Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

19.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52281

⸱

22 Ocak 2015

 ,  ,  , 
1Institut Curie, Centre de Recherche, CNRS, UMR 168, PhysicoChimie Curie, Université Pierre et Marie Curie, 2Kavli Institute for Brain and Mind, University of California, San Diego, 3Molecular Physiology and Biophysics Section, National Institute for Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health

Bu makalede

Özet

electroformation ve jel destekli şişme - dev tek tabakalı veziküller (GUVs) içine transmembran protein, KvAP, şifreden iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri için gösterilmiştir. Her iki yöntemde de, protein içeren küçük tek lamelli kesecikler, sonra, flüoresans mikroskopisi ve yama klempi elektrofizyoloji ile incelenebilir GUVs oluşturmak üzere bir araya birleştirilir.

Özet

Dev lamelli kesecikler (GUVs) membran ilişkili olayları incelemek için popüler bir biomimetic sistemi vardır. Ancak, genel olarak GUVs fonksiyonel transmembran proteinleri içeren GUVs oluşturmak üzere tadil edilmesi gerekmektedir büyümeye protokolleridir. Electroformation ve jel destekli şişme - - voltaj-kapılı potasyum kanalı, KvAP içeren GUVs oluşturmak için Bu makalede, iki dehidrasyon-rehidrasyon yöntemleri açıklanmaktadır. Her iki yöntemde de, protein ihtiva eden küçük tek lamelli vesiküller bir çözeltisi daha sonra bir rehidrasyon tamponu içinde şişmeye bırakıldı membran bir yığın oluşturmak üzere kısmen dehidre edilmiştir. AC alanı film rehidrasyon esnasında uygulanabilir ve böylece electroformation yöntemi için, film, platin elektrot üzerine bırakılır. Bunun tersine, jel destekli şişme yöntem filmi rehidrasyon geliştirmek üzere bir agaroz jel alt tabakayı kullanır. Her iki yöntem de (örneğin, 5 mM) ile, düşük ve fizyolojik (örneğin, 100 mM) tuzu konsantrasyonlarında GUVs üretebilir. Elde GUVs floresan mikroskobu ile karakterize edilir ve yeniden kanalların fonksiyonu iç-dış yama-kelepçe yapılandırmayı kullanarak ölçtü. Alternatif elektrik alanı (electroformation) mevcudiyetinde şişen hatasız GUVs yüksek bir verim sağladığını birlikte, jel destekli şişme yöntem daha homojen bir protein dağılımı sağlar ve herhangi bir özel ekipman gerektirir.

Giriş

Canlı sistemleri yöneten fiziksel ilkeleri incelerken, aşağıdan yukarıya yaklaşımlar bir Deneyciler sistemi kompozisyon ve kolayca hücre tabanlı sistemler 1 manipüle olmayan diğer parametreleri kontrol etmenizi sağlar. 10 - bunlar mikroskop çalışmaları ve mikromanüplasyon 8 için uygun olarak 7 - membran bazlı işlemler için, Dev tek katmanlı veziküller (GUVs, çap ~ 1-100 um) çok yararlı biomimetik sistemi 2 olduğu kanıtlanmıştır. GUVs üretmek için birçok farklı protokoller olmakla birlikte, en fazla iki kategoriye ayrılır - 16 - bazlı emülsiyon, bir lipit filme 13 rehidrasyon dayalı 11,12 ve teknikleri yaklaşır. Emülsiyon bazlı yöntemlerde, GUV membran iç ve dış bildiriler su / yağ ara yüzlerinde lipit mono tabakaları arka arkaya monte edilir. Bu yaklaşım ile çözülebilir proteinlerin kapsüllenmesinde için idealdirGUVs olarak ve asimetrik yaprakçık lipit bileşimiyle GUVs oluşturulması için. Bununla birlikte, emülsiyonlar meydana GUVs zarın mekanik özellikleri 17 değiştirmek çözücünün izlerini tutabilen ve bu yaklaşım, trans-membran proteini yeniden için özellikle çok uygundur değildir.

Film rehidrasyon yöntemleri (dehidratasyon), kurutma zarların çoklu katmanlı yığını oluşturmak için birçok lipit karışımları neden olduğu gerçeğine dayanır. Bu yığın daha sonra sulu bir tampon maddesi ile temas içinde yerleştirilir, yığındaki membranlar aralarında ve yığın yüzeyinde ayrı çözücü akışı hareket eder, ayrı ayrı membranlar GUVs 13,18 (aynı zamanda, gerçek bir hayvanat bahçesi oluşturmak üzere ayırabilirisiniz Diğer lipidik nesneler). Bununla birlikte, daha iyi bir tampon ve lipid bileşimleri için, bu klasik "kendiliğinden şişme" yöntemi hatasız GUVs nispeten düşük bir verime sahiptir. Hatasız GUVs verimini artırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir "electroformation olduğunuBir alternatif akım (AC) alanı film rehidrasyon esnasında uygulandığı 221 ;,. Mekanizma henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, "electroformation" Muhteşem GUV verimleri verebilir (> olumlu koşullarda% 90), düşük tuz konsantrasyonu tamponlar için (<5 mM) 14,19, ve hatta (~ 100 mM) fizyolojik tamponlar çalışabilir kullanarak bir yüksek frekans (10 Hz karşı 500 Hz), AC alanı ve platin elektrotları 15. Hatasız GUVs verimini artırmak için alternatif bir yaklaşım, lipid çözeltisi (örneğin, cam, PTFE), alt-tabakalar, klasik "bir anda şişme kullanılan pasif değil, bir polimerik jel alt-tabaka üzerine biriktirilmektedir," jel destekli şişme "bir ". Elde edilen yağ / jel ince tabaka rehidrate zaman, GUVs bile hızlı bir fizyolojik tampon 16,20 için oluşabilir.

Tüm bu yöntemler, örneğin zara bağlı olayları incelemek için kullanılabilir lipid tek GUVs üretebilirçözünür proteinler ve zarlar arasındaki etkileşimi kapsamaktadır. Bununla birlikte, GUVs bir trans-membran proteini birleştirmek için önemli değişiklikler proteinin yeniden oluşturma işlemi boyunca işlevsel bir durumda kalmasını sağlamak için gereklidir. Organik çözücüler (örneğin kloroform, sikloheksan) lipidlerin çözeltileri lipit film üretmek için idealdir birlikte, hidrofobik zar-ötesi domeni bir lipid iki-tabaka içinde gömülü ya da bir deterjan misel içine alındığında, trans-membran proteinleri tipik olarak, sadece kararlı olan ( Örneğin, protein saflaştırma sırasında). Bu nedenle, bir yeniden başlangıç ​​malzemesi tipik olarak deterjan çıkarılmasıyla oluşan doğal membran, bir deterjan çözeltisi içinde saflaştırılmış proteini ya da küçük tek lamelli protein içeren veziküller (proteolitik-SUV) ve / veya çok-lamelli veziküller (proteolitik-MLV'ler) 'dir lipidlerin mevcudiyeti. GUVs içine bu zar proteinleri dahil çoğu yöntemleri üç kategoriye ayrılır.

Doğrudan insertioN: deterjan içinde süspansiyon haline trans-membran proteini önceden oluşturulmuş, lipid sadece hafif deterjan çözündürülmüş GUVs ile karıştırılır ve daha sonra deterjan Biobeads 21 kullanılarak kaldırılır. Kavramsal olarak basit olmakla birlikte, bu yöntem çok yüksek bir deterjan konsantrasyonunun bir konsantrasyon proteini açığa veya agregat neden olabilir çok düşük ise GUVs eritmesi olarak, deterjan konsantrasyonunun hassas kontrolünü gerektirir.

GUV / Proteo SUV Füzyon: proteolitik-SUV Protein, önceden oluşturulmuş, lipid sadece GUVs ile birleştirilir ve füzyon özel füzyojenik peptidler 22 veya deterjan 21 ile kolaylaştırılır. Tipik füzyon ölçüde düşük protein yoğunluğu ile GUVs lider kısıtlıdır.

Dehidrasyon / Rehidrasyon: bir protein ihtiva eden lipid filmi kısmi bir proteolitik-SUV dehidrasyon (ya da proteolitik-MLV) çözeltisi ve GUVs oluşturduğu sonra saf bir lipit film için büyütülür. bariz zorluk kısmi dehydrati sırasında protein korumak25 - Adım 23, ancak yöntemi başarılı bir şekilde GUVs 7,23 içine örneğin bakteriyorodopsin, Kalsiyum-ATPaz, integrin ve SSVD'de trans-membran proteinleri oluşturmak için kullanılan edilmiştir.

Bu makalede, hiper-termofilik Archaea, Aeropyrum pernix voltaj kapılı potasyum kanal KvAP içeren GUVs için dehidratasyon / rehidrasyon protokollerini tasvir eder. KvAP ökaryotik voltaja bağımlı potasyum kanalları 26 homoloji derecesi yüksek ve bilinen bir kristal yapıya sahip olan 27 , gerilim yolluk mekanizması okuyan için iyi bir modeli yapma. Proteolitik-SUV üretimi, daha önce detaylı bir şekilde tarif edilmiş ve bu yazının 26,28,29 bir parçası değildir edilmiştir. Önemli olarak, KvAP proteolitik-SUV da uzun bir süre (> 1 yıl), -80 ° C'de küçük (örneğin, 10 ul) bölümler halinde saklanabilir gibi her GUV hazırlanması için imal edilmesi gerekmez. Electroformationya da jel destekli şişme sonra KvAP proteolitik-SUV'lerden GUVs büyütmek için kullanılan (ya da proteolitik-MLV'ler) olabilir.

electroformation protokolü için temel aşamalar, Şekil 1 'de tasvir edilmiştir. Protein içeren SUV solüsyonu damlalar (Şekil 2'de gösterilmiştir) platin tellerden birikirler. SUV süspansiyonun kısmi dehidrasyon SUV füzyon yoluyla bir lipit, protein film tabakasının oluşmasına neden olur. Rehidrasyon esnasında, bir AC alanı GUVs delamine oluşturmak üzere, lipid tabakaları yardımcı olmak için elektrotlara uygulanır. "Düşük tuz" kullanılırken 10 Hz alanı iyi çalışıyor (<5 mM) rehidrasyon tampon 28 ve GUVs birkaç saat sürebilir büyümeye. Buna karşılık, fizyolojik tamponlar düşük gerilim, 500 Hz AC alanı ile iyi çalışır, ancak gerektirir (tuz ~ 100 mM içeren) bir uzun (~ 12 saat) dönemi 15 şişlik. Bu yöntem İTO 24 slaytlar kullanarak bir önceki protokol dayalı, ama özel bir odası cont kullanırŞekil 2'de görüldüğü gibi iki platin tel, geri kalan (basit tasarım detayları ve önerileriniz için tartışma bakın, odaları doğaçlama).

Şekil 3, jel destekli şişme yöntemi göstermektedir. Protokol, fizyolojik tuz konsantrasyonlarına sahip tampon maddeler ile iyi çalışır hızlı ve daha homojen olan bir protein dağılımı GUVs üretir. Ancak, izole, görünüşe göre hatasız GUVs verimi (yani, GUV membran üniforma optik uzunluk-ölçeklerde ve herhangi bir nesne içine değil) bu yama-kelepçe ve mikro-manipülasyon deneyler için yeterli sayıda sağlamasına rağmen, düşük . Bu yöntem, lipid sadece GUVs 16 üretmek electroformation yöntemine göre daha az özel ekipman gerektirir agaroz jel kullanılarak bir protokole dayanmaktadır.

floresan mikroskobu ile GUVs karakterizasyonu standart yama-kelepçe set-up kullanarak prosedürler yanı sıra, açıklanan"inside-out" in KvAP aktivitesini ölçmek membran yamaları çıkarıldı.

Büyüyen protein ihtiva eden GUVs lipid tek GUVs daha zor olabilir. Özellikle, son GUV verimi membran yığını oluşturmak için tam olarak nasıl SUV çözümü yatırılır ve susuz üzerinde hassas güvenebilirsiniz. GUVs herhangi bir önceki deneyim, bir kimse için, ilk membran film, organik bir çözücü lipitleri biriktirilmesiyle oluşturulduğu bilinen bir protokol 15,16 aşağıdaki lipid tek GUVs büyümeye yardımcı olabilir. Geleneksel protokol iyi çalışıyor sonra, SUV biriktirme ve kısmi dehidratasyon sonra yeni bir lipit kompozisyonu için protokol ayarlarken de çok yararlı olan lipit sadece SUV'lar kullanılarak hakim olabilir. GUVs lipid tek SUV ile ilgili güvenilir büyüdüklerinde, bu proteolitik-SUV protein ihtiva eden GUVs üretmek için sadece küçük bir adım daha sonra.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Çözüm hazırlanması

  1. 5 mM KCI, 1 mM HEPES (pH 7.4) veya tris (pH 7.5) ve 2 mM trehaloz içeren "SUV tamponu" 5 ml hazırlayın. 0.2 um'lik bir şırınga filtresi ile filtre tampon ve -20 ° C'de muhafaza edilebilir, 1 ml'lik porsiyonlar halinde böler.
    NOT: reaktif ve aletler için ek ayrıntılar malzemeleri listesinde verilmiştir.
  2. Film rehidrasyon sırasında GUV içini dolduracak Şef 'Büyüme Tampon' 40 ml hazırlayın. 'Düşük bir tuzu büyümesi için, 5 mM KCI, 1 mM HEPES (pH 7.4) ya da 1 mM TRIS (pH 7.5) ve ~ 400 mM sukroz birleştirir. Bir fizyolojik tuz "büyüme için, 100 mM KCI, 5 mM HEPES (pH 7.4) veya 5 mM Tris (pH 7.5), ve yaklaşık 200 mM sukroz birleştirir.
  3. 100 mM KCI, 5 mM HEPES (pH 7.4) veya 5 mM Tris (pH 7.5), ve yaklaşık 200 mM glukoz birleştirerek deney odası içinde dış çözüm 'Gözlem Tamponu' 40 ml hazırlayın.
    NOT: Bu tamponlar sadece exa vardırörnek olarak şunlar verilebilir. Diğer deneyler için tamponlar adapte tartışma bakın.
  4. Bir Osmometer ile büyüme ve gözlem tamponlarının osmolarities ölçün. GUVs lize ya da gözlem odasına büyüme odasına transfer katlanmayacak olmayacak şekilde% 1 içinde eşleştirmek için sakaroz veya glukoz ilave et.
    Not: sükroz, 1 mM (13.7, 40 ml başına mg), glikoz (40 ml başına 7.2 mg) ilave edildikten bu konsantrasyon aralığında, içinde yaklaşık 1 mOsm sureti ile osmolaritenin arttırır.
  5. 0.2 um'lik bir filtre ile büyüme ve gözlem tamponlar filtre edin ve bakteriyel büyümeyi inhibe etmek için 4 ° C'de saklayın.
  6. GUVs, sopa yaymak ve kayma olmayacak şekilde deney odası yüzeyleri pasifleştirilmesi için gerekli bir 5 mg / ml p-kasein çözelti oluşturmak için 20 mM TRIS (pH 7.5) tampon maddesi içinde 10 ml p-kazein 50 mg eritin. Beta-kazeın tamamen 0.5 mi alikotlar içinde, filtre (0.2 um) o (4 ° C'de birkaç saat kadar) içinde çözülür sonra hızlı dondurulmuş ve saklanabildiğiDaha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de (4 ° C'de saklandı çözülmüş alikolar tipik olarak 1 hafta için kullanılabilir).

2. SUV Hazırlık

  1. Hazırlayın ve daha önce yayınlanmış detaylı protokolü 28 aşağıdaki proteo-SUV hacimde dondurma. KvAP floresan (kütlece) 01:10 lipid oranının bir protein DPhPC SUV içine yeniden Alexa-488 maleimid (10 mg / ml) ile etiketlenmiş kullanın.
    Not: Yabani-tür KvAP hücre içi C-terminali (amino asit 247) yer alır monomer için bir sistein ihtiva eder.
  2. Floresan, Lipid-tek SUV:
    NOT: nitril eldiven ve koruyucu gözlük takan bir davlumbaz altında kloroform tutun. Kloroform onları çözülür gibi herhangi bir plastik kullanmaktan kaçının. Kloroform çözeltileri Teflon kapaklı ile amber cam viyaller içinde depolanmış ve cam şırınga kullanılarak aktarılabilir. Öncesi ve lipidler pipetle sonra kloroform ile en az 5 ila 10 kat, tüm cam durulama özen gösterin.
    1. 100 ul hazırlayınTexas Red-DPHE çözeltisinin 8.2 ul (1 mg / ml ile DPhPC çözeltisi 100 ul kloroform (10 mg / ml) ile karıştırmak suretiyle kırmızı flöresanlı lipid, Teksas Kırmızısı-DHPE, 0.5 mol% ihtiva eden, 10 mg / ml DPhPC SUV 1.5 ml amber cam şişe içinde) metanol.
    2. Şişe döndürülerek kimyasal başlığı içinde bir azot akışı altında lipitleri kurutun. Film kuru göründüğünde, kalan solventin çıkması için 3 saat vakum altında lipit yerleştirin.
    3. Lipidler SUV tampon 100 ul ekleyin ve vorteks şiddetle hiçbir lipit flakon duvarlarına yapışmış kalana kadar ve çözüm eşit süt olduğunu.
    4. SUV oluşturmak üzere, lipid çözeltisi sonikasyon. Ultrason çoğu hareketi neden kadar flakon konumunu ayarlayın ve flakon içine akış ve gereksiz çözüm ısıtmak için değil umurumda almak. Zaman olası çözüm saydam hale gelene kadar devam edin sonikasyon, ya da, şeffaf (uç sonication için 2-5 dakika, ~ banyo sonication için 20 dakika).
    5. Aliquot SUV (örneğin 10 ul veya 20 ul) ve dondurma (-20 ° C) daha sonra kullanmak.
      NOT: Yağlar, özellikle doymamış lipidler, kolayca arıza. Argon altında, 20 ° C (veya 80 ° C) mağazası lipit çözeltiler ve 6 ay içinde kullanın. Lipid yıkım ürünleri İnce Tabaka Kromatografisi ile tespit edilebilir.

Electroformation 3. GUV Büyüme

  1. Electroformation odasını hazırlayın.
    1. Odası temizlenmiş değilse, pencereleri kaldırmak tüm dolgu macunu ve yağ silin, teller ayıklamak ve durulayın ve su ve dönüşümlü etanol (≥70%) kullanarak bir dokuya sahip odasına fırçalayın.
    2. Iyi teller Rub aseton teller ve odasına daldırın ve 5 dakika sonikasyon. Bir doku tekrar aseton kullanarak her şeyi silin. 5 dakika boyunca etanol ve sonikasyon odasına koyun.
    3. Deliklerden kabloları takarak odasına monte, ve döndürmek ve ar emin olmak için teller silinE temiz. Damıtılmış su içinde odasına koyun, 5 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır ve bir azot ya da hava akımı ile bölme kurutun.
  2. SUV tamponu içinde 3 mg / ml SUV süspansiyonu 30 ul hazırlayın. , Protein ihtiva eden GUVs meydana proteolitik-SUV 8 ul birleştirmek için (DPhPC 10 mg / ml KvAP 01:10), flüoresan SUV 2 ul (10 mg / ml DPhPC,% 0.5 mol TexasRed-DPHE) ve SUV 20 ul 12.5 ve 0.1 mol% 'si TexasRed-DHPE: 1 lipid (kütle) oranında bir nihai protein için bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde tampon eklendi. Şiddetle çözüm karıştırın.
    1. Alternatif olarak, sadece flüoresan SUV 10 ul birleştirme, lipid sadece SUV ile protokolü uygulama (10 mg / DPhPC ve% 0.5 mol TexasRed-DPHE mi), 20 | il SUV tamponu ile yıkandı.
  3. SUV Çözüm yatırın.
    1. Teller üzerinde SUV çözümün küçük (<0.2 ul) damlacıkları yatırmak için 2 ul pipet veya 5 ul cam şırınga kullanın. Yaklaşık çözeltisi 1 ul boyunca damla bir dizi meydana getirmek üzere gerekli olanTel 1 cm. Damla yeterince küçük ve yeterince onlar dokunmak veya sigorta olmadığını aralıklı emin olun.
    2. Yatırılan SUV açık havada 30 dakika ~ için kurumasını bekleyin. Tüm damla yerleşti zaman lipit mevduat mikroskop ile gözlemlemek kolay, böylece, tel döndürün.
      NOT: SUV yeterince kuru değil yoksa büyüme tampon eklendiğinde protein zarar verebilir çok kurutma sırasında, onlar sadece, teller kapalı yıkayabilirsiniz. Hava nem kurutma oranı, kuruma süresi ve / veya hava nemi etkiler nedeniyle optimum sonuçlar 30 ayarlanabilir. teller üzerinde lipid filmi mikroskop altında görünür olmalıdır.
  4. Odasına birleştirin.
    1. Oda Bottom Seal: Bir boşluk olmadan yapışır, böylece bölme alt mühür karşı üç kuyu etrafında odasının tabanına vakum gres sürün ve nazikçe bir 40 mm x 22 mm lamel basın bir şırınga kullanın. Odasının kenarlarına (teller çıkış) ile Sealmacun sızdırmazlık. Üç kuyu özetleyen odasının üstünde vakum gres sürün.
    2. Her kuyu üstüne dolana kadar yavaşça büyüme tampon ekleyin. Bu elektrotlar kapalı lipit filmi şerit gibi kuyularda herhangi bir çözüm hızlı hareket kaçının.
    3. Alt lamel çıkarmak için özen, gres üzerine hafifçe üst kapak slayt basarak odasına kapatın. Üst kapak kayma kenarlarında tampon herhangi bir damla kaldırmak için bir doku kullanın.
      NOT: Bu lipit film, teller üzerinde kalmıştır onaylamak için mikroskop altında odasını incelemek için iyi bir zaman.
  5. İki timsah klipleri kullanarak telleri sinyal jeneratörü bağlayın. Düşük / yüksek tuz tamponu için kare (Vrms) ortalama frekans (düşük / yüksek tuz tamponu için 10 Hz / 500 Hz sinüs dalga) ayarlayın ve ölçmek ve 0.7 / 0.35 V kök teller arasındaki gerilimi ayarlamak için bir multimetre kullanın. Işıktan florofor korumak için alüminyum folyo ile bölmesi kapağı. T bırakınO GUVs düşük tuz tamponu için 2 ila 3 saat, ve yüksek tuz tamponu için 12 saat veya O / N için büyümeye.
  6. Jeneratörden odasına ayırın ve dikkatlice GUV büyümesini değerlendirmek için bir ters mikroskop üzerine yerleştirin. Erken teller GUVs ayırmak olabilir kuyularda yavaş, istikrarlı hareketleri veya sıvı akışını kullanın.
    NOT: her yerde tellerin alt yarısında GUVs epifluoresan ile görülebilir ise tel kenarlarında GUVs, faz kontrast (40X uzun çalışma mesafesi objektif) genellikle görebilir. Hiçbir GUVs görünür ise, üst yüzeye bakmak için teller döndürmeyi deneyin. GUVs birkaç gün boyunca bir büyüme odasında 4 ° C'de saklanabilir.

Jel-destekli Şişme tarafından 4. GUV Büyüme

  1. Saf 10 ml su ile agaroz 100 mg karıştırılmasıyla bir% 1 agaroz çözeltisi 10 ml hazırlayın. O ~ 20 sn için 480 W mikrodalga yerleştirerek kaynar kadar ısıtın. Agaroz tamamen eriyene emin olmak için karıştırın.
    NOT: Çözelti4 ° C'de saklandı ve gerektiğinde yeniden ısıtılabilir.
  2. Plazma-temiz (hava plazma) agaroz çözüm üzerinde güzel yayılır böylece 1 dakika için bir kapak-slayt. Plazma temizleme etkisi çabuk giyer sonraki 15 dakika içinde kapak-slaytlar kullanın.
  3. Bütün yüzeyi ıslatır çözelti, böylece, her 22 x 22 mm, 2 slayt sıcak agaroz çözeltisi 200 ul uygulanır. Dikey slayt eğin ve aşırı sıvı kaldırmak ve slayt üzerinde agaroz sadece ince bir tabaka pürüzsüz bırakmak için bir dokuya alt kenarı dokunun.
  4. 60 ° C'de bir sıcak plaka ya da fırın slayt yerleştirin ve en az 30 dakika kurumaya bırakın. Agaroz filmi gözle zor görülür. Slaytlar RT soğumaya sonra, hemen bunları kullanmak veya 4 ° C'de kapalı bir kapta kadar bir hafta saklayabilirsiniz.
  5. Standart 3,5 cm Petri kabındaki agaroz kaplı lamel yerleştirin.
  6. Bölüm 3.2'de SUV çözelti hazırlanır ve uygulanır ~ SUV çözeltisi (3 mg / ml lipid) içinde 15 ul~ Agaroz yüzeyine 30 çok küçük damla yavaşça. Çok agaroz katmanı deforme etmemeye dikkat edin.
  7. Yaklaşık 10-15 dakika boyunca hafif bir azot akımı altında slayt yerleştirin ve damlacıklar, kuru olarak gözle tampon buharlaşma takip edin.
  8. En kısa sürede SUV kurutulmuş gibi, slayt yüzeyini kapsayacak şekilde büyüme tampon ekleyin. Küçük 3,5 cm Petri kabı kullanımı tampon ~ 1 ml için.
  9. Şişme, 30 dakika daha devam ~ ve daha sonra faz-kontrast veya farklılık belirleyici kontrast (DIC), bir ters mikroskop kullanılarak odasında GUVs büyümesini incelemek için izin verir.
    NOT: Epifloresans gözlem, jel ve agaroz otomatik floresanstaki fluorophores güçlü bir arka plan zordur.

5. Hasat ve Gözlem GUVs

  1. Gözlem odasını (örneğin, küçük Petri veya cam lamel) GUVs batmıyor, böylece yayıldı ve oda altta patlama pasifleştiren. Cham Kapakber beta-kazeın çözeltisi ile alt, 5 dakika boyunca inkübe hava ya da bir azot akımı ile kuru saf su ile kazein solüsyonu çalkalamak ve son gözlem tampon eklemek (örneğin, ~ küçük bir petri 5 mm derinlik).
  2. GUVs Hasat. Açılış büyük (~ 2 mm çapında) yani 100 ul pipet uçları sonuna kesin ve kolayca GUVs yok edebilir pipetleme kesme stres gibi yavaş yavaş talip.
    1. Elektro-oluşturulmuş GUVs için, yavaşça üst lamel kaldırarak büyüme odasına açın. GUVs ayırmak için tel boyunca pipet hareket ederken ~ her tel ve aspirat üzerinde doğrudan 50 ul pipet yerleştirin.
      NOT: Bu tel "diğer tarafında" GUVs toplamak için tel döndürmek için yardımcı olabilir.
    2. "Jel destekli şişme" GUVs için, ilk GUVs lamel yüzeyinden ayırmak yardımcı olmak için birkaç kez petri yan dokunun. S ise 50 ul sadece lamel ve aspirat üzerinde pipet yerleştiringeri yüzeyi üzerinde ucu ulling. Doğrudan kadar 1 hafta boyunca 4 ° C'de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde bir gözlem odasına veya saklamak için hasat GUVs aktarın.
  3. , Bir ters mikroskop gözlem odasına yerleştirin gözlem odasına GUVs ekleyebilir ve GUVs odası altındaki yerleşmek için bir kaç dakika bekleyin.
  4. Hızla pürüzsüz, küresel ('kusur ücretsiz') "GUV adayları" bulmak için faz kontrast veya DIC ile odasına Anketi. Içinde yuvalanmış herhangi birini içeren küçük lipozomlar dışlamak için Epifloresans her "GUV aday" inceleyin. Son olarak, lipit floresan yoğunluğu tek bir zar (yani, tek katmanlı) ile homojen ve uyumlu olduğunu kontrol edin.
    NOT: faz kontrast ya da DIC görüntüler tek katmanlı görünür yüzden bazı bilamellar (ya da çok-tabakalı) kesecikler içinde zarlar çözülmesi için birbirine çok yakındır. Bununla birlikte, bu nesneleri, fiili unilame ayırt edilebilirİki kez (veya daha fazla) parlak lipit floresan tarafından llar GUVs.

6. Patch-sıkma GUVs

  1. Pipet çektirmesi için önerilen programı kullanarak standart borosilikat kılcal cam bir 1-2 mikron ucu çapı ile yama pipetler olun.
    NOT: yangın parlatma gibi özel tedaviler gerekli değildir, ve pipetler bir kapalı bir kutuda muhafaza edilir, eğer bunlar çekme sonucu birkaç gün sonra da kullanılabilir.
  2. GUVs, uygun odası yüzeyleri üzerine yayıldı ve kopma yok olmasını sağlamak için bir beta-kazeın çözeltisi (5 mg / ml) ile inkübe edilerek bölmeyi pasifleştiren. 5 dakika sonra kazein durulayın.
  3. , Toprak elektrot yerleştirin gözlem tamponu ile odasını doldurmak, adım 5.2 ve 5.3 açıklandığı gibi GUV süspansiyonu 10 ul transferi ve GUVs altındaki yerleşmek için bir kaç dakika bekleyin.
  4. Solüsyon (gözlem tampon ya da başka bir iso-ozmotik çözelti) ile taze bir yama pipet doldurun veyama-kelepçe amplifikatör headstage üzerine monte edin.
  5. Odasından aracılığıyla arama bölümünde 5.4 açıklandığı gibi bir "hatasız" Şef bulun ve floresan proteini içerdiğini kontrol etmek.
  6. Sabit pozitif basınç uygulayın (> 100 Pa, ya da kabaca 1 cm manometre H 2 O) temiz iç yama pipet tutmak ve odasına yama pipet eklemek için. , Görüş alanı içine yama pipet getir / ölçmek ofset ve direnç pipet gerilimini telafi ve ucu temiz olduğunu teyit floresan aydınlatma altında pipet incelemek için test darbeleri uygulayın.
  7. GUV doğru yama pipet getir, ve gerekirse, aynı anda "run away" patron yapmaz yama pipet dışarıya doğru akışı, böylece pozitif basıncı azaltmak. Yama pipet GUV yakın olduğunda, yama pipet karşı patron çekmek için (5 cm H 2 O kadar) negatif basınç uygulayın. Olarak direnç Monitor "; GUV membran dil "yama pipet ve gigaseal formları girer.
  8. Bir gigaseal formu olmasaydı, odasından yama pipet kaldırmak ve 6.4 adıma dönün. Membran yama gigaseal kurdu, ancak GUV pipet bağlı kalırsa, GUV sıyrılmış patlama patron odası dibine, ya da kısaca çözümün dışına pipet hareket ettirerek yama tüketim.
  9. Iç-dış zar yama GUV çıkarıldı ve gigaseal stabil olmuştur, test darbeleri kapatmak ve Şekil 13'te gösterilen gibi bir voltaj protokolü uygulanır.
    NOT: Şekil 13 Geçerli yama-elektrot akan "olumlu" olduğu bir iç-out yama için standart elektrofizyolojik kuralı izler ve V = V banyosu - V pipet. Negatif potansiyelde yama tutarak (örneğin, V = -100 mV) dinlenme durumunda ~ 30 sn yerleri KvAP için adımlar ise (10Daha olumlu potansiyeller (örneğin, V = 100 mV) sonra iletken (yani, açık) aktif devletler içine sürebilirsin 5 sn 0 msn).
  10. Bir membran yama üzerinde ölçümler bittikten sonra, bir zap veya basınç darbesi ile yama kırmak ve yama elektrot ofset gerilimi sürüklendi olmadığını kontrol ediniz. Odasından yama pipet çıkarın ve 6.4 adıma dönmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

GUVs büyümesi hızlı bir şekilde bir mikroskop altında bir büyüme odası incelenerek değerlendirilebilir. Electroformation için GUVs Şekil 4'te gösterildiği gibi, platin teli boyunca demet büyürler. Jel destekli şişme sırasında GUVs hızla büyümeye ve (Şekil 5), birbirine kaynaşmasına küresel yapılar olarak görünür.

Hata içermeyen GUVs bilgilerin daha kolay tanımlanabildiği ve bir gözlem odasına transfer edildikten sonra değerlendirilir. Kalibrasyon ölçümle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biomimetic model sistemler, protein ve membran özellikleri ve etkileşimler üzerinde çalışmak için önemli bir araçtır. BLMs veya desteklenen lipid zarlar gibi diğer sulandırılmış sistemlerle karşılaştırıldığında, GUV sistemlerini önemli membran bileşimi, gerilim ve geometri kontrolü yanı sıra gerçekten olmanın petrol-ücretsiz dahil olmak üzere mevcut birçok fırsatlar tabanlı. Bununla birlikte, GUVs içine, örneğin KvAP transmembran proteinleri içeren lipid sadece GUVs için bilinen protokoller önemli uyarlamaları gerektirm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Proteinlerin agaroz şişmesi ile yeniden oluşturulma olasılığını tartıştığı için Susanne Fenz'e, mevcut ölçümler için Feng Ching Tsai'ye ve destek ve yardım için Bassereau grubunun mevcut ve eski üyelerine teşekkür ederiz. Proje, Agence Nationale de la Recherche (hibe BLAN-0057-01), Avrupa Komisyonu (NoE SoftComp), Université Pierre et Marie Curie (FED21, Dynamique des Systèmes Complexes'ten hibe) tarafından finanse edildi. M.G., Institut Curie Uluslararası Doktora Bursu, S.A. tarafından Fondation pour la Recherche Médicale, G.E.S.T., Avrupa Komisyonu'ndan Marie Curie Gelen Uluslararası Bursu ve Université Pierre et Marie Curie'den bir hibe ile desteklenmiştir. Yayın ücretleri Labex 'CelTisPhyBio' (ANR-11-LABX0038) tarafından karşılandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DPhPC (1,2-difitanoil-sn-glisero-3-fosfokolin)Avanti Polar Lipidler 850356P
Yumurta PC L-&alfa;-fosfatidilkolin (Yumurta, Tavuk) Avanti Polar Lipidler 840051P
Yumurta PA L-&alfa;-fosfatidik asit (Yumurta, Tavuk)Avanti Polar Lipidler 840101P
18:1 (Δ 9- cis< / em>) PC (DOPC) 1,2-dioleoil- sn< / em>-glisero-3-fosfokolinAvanti Polar Lipidler 850375P
Kolesterol (küçükbaş hayvan yünü, >%98) Avanti Polar Lipidler 700000P
TRed-DHPEInvirtogenT-1395MPetiketli lipid
BPTR-SeramidInvirtogenD-7540 etiketli lipid
KoloroformVWR22711.290AnalaR Normapur
Aseton VWR20066.296AnalaR Normapur
EtanolVWR20821.330AnalaR Normapur
KimwipeKimtech7552
Hamilton şırıngaları Hamilton Bonaduz AGçeşitli
Amber şişeler ve Teflon kaplarSigmaSU860083 ve SU860076
ParafilmVWR291-1214
Mikrosantrifüj tüpüEppendorfçeşitli
AgarozEuromexLM3 (1670-B, Tg 25.7C, Tm 64C)
SükrozSigma84097-1kg
Glikoz SigmaG8270-1kg
TrehaloseSigmaT9531-25G
KClSigmaP9333-1kg
HepesSigmaH3375-100G
TRISEuromexEU0011-A
OzmometreWescorVapro
pH metreSchott aletleriLab850
SonicatorElmasonicS 180 H
Şırınga filtresi 0.2 ve mikro; mSartorius steimMinisart 16532
Fonksiyon üreteciTTiTG315
Platin tellerGoodfellowLS41307499.99+%, d = 0.5 mm
PolitetrafloroetilenGoodfellow
Dow Corning 'yüksek vakumlu gres'VWR1597418
sızdırmazlık macunuVitrex medical A/S, DanimarkaREF140014 Sigillum
Mum Kapak kızakları 22 x 40 mm No1.5VWR631-0136
Kapak kızakları 22 x 22 mm No1.5VWR 631-0125
Plazma temizleyiciHarrickPDC-32Gairplasma, 'yüksek'
ayarPetri kaplarıFalcon BDREF 3530013,5 cm x 1 cm
yama kelepçesi amplifikatörüAkson aletleriMulticlamp700B
DAQ KartıUlusal AletlerPCI-6221
LabviewUlusal Aletlerversiyonu 8.6
Cam pipetler boro silikat OD 1  mm ID 0.58  mmHarvard AparatıGC100-15
Elektrot tutucuWarner Instruments Q45W-T10P
MikromanipülatörSutter MP-285
Pipet çektirmeSutter P-2000 
KameraProSilica GC1380
Zeiss mikroskobuZeissAxiovert 135
ObjektifZeiss40X uzun çalışma mesafesi, Faz kontrastı
Objektif Zeiss100X Plan-Apochromat NA 1.3
Filtre Seti GFP (Alexa-488 için)HoribaXF100-3
Filtre Seti Cy3 (TexasRed için)HoribaXF101-2
beta-kazeinSigma C6905-1G
Konfokal mikroskopNikon Eclipse TE 2000-ED-Eclipse C1 konfokal kafa
ObjektifNikonPlan Fluor 100X NA 1.3
işleme ve mevcut izlerin analizi içinMatlabMathworks
Görüntü

Kaynaklar

  1. Schwille, P. Bottom-Up Synthetic Biology: Engineering in a Tinkerer’s World. Science. 333 (6047), 1252-1254 (2011).
  2. Aimon, S., et al. Membrane Shape Modulates Transmembrane Protein Distribution. Developmental Cell. 28 (2), 212-218 (2014).
  3. Roux, A., et al. Membrane curvature controls dynamin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4141-4146 (2010).
  4. Domanov, Y. A., et al. Mobility in geometrically confined membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12605(2011).
  5. Sorre, B., et al. Curvature-driven lipid sorting needs proximity to a demixing point and is aided by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5622-5626 (2009).
  6. Faris, M. D. E. A., et al. Membrane Tension Lowering Induced by Protein Activity. Physical Review Letters. 102 (3), 038102(2009).
  7. Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
  8. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  9. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (9), 644-650 (2009).
  10. Sens, P., Johannes, L., Bassereau, P. Biophysical approaches to protein-induced membrane deformations in trafficking. Current Opinion in Cell Biology. 20 (4), 476-482 (2008).
  11. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  12. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  13. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  14. Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Trends in Colloid and Interface Science VI. 89, 161-176 (1992).
  15. Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant Unilamellar Vesicle Electroformation. Methods in Enzymology. 465, 161-176 (2009).
  16. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in. Solutions of Physiologic Ionic Strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  17. Campillo, C., et al. Unexpected Membrane Dynamics Unveiled by Membrane Nanotube Extrusion. Biophysical Journal. 104 (6), 1248-1256 (2013).
  18. Kwok, R., Evans, E. Thermoelasticity of large lecithin bilayer vesicles. Biophysical Journal. 35 (3), 637-652 (1981).
  19. Mathivet, L., Cribier, S., Devaux, P. F. Shape change and physical properties of giant phospholipid vesicles prepared in the presence of an AC electric field. Biophysical Journal. 70 (3), 1112-1121 (1996).
  20. Weinberger, A., et al. Gel-Assisted Formation of Giant Unilamellar Vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  21. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Levy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  22. Kahya, N., Pecheur, E. I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  23. Doeven, M. K., et al. Distribution, lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  24. Girard, P., Prost, J., Bassereau, P. Passive or Active Fluctuations in Membranes Containing Proteins. Physical Review Letters. 94 (8), 088102(2005).
  25. Betaneli, V., Petrov, E. P., Schwille, P. The Role of Lipids in VDAC Oligomerization. Biophysical Journal. 102 (3), 523-531 (2012).
  26. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  27. Jiang, Y., et al. X-ray structure of a voltage-dependent K+ channel. Nature. 423 (6935), 33-41 (2003).
  28. Aimon, S., et al. Functional Reconstitution of a Voltage-Gated Potassium Channel in Giant Unilamellar Vesicles. PLoS ONE. 6 (10), e25529(2011).
  29. Lee, S., Zheng, H., Shi, L., Jiang, Q. -X. Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies. Journal of Visualized Experiments. (77), (2013).
  30. Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
  31. Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97 (3), 738-747 (2009).
  32. Hille, B. Ion Channels of Excitable Membranes. , Sinauer Associates, Inc. (2001).
  33. Finol-Urdaneta, R. K., McArthur, J. R., Juranka, P. F., French, R. J., Morris, C. E. Modulation of KvAP unitary conductance and gating by 1-alkanols and other surface active agents. Biophysical journal. 98 (5), 762-772 (2010).
  34. Schmidt, D., MacKinnon, R. Voltage-dependent K+ channel gating and voltage sensor toxin sensitivity depend on the mechanical state of the lipid membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (49), 19276-19281 (2008).
  35. Quemeneur, F., et al. Shape matters in protein mobility within membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2014).
  36. Parc, A. L., Leonil, J., Chanat, E. αS1-casein, which is essential for efficient ER-to-Golgi casein transport, is also present in a tightly membrane-associated form. BMC Cell Biology. 11 (1), 1-15 (2010).
  37. Garten, M., Toombes, G. E. S., Aimon, S., Bassereau, P. Studying Voltage Dependent Proteins with Giant Unilamellar Vesicles in a “Whole Cell” Configuration. Biophysical Journal. 104 (2), 466a(2013).
  38. Crowe, L. M., Reid, D. S., Crowe, J. H. Is trehalose special for preserving dry biomaterials. Biophysical Journal. 71 (4), 2087-2093 (1996).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

KvAP RekonstitüsyonuElektroformasyon YöntemiJel Destekli ŞişirmeFloresan MikroskopiLipid Protein FilmiDehidrasyon RehidrasyonMembran Proteini İnkorporasyonu
Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.