TIRFM ve pH-duyarlı GFP-sondalar SH-SY5Y Nöroblastom Hücrelerinde nörotransmitter Vesikül Dynamics değerlendirin: Hücre Görüntüleme ve Veri Analizi

Nöronlar arasındaki sinaptik iletim Kimyasal sinir sisteminde iletişimin önemli bir mekanizmadır. Bu presinaptik yerinde vezikül füzyon ve alma dinamik bir döngüsü boyunca nörotransmitterlerin salınımı üzerine dayanır. Vezikül dinamikleri katılan proteinlerin çoğu tespit edilmiştir; Ancak, fenomen kendi özel katkısı ¹ netleştirilmelidir.

Bizim anlayış kısmen egzo / endositoz için en yaygın kullanılan testler her zaman en uygun olmadığı gerçeği ile sınırlıdır. Çeşitli vezikül füzyon ile ilgili çalışmalar ve dinamikleri elektrofizyolojik teknikler güveniyor. Bu teknik, optimum zamansal çözünürlük sağlar ve plazma membran veziküller ilk füzyon araştırmak için mükemmel ama presinaptik işlevini destekleyen yatan moleküler olayların birçok algılayamıyor. Elektron mikroskobu, diğer tarafta, en iyi morphologica sağlarNumuneler analiz edilmek üzere tespit edilmelidir, çünkü her tekil adım, ancak olayın dinamik yönü l açıklama yakalanan edilemez.

floresan moleküler sondalar geliştirme ^4-6 gelişmeler ile birlikte yeni optik kayıt teknikleri ^2,3, gelişi, böylece sinaptik yapısı ve işlevi hakkında bilgi yeni seviyeleri sağlayan, canlı hücrelerde ekzositik süreçlerin görselleştirme sağlar.

İlk çalışmalar sömürülen aktivite bağımlı stiril boyalar (FM1-43 ve ilgili organik boyalar) ^7,8. Devlet-sanat görüntüleme teknikleri lümen veziküller proteinler ⁹ gergin Yeşil Floresan Protein (GFP) (pHluorin) pH-duyarlı varyantlarını kullanır. Bu sondalar, normalde düşük olması nedeniyle lümen pH veziküllerde mevcut olduğunda kapatılır. Plazma membranı ile füzyon sonra, kese iç nötr hücre dışı alanı, pH maruz aniden artar pHluorin proton-bağımlı söndürme rahatlatır ve floresan sinyal hızla görünür. PHluorin değişim floresan artar izleyerek, füzyon olayı daha hızlı olduğu için, membran vezikül füzyon ölçülerek analiz edilebilir. Yüzey pHluorin-etiketli moleküller endocytosed olduğundan, floresans sinyali, daha sonra, bu nedenle, aynı yapı vezikül ⁹ dönüştürülmesi izlemek için de kullanılabilir, bazal seviyeye döner.

Vezikül etiketli pH sensörü sadece gerçekten plazma zarı ile sigorta bu keseciklerin görselleştirme sağlarken, yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte görüntüleme ayrıntıları egzo / endositik süreçlerinde adımları açıklamak için gereklidir. Gerekli uzay-zamansal çözünürlük sağlayan optik bir tekniktir toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM), floresan mikroskobu ¹⁰ bir uygulamadır.

Birkaç özellikler veziküller dinamikleri izlenmesi için seçim TIRFM tekniği yapmak. Mükemmel kontrast ve yüksek sinyal-gürültü oranı tek kesecikler kaynaklanan çok düşük sinyallerin algılanmasını sağlar. Her çerçeve çip tabanlı görüntü elde etme derece dinamik süreçleri tespit etmek için gerekli zamansal çözünürlük sağlar. Son olarak, numune başka düzlemde ışık hücrelerin minimal maruz güçlü fototoksisite azaltır ve uzun ömürlü time-lapse kayıt ¹² sağlar.

Veri analizi, bu tekniğin en zorlu ve önemli yönü kalır. vezikül füzyon izlemek için en basit yol, zaman ¹³ üzerine, hücre yüzeyinde raportör flöresan protein birikimini ölçmektir. Yanı sıra füzyon artar, net floresan sinyal arttıkça. Bununla birlikte, bu yöntem özellikle büyük hücreler ve dinlenme koşulları işlemi göz ardı edilebilir,endositoz ve photobleaching süreçleri nedeniyle kese ekzositoz için floresan yoğunluğu artışı telafi çünkü. Alternatif bir yöntem, tek tek her füzyon olayı ¹⁴ takip etmektir. Bu ikinci yöntem çok hassastır ve füzyon mekanizmaları hakkında önemli ayrıntıları ortaya çıkarabilir. Tamamen otomatik prosedürler veziküller takip etmek ve onların floresan sinyallerin dalgalanmasını kayıt her zaman mevcut değildir çünkü Ancak, tek olayların manuel seçimi gerektirir. Vezikül dinamikleri Gözlem yüksek frekansta örnekleme hücreleri gerektirir. Bu pek elle analiz edilebilir veri büyük miktarda üretir.

Bu çalışmanın her iki öneri, laboratuarda geliştirilmiş bir işlem verilerini analiz etmek için SH-5YSY nöroblastom hücre çizgisinde taban ve uyarılmış olan nörotransmitter salimim izlenmesi için TIRFM görüntüleme tekniği optimize etmek ve tanımlamak için, adım adım bir Bütün hücre ve tek vezikül seviyelerde aktivite göstermez.

1. Hücre Kültürü ve transfeksiyonu

1. SH-SY5Y hücre kültürü
   Not: denemeleri, insan nöroblastom SH- SY5Y (ATCC # CRL-2266) ¹⁵ kullanılarak yapılmıştır. SH-SY5Y hücreleri değişken kümeleri ve diğer yapışıcı hücreler bir karışımı olarak büyür. Sıkıca TIRFM için çok önemlidir cam kapak, bağlı büyümeye hücreleri için protokol (hücre yoğunluğu, yarma oranı, vb.) Rapor talimatları izleyin.
   1. Başlamadan önce, laminer akış biyo-güvenlik kabini altında, steril fosfat tamponlu salin çözeltisi (PBS) ve kültür ortamının elverişli hacmi oluşturmak.
      1. 150 mM NaCI, 24 mM fosfat tampon maddesi, pH 7.4 konsantrasyonları ile PBS, 50 ml olun. Çözüm Filtre.
      2. Yüksek glukoz,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml), L-glutamin (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) hücre ortamı 50 ml yapmak 2 mM) vesodyum piruvat (1 mM). Çözüm Filtre.
   2. Tam büyüme ortamı çıkarın ve 3 ml PBS ile hücrelerin yıkayın.
   3. 37 ° C'de 5 dakika boyunca (6 cm Petri için)% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit, 2 ml (EDTA) ile inkübe hücreleri,% 5 _CO2 ve pipet kullanarak hücreleri ayırmak.
   4. DMEM 2 ml ilave etmek suretiyle deaktive tripsin ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler toplanır.
   5. Tek bir hücre süspansiyonu içine hücreleri dağıtmak için aşağı yeterince Süpernatantı pelet DMEM 1 ml ekleyin ve çözüm yukarı pipet ve.
   6. Tam orta 3 ml içeren yeni 6 cm çapında Petri kabındaki 4: Onlara 1 Böl. % 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de, 6 cm çapında Petri tabaklarında kültür içinde hücreleri koruyun. Haftada bir kez alt-kültür ya da 80 kapalı ne zaman - yüzey alanının% 90.
2. Görüntüleme için SH-SY5Y hücre kaplama
   1. TIRFM deneyleri için, levhaCam kapakların üzerine hücreler. İstihdam cam 0.17 ± 0.005 mm kalınlığında ve 1,5255 ± 0.00015 kırılma indeksi ile kapsar. Başlamadan önce, aşağıdaki gibi cam lamelleri hazırlamak:
      1. Temiz cam% 90 etanol, O / N kapsar.
      2. Damıtılmış su (damıtılmış su üç değişiklik) içinde iyice yıkayın. Kuru cam bir kurutma fırınında kapsar.
      3. Talep cam Petri kapları içinde kapsamaktadır ve 3 saat boyunca 200 ° C'de önceden ısıtılmış bir fırın içinde sterilize edilir.
   2. Transfeksiyondan bir önceki gün, 3.5 cm Petri için, her lamel kültür ortamının 1 ml ilave edilir ve bir% 5 _CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin.
   3. 1.1.5, komple ortam içinde 1 ml hücre pelletini askıya ve sayısı - adımda 1.1.3 tarif edildiği gibi hücreler tripsinize. De / 3 x 10 ⁵ hücre elde etmek için her bir Petri kabına ekleyin hücre süspansiyonu doğru hacim hesaplanır. Bu yoğunluk optimum hücre büyümesi ve etkili transfeksiyon için gereklidir. 37 ° C'de inkübe edin% 5 _CO2 inkübatöründe O / N.
3. Polietilenimin SH-SY5Ytransfection (PEI)
   Not: sinaptik kesecikler dinamikleri görselleştirmek için, synapto-pHluorin içeren pCB6 vektörü kullanılmıştır. synapto-pHluorin yeşil floresan proteini (GFP), ¹⁶ ve yapı da, yaygın olarak nöronlar ⁹ içinde sinaptik vezikül özelliklerinin incelenmesi için kullanılmıştır edilmiştir 2. sinaptobrevin veziküler membran proteini, bir pH'a duyarlı varyantın çerçeve füzyonu ile oluşturuldu.
   1. Transfeksiyon başlamadan önce, aşağıdaki çözümlerden 10 ml yapmak. 1 ay gibi maksimal olarak çözüm tutun.
      1. 150 mM NaCI çözeltisi olun. 0.01 N HCI ile pH 5.5'e ayarlayın.
      2. 150 mM NaCI çözeltisi içinde% 10 polietilenimin (25 kDa lineer PEI) bir PEI solüsyonu yapın. Çözeltinin pH değeri 8.8'e yükselir. 0.01 N HCI ile 7.8'e pH ayarlayın.
   2. Sonra kaplama 24 saat, orta kaldırmak ve 1.5 ml yenilemetam bir ortam. % 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler tutun.
   3. Laminer akış biyo-güvenlik kabini altında, 1.5 ml mikrofüj tüpü içinde, 150 mM NaCI çözeltisi 25 ul ve 3.5 cm'lik bir Petri tabağı başına PEI solüsyonu 100 ul plasmid DNA 3 mikrogram ekleyin.
   4. Vorteks 10 sn için, daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca DNA / PEI karışımı inkübe edilir.
   5. Dikkatle hücreleri ile lamelleri içeren Petri kabı DNA / PEI karışımı ekleyin ve hafifçe eşit Petri kabındaki reaktif dağıtmak için sallayın.
   6. 4 saat sonra ortam değiştirme ve bir% 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücreler O / N inkübe edin. Transfeksiyondan sonra 48 saat - görüntüleme deneyleri 24 gerçekleştirin.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi 2. Hücre Görüntüleme (TIRFM)

1. Görüntüleme set-up
   1. Şekil 1'de açıklanan set-up ile TIRF görüntüleme gerçekleştirin. Bu ters bir motorlu içermektedirmikroskop (Şekil 1, ek A), lazer kaynağı (Şekil 1, ek B) ve TIRF-kaymak (Şekil 1, ek C). Bir yüksek sayısal açıklık (NA 1.45 Alpha Planı-Fluar) 100X yağı, daldırma hedefi ile TIRFM aydınlatma ulaşır.
   2. TIRFM aydınlatma için, bir çok çizgi (458/488/514 nm) 100 mW argon-iyon lazeri kullanır. Bir tek modlu optik fiber kullanılarak, TIRF kaydırıcı yoluyla, ışın yoluna doğrusal polarize ışığı lazer tanıtmak. Yansıyan ışık huzmesi yolunun aydınlık alan diyafram düzlemine TIRF sürgüsünü yerleştirin.
      1. Geniş alan aydınlatma için, geleneksel cıva kısa ark lambası HBO beyaz ışığa mikroskop bağlayabilirsiniz. Sürgünün bir kutuplaşma-muhafaza, çift prizma TIRF aydınlatma ve beyaz ışığın eşzamanlı kombinasyonunu sağlar.
   3. Bir uyarım filtre (genişlik 488/10 nm) lazer ışığı filtre lazer yoluna yerleştirilen bir filtre tekerleği üzerine monte edilmiştir. Kullanmakyüksek hız, program kontrollü, kapak, lazer aydınlatma hızlı şekilde kontrol etmek için. PHluorin analizi için, bir grup 525/50 nm emisyon filtresi geçmek monte. Görüntü ProPlus yazılımı ile soğutulmuş Hızlı CCD kamera dijital fotoğraf (512 x 512 piksel) yakalayın.
2. TIRF aydınlatma sağlanması (Şekil 2)
   1. Lazerler, bilgisayar, kamera, filtre tekerleği, ve deklanşör kontrolörleri açın; Daha sonra, lazerler ısınmak ve stabilize etmek gerekiyor gibi deney başlamadan önce 20 dakika bekleyin.
   2. Görüntüleme önce, aşağıdaki çözümlerden elverişli hacmi oluşturmak.
      1. 1.2 mM KH ₂ PO _4, 25 mM 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit (HEPES) (tamponlanmış 125 mM NaCI, 5 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, Krebs (KRH) çözeltisi 50 ml yapmak pH 7.4), 2 mM _CaCl2 ve 6 mM glükoz.
      2. 80 mM NaCI, 50 mM KCI, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH ₂ PO _4'te KCI-KRH çözeltisi (pH 7.4), 10 ml yapmak25 mM HEPES, 2 mM _CaCl2 ve 6 mM glukoz (pH 7.4'e tamponlanmış).
   3. Transfekte hücreler cam kapağını çıkarın ve uygun görüntüleme odasının takın. Odasına monte ve cam merkezinde KRH çözeltisi 500 ul ekleyin.
   4. Amaç üzerinde yağ ekleyin. Mikroskop sahnede görüntüleme odasına yerleştirin ve cam lamel altında hedefi yerleştirin. Numune üzerinde güvenli kapağı yerleştirin.
   5. Epifloresans modunda, lamel (üst yüzey) üzerinde durulacak ve oda merkezinde yer transfekte hücreleri seçin. Olan flüoresan sinyal açıkça 80 msn altında bir pozlama süresi ile kaydedilebilir hücreleri seçin.
   6. Yazılım kontrolü altında, canlı modda TIRF aydınlatma geçiş.
   7. TIRF yapılandırmasını ayarlamak için, numune kapağı (Şekil 2B) hakkında, objektif dışarı çıkar ışınının konumunu kontrol edin. Kiriş t merkezinde konumlandırılmış zamanO objektif lens (sol Şekil 2A), bir nokta (sol, Şekil 2B) TIRF örnek kapağının ortasında görünür ve hücre Epifloresans modunda görüntülü (birkaç odak düzlemleri, yüksek eşiğe Şekil 2C, sol) .
   8. Kritik açı ulaşmak için, Y yönünde odaklı noktaya taşımak (ileri veya geri Şekil 2B, merkezi) TIRF kaymak (Şekil 1C) üzerindeki açı ayar vidası kullanarak. Kiriş (sağ Şekil 2A) kritik açıdan daha büyük bir açıyla örnek uçakta yakınsar zaman, nokta kaybolur ve düz, ince, odaklı çizgi (sağ Şekil 2B) örnek kapak ortasında açıktır.
   9. Ince ayar yapmak için TIRF açısı hücre örneği (Şekil 2C) kullanın. Bu aşamada, bir Epifloresans-benzeri görüntü hala görülebilir, video floresan görüntü izleyin. Yavaşça, TIRF con kadar vidayı hareketkoşul elde edilir: hücrenin, sadece tek bir optik odak düzlemi (yani, kapak astar ile temas halinde, plazma zarı), bu (sağ, Şekil 2C), yüksek kontrastlı bir düz görüntü ile sonuçlanan bulunmaktadır.
3. Örnek görüntüleme
   1. Tek kanallı time-lapse deney ayarlayın. Photobleaching en aza indirmek için, düşük pozlama süresi ve yüksek kazanç kullanarak görüntüyü yakalamak. 80 msn - Uygun pozlama süreleri 40 arasındadır. 2 Hz örnekleme frekansında - 1 görüntüleri edinin. Vesikül kinetik yüksek frekansta (10 Hz) daha iyi takdir örnekleme olabilir. gözlem düzenli süresi genellikle 2 dakika olduğunu.
   2. TIRFM modunda KRH çözümü ve kayıt hücrelerinin 500 ul ekleyin. Bu dinlenme durumdur. Zaman sıralı görüntüleri kaydedin.
   3. Dinlenme aynı koşullar (lazer gücü, zaman pozlama, çerçeve sayısı) altında aynı hücrede ve kayıt odaklanın. Beş kare sonra, KCl-KRH çözeltisi 500 ul ekleyin ve odasında KCI tutun.Bu uyarılmış bir durumdur; Zaman sıralı görüntüleri kaydetmek.

3. Görüntü Analizi ve Veri İşleme

NOT: görüntüleri analiz etmek, makro görüntü analiz yazılımı mevcut fonksiyonlarına göre, laboratuvarda geliştirilmiştir; benzer makro çevrimiçi (Malzeme ve Ekipmanları Tablo sağlanan URL) bulunmaktadır.

1. Floresans yoğunluğu ölçümü
   1. Film boyunca, görüntünün ilgi (ROI) bir bölgede floresan yoğunluğu ölçümü için bir "Dizi floresan yoğunluğu" makro kullanın.
   2. Zaman sıralı görüntüleri açın. Makro menüsüne gidin ve 'Sıra floresan yoğunluğu' seçeneğini seçin. 'Analiz' penceresinde "yatırım getirisi seçin" görünür.
   3. Yatırım getirisi oluşturmak için menüden seçim araçlarından birini seçin. Noktalar (arka plan ROI) olmadan hücre zarının bölgelerde 3 ROI'leri yerleştirin. Thi İstihdams "arka plan ROI" photobleaching değerlendirmek ve füzyon olay analizi (Şekil 3A) eşiğini ayarlamak için.
2. Photobleaching düzeltme ve eşik tayini (Şekil 3B)
   1. Photobleaching değerlendirmek için, floresan yoğunluğu satırları "arka plan ROI", (Şekil 3BA) açın. İlk yoğunluk değerine (F0) (F / F0) (Şekil 3BB) her çerçeve içinde floresan yoğunluğu değerleri Normale. Değerlerinin ortalamasını alın.
   2. Ortalama verileri vurgulayın ve grafik menü seçeneklerini kullanarak bir çizgi grafiği oluşturmak.
   3. Veri analizi menüsünden, arsa analizi iletişim kutusunu açmak için "eğilim çizgisi" seçeneğini seçin. Regresyon türünü seçin. Set "üstel" regresyon. Sonra "grafik ekran denklemi" seçeneğini seçin. Grafik penceresinde, üstel denklem görünür ve parametre değerleri otomatik, (Şekil 3BC atanır
   4. Aşağıdaki gibi her çerçeve içinde yoğunluk değerlerine üstel düzeltme uygulayın:
      Fn (düzeltilmiş) Fn / exp = (-n * a)
      Fn = çerçeve n ölçülen deneysel floresan yoğunluğu; n = kare sayısı; nedeniyle photobleaching için yoğunluk kaybı oranını ifade eden = ağartma faktörü (sabit;   Şekil 3BD).
   5. Eşiğini ayarlamak için, bir normalize ve düzeltilmiş "arka plan yatırım getirisi" açmak ortalama floresan sinyali ve standart sapma (SD) hesaplayın. 3 SD artı ortalama değer eşiği (Şekil 3BE) temsil eder. Veri analizi için bu eşiği kullanın.
3. Yarı otomatik bir prosedür kullanılarak füzyon etkinlikleri seçimi
   1. Görüntü analiz yazılımı ile zaman-ardışık görüntüleri açın. Aktif görüntü dizisine bir Gauss filtre uygulayın.
   2. Seçim yapmanızı sağlar aracı "nesneleri saymak" veya makro kullanarak görüntüleri analizolan piksel bir tanımlanmış aralık içinde ortalama floresan yoğunluğu sahip bir nesne. Elle, eşik işlevini kullanarak aralığı yoğunluğunu ayarlayın (bar menüsüne gidin, set ölçü → eşik ilgi alanı vurgulamak için). Yeterli eşik yerel floresan arka plan sinyali üzerinde% 30.
   3. Bir makro aşağıdaki kriterleri karşılayan tek nesneleri seçmek için "nesneleri Filtreler" Uygula:
      1. Yönü için aralıkları seçeneğini (min ve max dahil) uygulayın. Aspect ana eksene ve nesneye elips eşdeğer küçük ekseni arasındaki oranı bildirir. Aspect her zaman ≥1. Yeterli değerler dk = 1, max = 3 bulunmaktadır.
      2. Çapı aralıkları uygulayın. Çapı iki derecelik aralıklarla iki anahat noktaları birleştirme ve nesnenin sentroidinden geçerek ölçülen çap ortalama uzunluğu bildirir. Piksel aralığı ayarlayın (veya mikron, bir kalibre sistemi kullanıyorsanız).
      3. Başlangıçtaki optimal aralık tanımlali deneyler: manuel ilgi noktalar seçin ve ardından arsa profil işlevini kullanarak kendi çapını ölçün.
   4. "Görüntüleme nesnelerini" seçiniz: Seçilen nesneleri TIRFM görüntü (Şekil 4B) üst üste görünür.
   5. Analizinde yalnızca kısa (1-3 kare) göstermek noktalar hemen sinyali (geçici noktalar) belirgin bir kayıp tarafından takip floresan yoğunluğunda geçici artış, ekleyin. Seçilen vezikül / noktalar (deneysel ROI) etrafında yaklaşık bir-nokta çapı radyal bir yatırım getirisi oluşturmak için dairesel bir seçim İstihdam. Bu adımı el gerçekleştirin.
   6. ROI'ları seçili, film boyunca her ROI ortalama floresan yoğunluğu hesaplayın.
4. Veri analizi (Şekil 3C-D)
   1. Bir e-tabloya her "deneysel ROI" ölçülen floresan değişikliklerin zaman seyrini İhracat; (Şekil 3DA). İlk floresan yoğunluğu (F / F0), (Şekil 3dB) her çerçeve içinde yoğunluk değerini Normale.
   2. Adım 3.2.4 (Şekil 3Dc) bildirildiği gibi, her karede yoğunluk değerlerine üstel düzeltme uygulayın.
   3. Füzyon toplam olay sayısı (pik sayısı), her füzyon meydana zamanı (tepe genişliği) ve floresan tepe (pik yüksekliği ve AUC) genlik hesaplamak için elektronik tablo veya matematik paketleri kullanarak mantıksal fonksiyonlar uygulanır. Mantıksal formüller kullanılarak füzyon olayı analizinin bir örneği Şekil 3DD ve 3DE bildirilmiştir.
   4. Plazma zarı vezikül füzyon olarak eşiğini (3SD ± ortalama arka plan floresan yoğunluğu) aşan floresan yoğunluğu artışı ve bir füzyon olayı olarak ortaya çıkan zirve varsayalım.
   5. Son ve her tepe ilk x değeri arasındaki fark olarak pik genişliği hesaplayın. 1 / (örnekleme frekansı) için bu değer çarpın. Bu değer a düşününvezikül yeniden asitlenme ve geri dönüşüm (Şekil 3DD) önce plazma membran vezikül füzyon ve yapışma zamanı.
   6. Eşiğin üzerinde değerler toplamı olarak bütün hücre AUC hesaplayın. Nedeniyle spontan (dinlenme) kayıt süresince net floresan değişikliği veya uyarılmış (uyarılmış) sinaptik aktivite olarak bu değeri düşünün.
   7. Her tepe ve eşik maksimum y değeri arasındaki fark olarak pik yüksekliği hesaplayın. Füzyon türü (genel ort tek eşzamanlı / sıralı füzyon veya geçici vs tam füzyon) bu değeri olarak gösterge düşünün.

Tarif TIRF görüntüleme ve veri analizi prosedürleri hücresel sistemlerde veziküller dinamikleri üzerinde çalışmak üzere tasarlanmıştır. Bu teknik, füzyon olayları ve nörotransmiter vezikül dinamikleri 17 molekülleri ve uyuşturucu sinyal etkisini belirlemek için de kullanılabilir. GFP etiketli plazma membran proteinleri kullanılarak, TIRFM analizi glial GFP-etiketli glutamat taşıyıcılar ve epitel hücreleri 18,19 kurucu kaçakçılığı karakterize etmek için kullanılmıştır.

Rapor görüntüleme işlemi ve veri analizi stratejisini doğrulamak için, füzyon olayları bazal altında kaydedilir ve synapto-pHluorin ile transfekte SH-SY5Y nöroblastom hücrelerinde, (potasyum-kaynaklı depolarizasyon) şartları uyarılmış. (Sırasıyla, video 1, 2). Iki farklı analiz gerçekleştirilmiştir: bütün hücre (Şekil 4) ve tek vezikül analizleri (Şekil 5).

Tam hücre analizi meahücreye füzyon olayları ve stimülasyon tarafından uyarılan ortaya çıkan net floresan değişikliklerin toplam sayısını Sures. Şekil 4'te, synapto-pHluorin transfekte edilmiş hücreler, dinlenme altında kaydedilir ve aynı deney protokolü (zaman maruz kalma, lazer gücü, vs) kullanılarak koşulları (KCI stimülasyon) uyarıldı. Şekil 4A synapto-pHluorin dağınık floresan puncta birikir göstermektedir Hücre zarı. Literatürde açıklandığı gibi, hafif bir flüoresan sinyal, aynı zamanda plazma zarı 9 mevcut olduğu; bu sinyal, görüntülenecek hücreleri tanımlamak için yararlıdır. Şekil 4B, kağıt (bölüm 3.3) 'de açıklanan otomatik prosedür tarafından seçilen noktalar istirahat koşullarında seçilen noktalar normalize floresan yoğunluğu profilleri Şekil 4A. Şekil 4C bildirilen TIRFM görüntüye gösterir bindirilmiş. Bu profiller benzer floresan int bireysel zirvelerinden varlığını ortayabazen membran ile sigorta veziküller kayıt sırasında çeşitli zamanlarda çıkıp muhtemelen karşılık densite. Şekil 4D KCl stimülasyon etkilerini gösterir. Beklendiği gibi, 25 mM KCl ile depolarizasyon bir istemine yanıt ortaya çıkaran ve birkaç çok parlak floresan puncta hücre zarı görünür (Video 2). Bu puncta plazma zarı altında bulunan sinaptik veziküllerin 'kolayca serbest bırakılabilir' havuza gelmektedir. tek tek noktalar uygun olarak ölçülmüş olan flüoresans değişikliklerin zaman süreci analizi salgı uyarıcı (Şekil 4D ve 4F) uygulanmasından sonra aniden ortaya çıkan değişken floresan yoğunluğunun tepe varlığını gösterir. Kayıt zamanında bütün hücre analizleri sonuçları Şekil 4E-H bildirilmiştir. KCI stimülasyon füzyon olayları sayısında hızlı bir artış işaretli (istirahat koşulları üzerinde 2.5 kat artış) (nedenBu şekilde büyük nörotransmitter salımını belirten Şekil 4E-F) elde edilen flüoresan yoğunluğu değişir (dinlenme koşulları üzerinde 9.3 kat artış) (Şekil 4G-H) '.

Tek-tepe analizi tek füzyon olayları (Şekil 5) karakterizasyonu izin verir. Şekil 5A sıralı gösterir istirahat koşullarında kaydedilen bir temsilci "deneysel ROI" nin görüntüleri. Özellikle bir synapto-pHluorin TIRF bölgenin altında membran ile sigortalar vezikülü etiketli vurgulamaktadır. İki kare sonra, floresan sinyal muhtemel vezikül alma ve yeniden asitlenme belirten kaybolur. ilgili bölgenin normalleştirilmiş floresan profili (Şekil 5B) TIRF bölgesinde bir nokta görünümü uygun olarak floresan sinyali artışı ölçer. Tersine, floresan nokta kaybolduktan sonra bazal seviyeye döner (tek zirveortalama genişliği 1.91 ± 0.32 sn; ortalama pik yüksekliği 0.042 ± 0.005 normalize floresan yoğunluğu). Şekil 5C ve 5D KCl uyarımı altında kaydedilen bir "deneysel ROI" sıralı görüntüleri ve ilgili normalize floresan yoğunluğu profili göstermektedir. Ve KCl depolarizasyonuna sonra TIRF bölgesi dışında veziküller hareketi artışa dikkat ediniz.

40 füzyon olaylar seçilir ve dinlenme analiz ve koşulları uyarılır. Aşağıdaki parametreler ölçülür: ortalama pik AUC, pik genişlik ve yükseklik. Tepe genişliği yeniden asidifıkasyon ve geri dönüşüm, Şekil 5G önce vezikül füzyon, bağlanma ve endositoz süreyi belirtir. Tepe yükseklik vezikül füzyon, Şekil 5F tarafından uyarılan floresan yoğunluğu değişiklikleri ölçer. Bu parametrelerdeki değişimler çeşitli ekzositozu mekanizmaları göstergesidir. Tek-tepe analizi KCl depolarizasyon değiştirir ortaya koymaktadırplazma zarına vezikül füzyon modu. Nitekim, ortalama pik alanı eşleştirilmiş t-testi, Şekil tarafından (istirahat koşulları üzerinde 3.8 ± 0.2 kat artış, eşleştirilmiş t-testi ile p <0.01, Şekil 5E), pik yüksekliği (2.75 ± 0.03 kat artış, p <0.01 artış 5F) ve eşleştirilmiş t-testi ile genişliği (2.6 ± 0.5 kat artış, p <0.05. Şekil 5G) uyarılmış koşullar altında tespit edilir. Pek çok açıklama, bu sonuç için düşünülebilir. Bir olasılık KCI depolarizasyon hücrelerinin bir kısıtlı bölge veziküllerin aynı anda ve / veya ardışık füzyon neden olmasıdır. Alternatif bir açıklama güçlü depolarizasyon geçici füzyon karşı tam füzyonu yana olmasıdır. Bazal koşullar altında, hakim mekanizması geçici füzyon: Bir füzyon gözenek şekilleri, vezikül artar ve floresan sinyal görünür pH, ancak gözenek hemen dolayısıyla hızlı yeniden asitlenme ve geri dönüşüm sağlayan, kapatır. Altındauyarılmış durumlar, kese tamamen plazma zarı, pik yüksekliği ve daha uzun bir süre gerektirebilir zar kese bileşenlerinin geri alınışında, yeniden asitlenme ve geri dönüşüm gibi genişliği artış ile sigortalar. Benzer bir sonuç, son endokrin β-hücrelerinin 20 sinaptik benzeri microvesicle eksositoz analiz elde edilmiştir.

Şekil 1. TIRF mikroskop kurmak. TIRF mikroskop sistemi şematik görünümü ve görüntü (inset). Axio Gözlemci Z1 motorlu ters mikroskop (A), bir çok satırlı 100 mW Argon iyon lazer (B) ve bir TIRF-kaymak (C) içermektedir kurmak. Lazer ışığı (yeşil hat) ve beyaz ışık (sarı hat) gösterilmektedir. Hücreler 100 × immersiyon yağı objektif kullanılarak görüntülü. Dijital görüntüler soğutulmuş RetigaSRV Hızlı CCD kamera üzerinde yakalanır. refodaklama lector modül, emisyon (488/10 nm) ve uyarma (bant geçiren 525/50 nm) filtreler, kolimatör (L1) ve (L2) objektif gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. TIRFM yapılandırmasını alınıyor. (A) şematik karikatür objektif, kapak kayma, örnek ve lazer ışınının konumunu (mavi çizgi) gösteren. Sol, uyarma ışın kapak kayma-numune arayüzü üzerinden doğrudan geçecek . Örnek Epifloresans modunda olduğu gibi heyecanlı. Merkezi, kritik açıdan daha bir olay açı, alt numune ile uyarma ışın şekilleri, ışık değişken açıyla örnek aydınlatır. Sağ, uyarma ışın bir incid oluştururKritik açıdan daha büyük ent açı, ışık tamamlanır geri objektif lensin içine yansıyan, ve bir fani alan numunesinde yayar. Örnek kapağı ve uyarma ışın (mavi daire) konumunu gösteren (B) Karikatür, bu TIRF aydınlatma (sağ) doğru (sol) Epifloresans geçişte, amacın dışında ortaya çıkar. (C), epifloresans (sol) ve TIRFM (sağ) bir canlı SH-SY5Y hücrede synapto-pHluorin floresans ve görüntüler. Ölçek çubuğu:. 10 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 3. Veri işleme ve analiz. Canlı SH-SY içinde synapto-pHluorin floresan (A) TIRFM görüntüsü5Y hücre. Yeşil kare bir temsilci "arka plan yatırım getirisi" gösterir. Ölçek çubuğu 10 mikron. (B) arka plan ROI için önerilen iş akışı. Yukarıdan aşağıya:.... Arka plan ROI ölçülen floresan yoğunluğu değişiklikleri bir zaman ders; ilk floresan değeri (F / F0) floresan değişiklikleri b normalleşme, üstel regresyon c uygulaması d düzeltme photobleaching için, e. eşik değerlendirme (saydam gri kare). Canlı bir SH-SY5Y hücrede synapto-pHluorin floresans (C) TIRFM görüntüsü. Beyaz kare bir temsilci "deneysel yatırım getirisi" gösterir. Ölçek çubuğu 10 mikron. Deneysel ROI için (D) Önerilen iş akışı. .. Üstten alta kaynaktan: b başlangıç ​​floresans değeri (K / F0) veri normalizasyonu, bir floresan yoğunluğu değişikliklerinin zaman süreci, c. düzeltme;. mantıksal fonksiyonların de uygulaması pik sayısı, AUC, genişlik ve yükseklik tespit etmek. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. Tam hücre analizi. Canlı bir SH-SY5Y hücrede synapto-pHluorin floresans (A) TIRFM görüntüsü. Hücreler dinlenme altında kaydedilmiştir ve (1 Hz örneklenmiş) (25 mM KCI uygulaması) koşullar uyarılır. Ölçek çubuğu: 10 mikron. Otomatik prosedür tarafından tanımlanan (B) noktalar TIRFM resmin üzerine bindirilmiş (yeşil renk) gösterilmektedir. Dinlenme koşulları altında, tüm hücre otomatik prosedürle seçilen noktalar (C) normalleştirilmiş floresan yoğunluğu profilleri (K / F0). (D) Normalizuyarılmış koşullar altında seçilen noktalar ed floresan yoğunluğu profilleri (F / F0). izleri üzerinde bar KCl uygulamasını gösterir. (EH) olaylar ve (mavi) ve uyarılmış (kırmızı) koşulları altında istirahat tüm hücrede kaydedilen floresan yoğunluğu değişiklikleri sayısı. (E) Histogramlar hücrede kaydedilen füzyon olayları toplam sayısını gösteren. (F) füzyon olayları zamansal dağılımı. (G) bütün hücre (Toplam EAA) ortaya çıkan pHluorin flüoresan yoğunluğundaki değişiklik gösteren histogramlar. Zamanın bir fonksiyonu olarak kümülatif pHluorin floresan yoğunluğu değişiklikleri gösteren (H) eğrileri. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

(A), SH-SY5Y hücreleri, sadece dinlenme şartları altında, 1 Hz görüntülü. Bir synapto-pHluorin gösteren bir ROI Temsilcisi TIRFM sıralı görüntüler (her 2 sn) vezikülü etiketli. YG 40 x 35 piksel =. Bir gösterilen ROI (B) Normalize floresan profili (F / F0). Siyah yıldız eşik çizgisi gösterilir, bir füzyon olayı gösterir. (C), aynı hücre stimüle koşullar (25 mM KCI) altında kaydedilir, bir ROI temsilcisi TIRFM sıralı görüntüler gösterilir. KCI uygulama sarı yıldız işareti ile gösterilir. (D) C de gösterilen bölge normalleştirilmiş floresan profili veziküller (in) varış ve kaybolması (out) vurgulamaktadır. Siyah yıldız füzyon olayları göstermektedir, eşik çizgisi gösterilir. (EG) istirahat (mavi bar) altında kaydedilmiştir ve uyarılmış tek kese olayların özellikleri ( Kırmızı çubuk) şartları. n = 40 füzyon olayları. (E) Sol, pik alanı (EAA) açık mavi ile gösterilir, sağ, ortalama pik alanlarının histogramlar; ** P <0.01. (F) Sol, pik yüksekliği (h) çift başlı ok ile gösterilen, merkez, ortalama pik yüksekliği histogramlar; ** P <0.01; sağ, pik yükseklik füzyon mekanizması belirtir. Karikatürde yıldız synapto-pHluorin gösterir. (G) Sol, tepe genişliği çift başlı ok ile gösterilen, merkez, ortalama pik genişliği histogramlar; * P <0.05, sağ, tepe genişliği vezikül ekzositoz, bağlanma ve endositoz süreyi belirtir. synapto-pHluorin floresan görünür ve-off açıldığında. gri olduğunda yıldız rengi yeşildir , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Synapto-pHluorin ifade video 2. SH-SY5Y hücreleri (1 Hz örneklenmiş) uyarılmış koşullar altında kaydedilir. KCI perfüzyon gösterilir. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.