Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İzole Perfüze Omurgalı Retina için bir Stres Modeli olarak Glutamat ve hipoksi

7.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52270

⸱

22 Mart 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ophthalmology, University Eye Hospital Tübingen

Bu makalede

Özet

Bu çalışma ile, gelecekteki klinik öncesi tedavi test için izole Süperfüzyonlu sığır retina için bir standart stres modeli tanıtmak. a- ve b-dalgası genlikleri ile temsil retina fonksiyonu ya hipoksi (saf N 2) ya da glutamat stres (250 uM glutamat) etkisi değerlendirildi.

Özet

Nöroproteksiyon geçmiş yıllarda göz araştırma soruşturma güçlü bir alan olmuştur ve glokom, retina damar tıkanıklığı, retina dekolmanı ve diyabetik retinopati gibi hastalıklar etkilemektedir. Gelecekteki preklinik tedavi test için bir standart stres modeli tanıtmak için bu çalışmanın amacı idi.

Sığır retina hazırlanmış ve bir oksijen doymuş standart solüsyonu ile perfüze ve ERG kaydedildi edildi. Sabit b-dalgalar, hipoksi (saf N 2) ya da glutamat stresi (250 mikron glutamat) kaydettikten sonra 45 dakika boyunca sarf edildi. Yalnız fotoreseptör fonksiyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için, 1 mM aspartat bir-dalgaları elde eklendi. ERG kurtarma 75 dakika boyunca izlendi.

Hipoksi için, 87.0% bir dalga amplitüdünde bir azalma, 45 dakika (yıkama p = 0.03 sona erdikten sonra 36.5% azalma) bir fuar süre sonra (p <0.01) tespit edilmiştir. Buna ek olarak, bir başlangıç ​​DECRistatistiksel anlamlılık ulaştı, 87,23% kaydedildi b-dalgası genlikleri kolaylık (p <0.01, arınma sonunda, p = 0.03 olarak% 25.5 azalma).

250 mikron glutamat,% 1,9 (p> 0.05) bir azalma ardından dalga genlikleri (p> 0.05) bir başlangıç% 7,8 azalma için. B-dalgası genlikleri (p <0.01) not edildi% 83.7 azalma; 75 dakikalık bir yıkanmasından sonra azalma% 2.3 (p = 0.62) olmuştur. Bu çalışmada, bir standart strestir gelecekte mümkün nöro-koruyucu etkilerini belirlemek için yararlı olabilir sunulmuştur.

Giriş

Nöroproteksiyon geçmiş yıllarda göz araştırma soruşturma güçlü bir alan olmuştur. Retina oksijenasyonu önemli ölçüde bağlıdır ve onun çevresindeki hücrelerin metabolizması tarafından şiddetle etkilenir son derece hassas nöronal ağ. Sinir hücre hasarına bağlı Binbaşı oküler patolojiler retinal vasküler tıkanıklıklar, glokom, retina dekolmanı ve vardır.

Retina arter oklüzyonu, retinal damar oklüzyonu için bir örnek olarak, bağlı iç retina 1 hipoksi ani görme kaybına neden olur. Genellikle görme keskinliği önemli ölçüde 1 kurtarma hastaların sadece% 8 ile, kalıcı görme kaybı 1 genel damar patolojileri 2 ve yol ile ilişkilidir. Arteriyel fıbrinoliz bir tedavi seçeneği olarak öne sürülmüştür rağmen, fayda randomize klinik çalışmada 3 gösterilen olamazdı.

Glokom ve retina dekolmanıHer iki glutamat konsantrasyonu 4-6 artış var. Fizyolojik koşullar altında Glutamat, tüm santral sinir sistemi boyunca bir uyarıcı verici ve iç retina 7,8 olarak karşımıza çıkmaktadır. Artmış glutamat seviyeleri, sadece glokom ve retina dekolmanı 5,6 değil, aynı zamanda, proliferatif diyabetik retinopati 9 tespit edilmiştir. Glutamat bir artış muhtemelen, bu nedenle, sinir hücresi harabiyetini 10 nörotoksitisi yol açmaktadır. Retina dekolmanı ve retina (pars plana vitrektomi) proliferatif diyabetik retinopati ameliyat bazı durumlarda Çoğu durumda gereklidir. Pars plana vitrektomi mekanik manipülasyon sırasında, optik fiber veya uzun işlemler sırasında sulama çözümleri yüksek akış oranları tarafından uygulanan kesme stresi parlak ışık retina 11,12 ek bir stres uygular.

Tüm söz konusu hastalıklar patoloji Retin lokalize olduğu ortakBir yalnız ve bir nörosensorial sistemi olarak retina korumak için yollar bulmak için bir meydan okuma ile göz topluluk oluşturmaktadır.

elektroretinogram (ERG), in vivo fotoreseptör fonksiyonu (a-dalgası) ve iç retina (b-dalgası) fonksiyonunun değerlendirilmesi için standart bir yöntemdir. ERG kornea içine gümüş elektrotlar ile ölçülür ve gözler çubuk veya koni veya iç retina kusurları tespit etmek ışığın bir çok artan düzeyde tarafından teşvik ediliyor. Retinada farklı kusurlar genlik (tepkisinin gücü) veya ERG gecikme (zaman-tepki aralığı) değişim ile saptanabilir. Farklı ERG protokolü ve ölçüm yöntemleri (desen-ERG, multifokal ERG-veya parlak bir alan ERG) kusurların daha farklılaşmasını sağlar. izole retina tekniği mümkün bir çalışmada hayvansal en örn etkilenmeyen retina üzerine etkilerini değerlendirmek için yapım, son zamanlarda girmiştirGenel reaksiyonlar 13,14.

Bu değerlendirme ve superfused izole retina üzerinde hipoksi ve glutamat stres tanımlanmış ve standart stres modeli tanıtmak için bu çalışmanın amacı idi. Böylece, biz bazı ajanlar veya göz içi sulama çözümleri nöroprotektif etkileri gelecekteki çalışmalar için temellerini umuyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Sığır Eyes 1. Hazırlık

  1. Hayvan kesildiği hemen sonra sığır gözleri edinin.
  2. "Sickel çözeltisi" korunan gözleri Taşıma 120 mM NaCI, 2 mM KCI, 0.1 mM MgCl2, 0.15 mM CaCl2, 1,5 mM NaH 2 PO 4, 13.5 mM Na 2 HPO 4 ve 5 mM glikoz de ihtiva eden özel bir ortam RT.
  3. Loş bir kırmızı ışık ile koyu adapte koşullar altında retina hazırlanmasını gerçekleştirin.
  4. Gözün ön kısmını çıkarın. Bir ekvator kesi ca. gerçekleştirin Limbusa 4 mm arka. Bundan sonra tek parça halinde kornea, iris, siliyer cisim ve merceği çıkarın. Sickel-çözeltide retina tutun.
  5. Mekanik retina yüzeyine vitreus ekleri gevşetin ve açık göz fincan vitrözü çıkarın.
  6. Daha sonra dört parçaya bölünür göz bölmek ve yaklaşık alanlarında yuvarlak dışarı yumruk Bir trefin kullanarak 7 mm çaplı.
  7. Yavaşça retina ayrıpigment epitel ve ışıktan korunan bir kutu içinde bir kayıt cihazına yerleştirin. kayıt cihazı ortada bir ağ ile plastik bir koruyucu ile oluşur; örgü üzerine retina yerleştirin ve elektrotlar üzerinde doğrudan bir plastik halka ile düzeltmek sonra.
    NOT: Plastik sürdürme ortamının sürekli bir akış sağlamak için iki kanal vardır.

2. Kayıt Elektroetinogram (ERG)

  1. , Elektroretinogram kayıt retina her iki tarafında iki gümüş / gümüş klorür elektrodu ve yaklaşık sabit bir perfüzyon hızı ile retina serpmek için 1 ml / dakika ve 37 ° C sabit bir sıcaklıkta. Oksijen ile doymuş "Sickel-çözüm" kullanın.
  2. Ölçüm başlamadan önce, karanlık bir retina (tüm ölçümler sırasında ışıktan korumak) uyum ve beş dakika uyaran aralıkları kullanın. Retina yüzeyinde 6.3 MLX ayarlanmış bir yoğunluk ile uyarılması için bir 1 Hz tek beyaz Xenon flaşı kullanın.
  3. Kullanım nötral yoğunluk filtreleri ve optimal yanıtları sahip olmak için bir zamanlayıcı tarafından kontrol 10 mikro saniye olduğu bir ışık uyaranı kalibre.
  4. Ölçmek ve verileri işlemek, ERG filtre ve bir Grass RPS312RM Amplifikatör kullanarak (100 Hz yüksek geçiren filtre, 50 Hz çentik filtresi, 100,000 x büyütme) yükseltmek için. Sinyali bozabilir olası rahatsız edici frekansları filtrelemek için deneyin. Verileri işlemek için, bir masaüstü bilgisayar (PC uyumlu) bir analog-dijital veri toplama tahtası kullanın.
  5. Istikrarlı b-dalgası genlikleri kaydedilir kadar sürekli perfüzyon altında karanlık adaptasyonu döneminden sonra, elektrik sinyali genlikleri ölçün.
    NOT: Beş tek ölçümler ortalama değerine ulaşmak ve daha az% 10 sapma durumunda Amplitüdleri stabil olarak kabul edilir. Tek ölçümlerindeki iyi bir örnek, Şekil 1 'de verilmiştir.
  6. Test başlatmak için ya saf azot saf oksijen yerine (tek deneylerin sayısı, n = 5) hipoksi test etmek içinveya 250 um glutamat (n = 5).
  7. Elektrik yanıtları 45 dakika boyunca her 5 dakika kaydedin.
  8. Test döneminden sonra, 75 dakika boyunca oksijen ile doymuş standart ortam ile retina serpmek ve b-dalgası genlik değişiklikleri bakmak. Bu arınma aşamadır. B-dalgası zirve bir dalga çukur b-dalga amplitüdü ölçün.
  9. Scotopic koşullar altında fotoreseptör potansiyeli hipoksi veya glutamat etkisini araştırmak için, besin çözeltisine 1 mM ekleyerek b-dalga bastırmak.
  10. 30 dakika boyunca sabit bir fotoreseptör potansiyeli kaydedildikten sonra, 1 mM aspartat ile farklı sulama çözümlere retina 45 dakika maruz, daha önce olduğu gibi işlem yapmak. Daha önce belirtildiği gibi, aynı arınma dönemi (adım 2.8) kullanın.

3. Veri Analizi

  1. Istatistiksel verileri değerlendirmek amacıyla, Kolmogorov-Smirnov kullanarak, örneğin tüm veriler için normal bir dağılım sağlamakTest 15.
  2. Fuar öncesi son ölçüm karşılaştırıldığında maruz aşamasından sonra yüzdelerle a- ve b-dalgası genliklerinin azalma hesaplayın. 45 dakika sonra ERG-genliklerinin azalma karşılaştırın - ERG için uygulamadan önce ölçülen - fuar dönemi sonunda.
  3. Olası bir kurtarma incelemek için fuar öncesinde ilgili genlik arınma fazının sonunda a- b- ve dalga karşılaştırın.
  4. İstatistiksel analiz için, yazılım JMP istatistik yazılımı veya SPSS yazılımını kullanın. Ortalama ± standart sapma olarak boyunca verileri hesaplayın. Uygun istatistiksel testi ile önemini tahmin.
    NOT: Bu testler deneysel kapsamına bağlı olarak farklı olabilir. Bu ortamda, eşli t-testi kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Oksijen-doymuş standart solüsyonu (Şekil 1A ve B) ile retina preparatların perfüzyon 1 saat sonra ERG-genlikleri istikrar ve tek ölçümler arasındaki genliklerinin daha az değişim göstermiştir. pH değeri, ozmotik basınç, sıcaklık ve (hipoksi testleri için hariç) pO 2 tüm testler için sabit tutulmuştur.

Iç retina sinyalinden fotoreseptör sinyali izole edilmesi için, 1 mM aspartat b-dalgası (Şekil 1A) bastırmak için standart çözeltiye ilave edildi. Hipoksi etkisi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, hipoksi, 45 dakika sonra, b-dalgası amplitüd üzerinde önemli bir etkisi bulunmuştur. Bu azalma hala arınma aşamasından sonra anlamlı oldu. Fotoreseptör potansiyeli benzer bir etki gözlenmemiştir.

sonuçlar diğer yayınlanmış veriler 16 ve bize hipoksi sonra mümkün nöroprotektif etkilerini incelemek için fırsat vermek tarafından desteklenmektedir.

250 uM glutamat 45 dakika fuar sonra, biz sadece arınma döneminin sonunda tamamen geri dönüşlü ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu makale sevgili eşim Maren'e ve küçük Karl'a adanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
120 mM NaCl Merck Pharma, Almanya1.064.041.000
2 mM KCl,   Merck Pharma, Almanya1,050,010,250
0.1 mM MgCl2, Merck Pharma, Almanya58,330,250
0.15 mM CaCl2Merck Pharma, Almanya111 TA106282
1.5 mM NaH2PO4/13.5 mM Na2HPO4   Merck Pharma, Almanya1.065.860.500
5 mM glikozMerck Pharma, Almanya40.741.000

Kaynaklar

  1. Varma, D. D., Cugati, S., Lee, A. W., Chen, C. S. A review of central retinal artery occlusion: clinical presentation and management. Eye (Lond). 27, 688-697 (2013).
  2. Resch, M., Suveges, I., Nemeth, J. Hypertension-related eye disorders). Orv Hetil. 154, 1773-1780 (2013).
  3. Feltgen, N., et al. Multicenter study of the European Assessment Group for Lysis in the Eye (EAGLE) for the treatment of central retinal artery occlusion: design issues and implications. EAGLE Study report no. 1 : EAGLE Study report no. 1. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 244, 950-956 (2006).
  4. Dreyer, E. B., Zurakowski, D., Schumer, R. A., Podos, S. M., Lipton, S. A. Elevated glutamate levels in the vitreous body of humans and monkeys with glaucoma. Arch Ophthalmol. 114, 299-305 (1996).
  5. Bertram, K. M., et al. Amino-acid levels in subretinal and vitreous fluid of patients with retinal detachment. Eye (Lond). 22, 582-589 (2008).
  6. Diederen, R. M., et al. Increased glutamate levels in the vitreous of patients with retinal detachment). Exp Eye Res. 83, 45-50 (2006).
  7. Ientile, R., et al. Apoptosis and necrosis occurring in excitotoxic cell death in isolated chick embryo retina. J Neurochem. 79, 71-78 (2001).
  8. Mali, R. S., Cheng, M., Chintala, S. K. Plasminogen activators promote excitotoxicity-induced retinal damage. FASEB J. 19, 1280-1289 (2005).
  9. Ambati, J., et al. Elevated gamma-aminobutyric acid, glutamate, and vascular endothelial growth factor levels in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Arch Ophthalmol. 115, 1161-1166 (1997).
  10. Vorwerk, C. K., et al. Depression of retinal glutamate transporter function leads to elevated intravitreal glutamate levels and ganglion cell death. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 3615-3621 (2000).
  11. Schultheiss, M., et al. Dulbecco's Modified Eagle Medium is neuroprotective when compared to standard vitrectomy irrigation solution. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 251, 1613-1619 (2013).
  12. Januschowski, K., et al. Comparing the effects of two different irrigation solutions on an isolated perfused vertebrate retina. Ophthalmic Res. 48, 59-66 (2012).
  13. Sickel, W. Respiratory and Electrical Responses to Light Simulation in the Retina of the Frog. Science. 148, 648-651 (1965).
  14. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain research. Brain research protocols. 16, 27-36 (2005).
  15. Henderson, A. R. Testing experimental data for univariate normality. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 366, 112-129 (2006).
  16. Alt, A., et al. The neuroprotective potential of Rho-kinase inhibition in promoting cell survival and reducing reactive gliosis in response to hypoxia in isolated bovine retina. Cell Physiol Biochem. 32, 218-234 (2013).
  17. Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision research. 39, 2165-2177 (1999).
  18. Richter, S. H., Garner, J. P., Wurbel, H. Environmental standardization: cure or cause of poor reproducibility in animal experiments. Nat Methods. 6, 257-261 (2009).
  19. Dutescu, R. M., et al. Multifocal ERG recordings under visual control of the stimulated fundus in mice. Investigative ophthalmology & visual science. 54, 2582-2589 (2013).
  20. Perlman, I. Testing retinal toxicity of drugs in animal models using electrophysiological and morphological techniques. Doc Ophthalmol. 118, 3-28 (2009).
  21. Mukhopadhyay, A., Gupta, A., Mukherjee, S., Chaudhuri, K., Ray, K. Did myocilin evolve from two different primordial proteins. Mol Vis. 8, 271-279 (2002).
  22. Januschowski, K., et al. Evaluating retinal toxicity of a new heavy intraocular dye, using a model of perfused and isolated retinal cultures of bovine and human origin. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 250, 1013-1022 (2012).
  23. Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Res Brain Res Protoc. 16, 27-36 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Glutamat StresiHipoksi Modeliİzole RetinaElektroretinogram KaydıSığır Retinası PreparasyonuA Dalgası AmplitüdüB Dalgası AmplitüdüNöroprotektif Ajan TestiERG İyileşme AnaliziKaranlık Adaptasyon Protokolü
İzole Perfüze Omurgalı Retina için bir Stres Modeli olarak Glutamat ve hipoksi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.