Bu tekniğin amacı, araştırmacıların herhangi bir yaştaki Drosophila melanogaster'den pupa göz disklerinin diseksiyonunu, immün boyama ve montajını gerçekleştirmelerini sağlamaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Drosophila melanogaster göz diski, birçok farklı biyolojik süreci incelemek için kullanılabilecek güçlü bir sistemdir. Ommatidia1 olarak adlandırılan yaklaşık 800 ayrı göz ünitesi içerir. Her ommatidyum, üçüncü larvainstar 2'deki morfogenetik karıkların geçişini takiben farklılaşmamış hücrelerden gelişen sekiz nöronal fotoreseptör içerir. Fotoreseptörlerin sıralı farklılaşmasını takiben, mekanosensoriyel kıl hücreleri3 ile birlikte koni ve pigment hücreleri dahil olmak üzere nöronal olmayan hücreler gelişir. Tüm ommatidial hücre tiplerinin yapılandırılmış düzenlenmesi, farklılaşmamış hücre tiplerinin programlanmış hücre ölümü ve rodopsin ekspresyonu dahil olmak üzere son farklılaşma süreçleri, pupa faz4-7 boyunca gerçekleşir. Bu teknik, pupa göz diskini manipüle etmeye odaklanır ve pupa fazı sırasında göz diskinin nasıl diseksiyon yapılacağına dair içgörü ve talimat sağlar, bu da doğası gereği yaygın olarak disseke edilen üçüncü instar göz diskinden daha zordur. Bu teknik aynı zamanda çeşitli proteinlerin ve diğer hücre bileşenlerinin görselleştirilmesine izin vermek için immün boyama hakkında ayrıntılar sağlar.
Giriş
Drosophila melanogaster: gelişim ve hücre biyolojisi alanlarını büyük ölçüde model organizma tarafından etkilendi. Bu model çerçevesinde, göz diskin çalışmalar bilgisi ile ilgili sinyalizasyon, hücre biyolojisi ve diğer alanlarda büyük bir katkıda bulunmuştur. Geç üçüncü larva göz disk geniş olarak araştırılmış ve bu gelişim dönemlerinin bir dizi bir anlık verir gibi, kullanmak için güçlü bir model olmuştur, kendine özgü sinyal molekülleri ve süreçleri ile her morfojenetik karık göz disk boyunca ilerledikçe 8. Ancak, daha fazla geliştirme pupa fazına gelişim süreçleri anlamamız genişletmek için bir ihtiyaç vardır. Pupa göz disk 3-7 çalışmalar varken, bizim bilgi Üçüncü dönem göz disk üzerinde yapılmıştır işin genişliği yaklaşım değildir. Bu pupa göz diski diseksiyon büyük zorluk, kısmen, kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, bir sunumdiseksiyon uygun yöntem büyük ölçüde bu alanda araştırma genişletmek olabilir.
Kolayca özellikle orta-pupa döneminde çevresinde, disseke pupa göz disk gelişimi içinde aşamaları varken, diğer süreler çok daha zorlu incelemek için vardır. Bu protokol, evrensel olarak tüm pupa gelişim zaman dilimlerinde kullanılabilir pupa göz diskler kesme için, bir yöntemi temsil eder. Bu protokol midpupal zaman noktalarından göz diskleri incelemek için daha kolay ve daha hızlı bir yöntem gösterir, başka bir protokole 9 alternatif olarak kullanılabilir. Bu protokol başlangıçta çekildi ve Fonksiyonel Genomik (URCFG) pupa göz diseksiyon tekniği 10,11 UCLA Lisans Araştırma Konsorsiyumu ileri lisans öğrencilerine eğitim vermek için geliştirilmiştir. Birçok lisans öğrenci bu zorlu tekniği öğrenmek için bu videoyu ve yöntemini kullanmak için başardık.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu prosedür 2 gün işlemdir.
Gün 1 (2 saat + zamanı diseksiyon)
1. Pupa Göz Disk Diseksiyon
- Diseksiyon için bir pupa seçin.
NOT: disseke pupa yaşı deneysel gereksinimlerine göre belirlenecektir. Hücre morfolojisi inceleyerek Ancak, bu sık sık videoda gösterilen pupa yaşı 25 ° C'de puparium oluşumu (APF) sonra 42 saat sonra yapılır. Islatılmış bir fırça ile beyaz pupa (kabul 0 saat APF) toplayın ve 25 ° C'de muhafaza yeni bir sinek gıda şişede (toplama zamana dayalı) kronolojik sırayla bunları düzenlemek. Mümkün olduğunca yakın pupa arasındaki zaman farkları tutmak için bu aynı kronolojik sırayla yaşlı pupa teşrih. - Fosfat tamponlu tuzlu su, bir damla halinde pupa aktarın bir silikon kesme plakası üzerinde (PBS, pH 7.4, tarifi için malzeme bakınız).
- Forseps ve delgi ile pupa halinde üst tutun ve l açınKeskin forseps bir çift ile pupa davanın ower bölümü. Yeni oluşturulan deliğe kasasından pupa çıkarın.
- Pupa makas, orta toraks, çapraz bir kesim olun. Enkaz kaldırmak veya PBS yeni bir damla pupa kafasını aktarın. Temiz pipet üfleme borusunu (malzeme ve detaylar için bakınız Şekil 1) kullanılarak ve gerektiğinde ilave PBS ekleyin. Dehidratasyonu önlemek için emin olun.
- Güvenli kavrama forseps bir çift ile pupa kafa manikür üst. Blower tüp ucunu kullanarak, yavaşça beyin ve pupa halinde dışarı göz diskler dahil olmak üzere diğer dokuları, a'ya için pupa halinde itin. Manikür içinde herhangi bir doku kapma önlemek için emin olun.
- PBS ile dolu üfleme borusunu kullanarak, yavaşça açıkça ayırmak için baş davanın dışında vücut yağ dokusu ve diğer enkaz darbe ve beyin ve göz diskleri tanımlamak.
NOT: pupa baş duruma bağlı beyin tutulması araştırmacı o kullanmanızı sağlayacakGöz diskleri veya beyni zarar vermeden dokusunun gelecek manipülasyon için bir "sap" olarak reklam durumda. Bununla birlikte, bu kafa kutusundan, göz ve beyin diskleri çıkarmak için ortaktır ve bu da genel prosedür ve sonuçları için zararlı değildir. Genellikle üfleme ve başarıyla onlar açıkça doku çevreleyen ayrı olduğu pupa kafa durumda ve bu yüzden içinde göz diskleri ve beyni çıkarmak için bastırıyor birden girişimleri sürüyor. Daha temiz ve daha ayrı bir göz disklere sabitleme gereksiz doku önlemeye yardımcı olacaktır çevreleyen dokudan göz diskleri alabilirsiniz. - Diseksiyon sonra derhal düzeltme çözeltiden 0.5 ml (malzeme bakınız) ile buz üzerinde 3 de cam tabak içine doku aktarın. Birkaç dakika sonra (bu göz disklerinin bir sonraki kümesi incelemek için gereken tipik süre) saptamak çözeltinin yüzeyinde doku Float.
NOT: Bu diseksiyon, completel bu turda disseke ilk göz disk değilsey Fix çözeltisi içine bir önceki göz diski daldırın. (Örn, reaktif oksijen türleri, lizozomları) özel boyama tekniklerinin kullanılmasını ise bu tespitin önce yapılmalıdır. Bunu yapmak için, önce uygun lekeleme protokolü ile devam eden buzla soğutulmuş PBS içinde kesilen göz disklerini. - Tüm göz disklerin diseksiyonu ve suya batmaya ardından disseke, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir rocker ve rock 3 de cam tabak taşıyın.
2. immün
- Dikkatlice Düzeltme çözüm kaldırmak ve% 0.3 Triton X-100 ile 0.5 ml PBS ilave (% 0.3 PBT, malzeme bakınız) ve 10 dakika boyunca bir rocker doku yıkayın. 4 kez (10 dk) bir toplam bu adım, üç kez daha tekrarlayın.
Not: kuyudan solüsyonun dikkatli bir şekilde çıkarılması, doku hasarı ya da kaybını önlemek için bir tahlil mikroskobu altında gerçekleştirilebilir. Çözelti, bir pipet yardımıyla dikkatli bir şekilde aspire edilir; Biz ince tippe tercihd doku aspire şansını azaltmak için basık açılış olmuştur atılabilir transferi pipet. - 4. yıkamanın sonunda, yıkama kaldırmak ve oyuğuna (malzeme bakınız) 0.5 mi blok çözeltisi ekleyin ve 30 dakika kuluçkada bırakın.
NOT: ihtiyaçlarınıza göre bu zaman çerçevesi uzatılabilir. - 30 dakika blok sürenin sonunda, bir mikro plaka içindeki yuvalara uygun dizi halinde (blok çözeltisi içinde seyreltilmiş): Primer antikor çözeltisi pipetle 10 ul.
NOT: Bir mikro plakanın biri de pupa duruma bağlı göz diskler yaklaşık 4 çift veya bağlı beyinleri ile göz disklerin 8 izole çiftleri ağırlayacak. (: 500 seyreltme oranı: 1) ve anti-Kesim (1: 200 dilüsyon) ve temsili veriler için, bu protokolde kullanılan birincil antikorlar özel anti-fosfotirozin bulunmaktadır. - 3 de, cam çanak primer antikor çözeltisi ile doldurulmuş bir mikro oyuk plaka oyuklarına parçalara doku aktarın.
- YerBir ıslatılmış kağıt havlu üzerinde mikro plaka gece boyunca 4 ° C'de boş bir pipet ucu kutusu (veya diğer benzer kap) ve mağaza (dehidratasyon önlemek için).
Gün 2 (4 hr + zamanı montaj)
- % 0.3 PBT (≈0.5 mi) ile yeni bir 3 de cam tabak içine mikro plaka doku aktarın ve dengesiz üzerinde 10 dakika süreyle doku yıkayın. 4 yıkama toplam bu adımı (10 dk), üç kez daha tekrarlayın
- Son yıkama çıkarın ve oyuğuna Bloke çözeltisi 0.5 ml ilave ediniz. 30 dakika engelleyin.
NOT: ihtiyaçlarınıza göre bu zaman çerçevesi uzatılabilir. - Bir kapak veya alüminyum ile ışıktan 3 de cam tabak Bloke çözeltisini çıkarın ve oyuğuna (blok çözeltisi içinde seyreltilmiş birincil antikoru ve floresan dalga boyu için uygun şekilde floresan ile etiketlenmiş antikorlar ile yapılan) sekonder antikor çözeltisi, 0.5 ml ilave ve koruma folyo ve oda sıcaklığında en az 2 saat süreyle inkübeSıcaklık.
NOT: Tüm sonraki adımlar benzer ışığa maruz korunmalıdır. Bu inkübasyon birincil antikor inkübasyon benzer bir kurulumda, 4 ° C'de gece boyunca uzatılabilir, ama aynı zamanda laboratuar tipi film veya antikor koruma isteniyorsa, bir mikro levha ile kaplanmış bir 3 de cam tabak içinde gerçekleştirilebilir. - Antikor İnkübasyonun sonunda, ikinci antikor çözeltisini çıkarın ve kuyuya% 0.3 PBT 0.5 ml ilave edin ve 10 dakika boyunca ROCKER'da yıkayın. 4 yıkama toplam bu adımı (10 dk) tekrarlayın.
Not: (: 1000 seyreltme 1) DAPI boyama isteniyorsa, birinci yıkama başlamadan önce, ilk yıkama programı için kullanılacak PBT 500 ul DAPI stok çözeltisi, 0.5 ul (Malzeme) ekleyin.
3. Montaj
- Son yıkama sonunda, br çıkarmak için bir araç olarak% 70 gliserol ya da PBS kullanılarak bir lam üzerine anten / göz diskler monteain ve sürgünün bir tarafında bir havuzda diğer istenmeyen dokular.
- Dikkatle forseps arasındaki hidrostatik basıncı kullanarak dokuyu taşımak, ya da çok nazikçe bir forseps ucu ile ve slayt merkezine doğru bir sütunda göz diskleri sıraya.
- Doku çevresindeki tüm yabancı gliserol veya PBS çıkarın (bir laboratuvar ıslanma eylemini mendil kullanarak veya forseps bunun için çalışmak).
- Göz Disk kolonu bir kenarı boyunca montaj orta küçük bir miktar (≈10 ul) yerleştirin ve göz diskler üzerine montaj ortamı yaymak üzere doku üzerinde bir lamel.
- 1-2 dk doku / montaj orta tamamen yaymak için izin için slayt bekletin.
- Lamel kenarlarında herhangi bir ekstra montaj orta silin ve şeffaf tırnak cilası ile mühür.
- Konfokal mikroskopi kullanılarak göz disklerin floresan görüntüler yakalayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün kullanımına ilişkin bir örnek olarak, sonuçlar midpupal (42 saat 25 ° C'de APF) farklı antikorlar ile boyanmış göz diskler gösteren fosfotirosin kalıntıları karşı yönlendirilen bir antikor kullanılarak, Şekil 2'de sunulmuştur, hücrelerin membran olabilir gözlenen (Şekil 2A). Bu midpupal aşamasından önce meydana nihai model verme işlemleri takiben pupa göz ommatidial hücrelerin düzenli bir şekilde tertip tanımlamak için kullanılabilir. Başka bir temsili görüntü koni hücrelerinin çek...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İşlem basit ve gerçekleştirmesi kolay gibi görünse de, gerçekte bu teknikte ustalaşmak için çok fazla pratik gerekir. Rutin olarak, öğrencilere, çalışması çok daha kolay olan üçüncü instar göz disklerini12 incelemeyi ve monte etmeyi öğrenerek başlıyoruz. Bu uygulama, kolların, ellerin ve parmakların13 uygun bir diseksiyon pozisyonunun geliştirilmesine yardımcı olur, böylece forsepslerin diseksiyon mikroskobu altında manipülasyonu stabil, kolay ve deneyimlidir. Temelde, uygulama süresi, forsepsler...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu projeyi mümkün kılan U.B.'ye verilen HHMI Profesör ödülü için Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nü takdir ediyor ve teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma için tesisler ve öğretim altyapısı desteği sağladığı için Los Angeles California Üniversitesi'ndeki koleje teşekkür ederiz. Çalışma ayrıca Midwestern Üniversitesi'nden sağlanan fon ve Charity Fidelity Gift Fund'dan cömert bir bağışla desteklendi. El yazması hakkındaki yorumları için John VandenBrooks'a ve teknik yardımı için Krista Pearman'a teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) | 80 g NaCl, 2g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4, Sesi 1 μ'ya getirin; l, pH'ı 7.4'e ayarlayın, otoklavlayın veya filtre sterilize edin, kullanmadan önce otoklavlanmış ddH < sub > 2 < / sub>O ile 1x PBS'ye seyreltin. | ||
| Triton X-100 | Promega | H5142 | Dikkat: Tahriş edici! Eldiven giyin. |
| % 0.3 PBT | 1.5 ml Triton X-100, 500 ml 1X PBS. | ||
| % 37 formaldehit çözeltisi | Fisher Scientific | F75P1GAL | Dikkat: Toksik, olası insan kanserojeni! Eldiven giyin. |
| Çözümü Düzelt | ≈ PBS'de% 4 Formaldehit) 50 & mu; l% 37 Formaldehit, 450 μ l 1x PBS, kullanmadan önce taze yapın | ||
| Normal keçi serumu | Rockland antikorları ve tahlilleri | B304 | Aliquot'u 1 ml'lik hacimlerde saklayın ve -80 & # 176'da saklayın; C |
| Blok Çözeltisi | PBT'de %10 NGS. Bu 4 ° C'de yapılabilir ve saklanabilir; Kullanmadan önce birkaç gün boyunca C. | ||
| DAPI stok çözümü | Life Technologies | D3571 | Çekirdekleri boyamak için. ddH2O ile 1 mg / ml'lik bir çözelti hazırlayın. |
| VectaShield Montaj Ortamı | Vector Labs | H-1000 | Montaj ortamı |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Montaj için. ddH2O ile %70 seyreltme hazırlayın. |
| Ekipman | |||
| Somunlama karıştırıcı | VWR | 82007-202 | 3 kuyulu cam tabakta dokuyu sallamak için kullanılır |
| SylGard 182 Silikon Elastomer Kiti | Krayden | NC9897184 | Silikon diseksiyon kabı yapmak için kullanılır |
| Silikon diseksiyon kabı | Sylgard elastomer kitini (yukarıda) talimatlara göre nazikçe karıştırın (kabarcıkları önlemek için). Karışımı Petri kabına (herhangi bir boyutta) dökün. SylGard'ın 37 ° C'de bir gecede iyileşmesine izin verin; C kuluçka makinesi. | ||
| 3 kuyulu cam tabak | Corning | 7220-85 | Bunların 3 kuyulu çeşidi artık mevcut değil, bu 9 kuyulu ürün. |
| 72 kuyulu mikro kuyu mini tepsi | Nunc | 438733 | |
| Keskin forseps (Dumont #55) | İnce Bilim Araçları | 11255-20 | |
| Vannas tipi Mikro Makas, Düz, 5 mm bıçak | Ted Pella | 1346 | |
| 100 mm Borosilikat cam kılcal damarlar | Dünya Hassas Aletler | 1B100-4 | Küçük bir PBS akışının akmasına izin veren ince nokta ucu yapmak için iğne çektirme ile çekin. |
| Tek Kullanımlık Transfer Pipetleri, İnce Uçlu | Samco Scientific | 231 | |
| Verilen boru boyutları şunlardır: iç çap (ID) x dış çap (OD) x inç | |||
| PVC boru (1/8 x 3/16 x 1/32) | Nalgene | 8000-0010 | Şekil 2'de gösterildiği gibi üfleyici boruyu monte etmek için bunları çekilmiş iğne ile kullanın. |
| Tygon Silikon boru (3/32 x 5/32 x 1/32) | Saint Gobain Performans Plastikleri | ABW00004 | |
| Tygon Silikon boru (1/32 x 3/32 x 1/32) | Saint Gobain Performans Plastik | ABW00001 |
Kaynaklar
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye. Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).
- Grzeschik, N. A., Knust, E. IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin. Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40 (4), 851-858 (1985).
- Voas, M. G., Rebay, I. Signal integration during development: insights from the Drosophila eye. Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas. J Vis Exp. , 4347(2012).
- Call, G. B., et al. Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes. Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).
- Chen, J., et al. Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers. PLoS Biol. 3 (2), 59(2005).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. 37, 1936(2010).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
