkinlikleri seçimi
    1. Görüntü analiz yazılımı ile zaman-ardışık görüntüleri açın. Aktif görüntü dizisine bir Gauss filtre uygulayın.
    2. Seçim yapmanızı sağlar aracı "nesneleri saymak" veya makro kullanarak görüntüleri analizolan piksel bir tanımlanmış aralık içinde ortalama floresan yoğunluğu sahip bir nesne. Elle, eşik işlevini kullanarak aralığı yoğunluğunu ayarlayın (bar menüsüne gidin, set ölçü → eşik ilgi alanı vurgulamak için). Yeterli eşik yerel floresan arka plan sinyali üzerinde% 30.
    3. Bir makro aşağıdaki kriterleri karşılayan tek nesneleri seçmek için "nesneleri Filtreler" Uygula:
      1. Yönü için aralıkları seçeneğini (min ve max dahil) uygulayın. Aspect ana eksene ve nesneye elips eşdeğer küçük ekseni arasındaki oranı bildirir. Aspect her zaman ≥1. Yeterli değerler dk = 1, max = 3 bulunmaktadır.
      2. Çapı aralıkları uygulayın. Çapı iki derecelik aralıklarla iki anahat noktaları birleştirme ve nesnenin sentroidinden geçerek ölçülen çap ortalama uzunluğu bildirir. Piksel aralığı ayarlayın (veya mikron, bir kalibre sistemi kullanıyorsanız).
      3. Başlangıçtaki optimal aralık tanımlali deneyler: manuel ilgi noktalar seçin ve ardından arsa profil işlevini kullanarak kendi çapını ölçün.
    4. "Görüntüleme nesnelerini" seçiniz: Seçilen nesneleri TIRFM görüntü (Şekil 4B) üst üste görünür.
    5. Analizinde yalnızca kısa (1-3 kare) göstermek noktalar hemen sinyali (geçici noktalar) belirgin bir kayıp tarafından takip floresan yoğunluğunda geçici artış, ekleyin. Seçilen vezikül / noktalar (deneysel ROI) etrafında yaklaşık bir-nokta çapı radyal bir yatırım getirisi oluşturmak için dairesel bir seçim İstihdam. Bu adımı el gerçekleştirin.
    6. ROI'ları seçili, film boyunca her ROI ortalama floresan yoğunluğu hesaplayın.
  4. Veri analizi (Şekil 3C-D)
    1. Bir e-tabloya her "deneysel ROI" ölçülen floresan değişikliklerin zaman seyrini İhracat; (Şekil 3DA). İlk floresan yoğunluğu (F / F0), (Şekil 3dB) her çerçeve içinde yoğunluk değerini Normale.
    2. Adım 3.2.4 (Şekil 3Dc) bildirildiği gibi, her karede yoğunluk değerlerine üstel düzeltme uygulayın.
    3. Füzyon toplam olay sayısı (pik sayısı), her füzyon meydana zamanı (tepe genişliği) ve floresan tepe (pik yüksekliği ve AUC) genlik hesaplamak için elektronik tablo veya matematik paketleri kullanarak mantıksal fonksiyonlar uygulanır. Mantıksal formüller kullanılarak füzyon olayı analizinin bir örneği Şekil 3DD ve 3DE bildirilmiştir.
    4. Plazma zarı vezikül füzyon olarak eşiğini (3SD ± ortalama arka plan floresan yoğunluğu) aşan floresan yoğunluğu artışı ve bir füzyon olayı olarak ortaya çıkan zirve varsayalım.
    5. Son ve her tepe ilk x değeri arasındaki fark olarak pik genişliği hesaplayın. 1 / (örnekleme frekansı) için bu değer çarpın. Bu değer a düşününvezikül yeniden asitlenme ve geri dönüşüm (Şekil 3DD) önce plazma membran vezikül füzyon ve yapışma zamanı.
    6. Eşiğin üzerinde değerler toplamı olarak bütün hücre AUC hesaplayın. Nedeniyle spontan (dinlenme) kayıt süresince net floresan değişikliği veya uyarılmış (uyarılmış) sinaptik aktivite olarak bu değeri düşünün.
    7. Her tepe ve eşik maksimum y değeri arasındaki fark olarak pik yüksekliği hesaplayın. Füzyon türü (genel ort tek eşzamanlı / sıralı füzyon veya geçici vs tam füzyon) bu değeri olarak gösterge düşünün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tarif TIRF görüntüleme ve veri analizi prosedürleri hücresel sistemlerde veziküller dinamikleri üzerinde çalışmak üzere tasarlanmıştır. Bu teknik, füzyon olayları ve nörotransmiter vezikül dinamikleri 17 molekülleri ve uyuşturucu sinyal etkisini belirlemek için de kullanılabilir. GFP etiketli plazma membran proteinleri kullanılarak, TIRFM analizi glial GFP-etiketli glutamat taşıyıcılar ve epitel hücreleri 18,19 kurucu kaçakçılığı karakterize etmek için kullanılmıştır.

R...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu kağıt görüntüye bir protokol sunar ve floresan cDNA-kodlanmış vektörler ve TIRFM kullanarak, salgılayan hücrelerde veziküller dinamiklerini analiz. TIRFM başarılı görüntüleme anahtar unsurları vezikül serbest bırakılması ve geri dönüşüm genetik olarak kodlanmış optik göstergelerle hücresel modeli ve hücre transfeksiyon seçim vardır.

TIRFM ideal bir cam kapak yapışık büyüyen ve membran ve füzyon etkinlikleri sabit görüntülenmesine olanak vermek üzere yeteri kadar düz hücreler için uygundur...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar Eliana Di Cairano (Post-doktora bursu) ve Stefania Moretti (doktora bursu) destek için Universita degli Studi di Milano kabul etmek istiyorum. Bu çalışma CP Üniversitesi Araştırma Programı PUR tarafından desteklenen

PHluorin inşa Dr. Dotti Francesco veri analizi konusunda yardım almak için, ve teknik yardım için Silvia Marsicano için biz, Prof. Jeremy M. Henley, Biyokimya Okulu, Bristol, Birleşik Krallık Üniversitesi teşekkür etmek istiyorum.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman
Axio Observer Z1figure-materials-1 Zeiss491912-9850-000ters mikroskop
Multiline Argon Laser Lasos 77figure-materials-2 Lasos00000-1312-752çok hatlı (458/488/514 nm), 100 mW argon-iyon lazeri
Laser TIRF sliderfigure-materials-3 Zeiss423681-9901-000
100X Objektiffigure-materials-4 Zeiss421190-9900-000Yağlı, NA 1.45 Alpha-Plan
CCD Kamera RetigaSRV Fast 1394figure-materials-5 QImaging
SmartShutter özellikli LAMBDA 10-3 optik filtre değiştiricifigure-materials-6 Sutter Instrument Company
Yazılım
Image ProPlus 6.3 Yazılımıfigure-materials-7 Media Cyberneticsnokta seçimi, ROI seçimi, floresan yoğunluğu belirleme
Excelfigure-materials-8 Microsoftfotoblöçing düzeltmesi, tüm hücre ve tek vezikül analizleri
GraphPad Prism 4.00figure-materials-9 GraphPad Software, Inc.istatistiksel analiz

Kaynaklar

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Annu. Rev. Neurosci. 27, 509-547 (1146).
  2. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  3. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  4. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  5. Matz, M. V., et al. Fluorescent proteins from non bioluminescent Anthozoa species. Nat Biotechnol. 17 (10), 969-9673 (1999).
  6. Ribchester, R. R., Mao, F., Betz, W. J. Optical measurements of activity-dependent membrane recycling in motor nerve terminals of mammalian skeletal muscle. Proc Biol Sci. 255 (1342), 61-66 (1994).
  7. Polo-Parada, L., Bose, C. M., Landmesser, L. T. Alterations in transmission, vesicle dynamics, and transmitter release machinery at NCAM-deficient neuromuscular junctions. Neuron. 32 (5), 815-828 (2001).
  8. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat Protoc. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys. J. 79, 2199-2208 (2000).
  12. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  13. Wyatt, R. M. Balice-Gordon R.J. Heterogeneity in Synaptic Vesicle Release at Neuromuscular Synapses of Mice Expressing SynaptopHluorin. J. Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  14. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13, 563-567 (2003).
  15. Miloso, M., et al. Retinoic Acid-Induced Neuritogenesis of Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells Is ERK Independent and PKC Dependent. J. Neurosci. Res. 75, 241-252 (2004).
  16. Jaskolski, F., Mayo-Martin, B., Jane, D., Henley, J. M. Dynamin-dependent Membrane Drift Recruits AMPA Receptors to Dendritic Spines. J Biol Chem. 284 (18), 12491-12503 (2009).
  17. Treccani, G., et al. Stress and corticosterone rapidly increase the readily releasable pool of glutamate vesicles in synaptic terminals of prefrontal and frontal cortex. Mol Psychiatry. 19 (4), 433-443 (1038).
  18. D'Amico, A., et al. The surface density of the glutamate transporter EAAC1 is controlled by interactions with PDZK1 and AP2 adaptor complexes. Traffic. 11 (11), 1455-1470 (2010).
  19. Perego, C., Di Cairano, E. S., Ballabio, M., Magnaghi, V. Neurosteroid allopregnanolone regulates EAAC1-mediated glutamate uptake and triggers actin changes in Schwann cells. J Cell Physiol. 227 (4), 1740-1751 (2012).
  20. Bergeron, A., Pucci, L., Bezzi, P., Regazzi, R. Analysis of synaptic-like microvesicles exocytosis of B-cells using a live imaging technique. PlosOne. 9, e87758(2014).
  21. Encinas, M., et al. Sequential treatment of SH-Sy5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated, neutrophic factor-dependent, human neuron-like cells. J. Neurochem. 75 (3), 991-1003 (2000).
  22. Kume, T., et al. Dibutyryl cyclic AMP induces differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into a noradrenergic phenotype. Neurosci Lett. 443 (3), 199-203 (2008).
  23. Diaspro, A., Chirico, G., Usai, C., Ramoino, P., Dobrucki, J. Photobleaching. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer-Verlag New York, Inc.. New York. 690-699 (2006).
  24. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. M. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Toplam Yans mal Floresans MikroskobuSynapto pHluorin TransfeksiyonuVezik l F zyon AnaliziFloresans iddeti KantifikasyonuTekil Vezik l zlemePotasyum Depolarizasyon Stim lasyonu
TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.