Yöntem makalesi

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

DOI:

10.3791/52347

⸱

27 Aralık 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department for Cardiology, Angiology and Pneumology, Otto von Guericke University Magdeburg, 2Herzzentrum Dresden, Universitätsklinikum an der Technischen Universität Dresden, Technische Universität Dresden, 3Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, translasyonel uygulamalar için heterojen kemik iliğinden büyük miktarlarda murin monositleri üreten bir protokol sunuyoruz. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, bu yeni yöntem, kurban edilen hayvan sayısını azaltmaya yardımcı olur ve yüksek gradyanlı manyetik hücre ayırma (MACS) gibi pahalı yöntemlerden kaçınarak maliyetleri düşürür.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lökositlerin bir alt tipi ve makrofajların öncüleri olan monositler, organizmaların birçok önemli sürecinde yer alır ve genellikle biyomedikal biliminde çeşitli alanların konusudur. Aşağıda açıklanan yöntem, murin monositlerini heterojen kemik iliğinden izole etmenin basit ve etkili bir yoludur.

Balb/c farelerinin femur ve tibiasından alınan kemik iliği, fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanarak toplanır. Hücre süspansiyonu, makrofaj-koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ile desteklenir ve monositlerin adezyon ile tetiklenen farklılaşmasını önlemek için ultra düşük bağlanma yüzeylerinde kültürlenir. Monositlerin özellikleri ve farklılaşması çeşitli aralıklarla karakterize edilir. Fenotipleme için CD11b, CD115 ve F4/80 gibi belirteçlere sahip floresan ile aktive edilmiş hücre sınıflandırması (FACS) kullanılır. Yetiştiriciliğin sonunda, süspansiyon% 45±% 12 monositlerden oluşur. Yapışkan makrofajları uzaklaştırarak saflık %86'ya± %6'ya kadar yükseltilebilir. İzolasyondan sonra monositler çeşitli şekillerde kullanılabilir ve in vivo doğum için en etkili ve yaygın yöntemlerden biri intravenöz kuyruk ven enjeksiyonudur.

Bu izolasyon ve uygulama tekniği, özellikle inflamasyon veya immünoloji alanlarında fare modeli çalışmaları için önemlidir. Monositler ayrıca fare hastalığı modellerinde terapötik olarak da kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monositlerin izolasyonu, birçok in vitro ve in vivo çalışma için önemli ve kritiktir. Bu hücreler, periferik arter hastalığı, koroner kalp hastalığı veya diğer iskemik hastalıklar gibi hastalıklar için hedeflerdir, çünkü kollateral damar büyümesi güçlü bir şekilde lokal inflamasyon tarafından yönlendirilir. Enflamatuar yanıtlar, endotelyal aktivasyonu ve lökositlerin, esas olarak monositlerin lokal alımını içerir, bunlar daha sonra makrofajlara olgunlaşır ve bir arteriolün fonksiyonel bir kollateral arter1-3'e yeniden şekillenmesini indüklemek için çoklu büyüme faktörleri salgılayarak oldukça arteriyojenik bir ortam oluşturur. Monositler ayrıca immünolojik çalışmalar4,5 ve kanser araştırmaları6,7 için sıklıkla kullanılan dendritik hücrelere olgunlaşır.

Periferik kandan monosit izolasyonuyaklaşımında problemli olan 8, çoğu analiz için yeterli miktarda monosit üretmek için gereken yüksek sayıda donör hayvandır. Eski protokoller, monositleri izole ederken yoğunluk gradyan santrifüjleme ve MACS9 yoluyla hücre tükenmesi gibi yöntemleri tanımlar; Bununla birlikte, bu teknikler monositlerin özelliklerini ve işlevselliğini değiştirebilir ve bu da yorumlamada zorluklara yol açabilir10,11. Ayrıca, bu yöntemler zordur ve deneysel tekrarlanabilirliği azaltabilir.

Bu protokolle amacımız, büyük miktarlarda kemik iliği kaynaklı monositler oluşturmak için basit ve uygun maliyetli bir yöntem sağlamaktır. Bu protokolle elde edilen 11 x 106 ± 3 x 106 hücreli yüksek hücre verimi sayesinde, kemik iliği kaynaklı monositlerin izolasyonu sırasında gereken fare sayısını önemli ölçüde azaltabiliriz. Prosedür, minimum bir süre içinde ve yukarıda belirtildiği gibi pahalı ve karmaşık teknikler kullanılmadan tamamlanabilir. Burada, donör farelerin doğal kemik iliği süspansiyonundan monositleri ekstrakte ediyoruz, süspansiyonu ultra düşük bağlantı plakaları üzerinde geliştiriyoruz ve çözeltiyi 20 ng / ml M-CFS ile destekliyoruz. Kuluçka süresinin 5. gününde, hücreler toplanır ve fonksiyonel ve fenotipik özellikleri doğrulamak için karakterize edilir.

Arteriyogenez alanındaki deneyler için, bu kemik iliği kaynaklı monositlerin farelere intravenöz transplantasyonu, yaygın periferik arter hastalığı modellerinde femoral arter ligasyonu ile birleştirilebilen sistemik ilaç dağıtımının etkili bir yöntemidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada hayvansal koruma (24D-9168,11-1 / 2008-24) Alman Yasanın 8. göre, Saksonya ve Saksonya Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle Devlet izni ile yapıldı.

1 Hücre İzolasyonu

Femur ve Tibia 1.1 Hazırlık

  1. Kapalı bin izofluran vaporizing bir% 5 izofluran konsantrasyonu kullanılarak fare anestezisi. Fare 3 saniye hareket durduktan sonra, servikal dislokasyon gerçekleştirin.
  2. Etanol (% 96) ile arka bacaklarda dezenfekte. Cilt ve kasları çıkarın ve steril bir bisturi ile kemikleri ayırın.
    1. Inguinal cilt kesi ile başlayın, ve medial malleol doğru kesi uzatmak ve alt baldır çevresindeki deri dairesel bir diseksiyon. Proksimale soyma tamamen bacaklar cilt çıkarın.
    2. Keskin bir bisturi ile femur kuadriseps kas ayırın, ön Peroneus de kaldırabilirsinizve gastroknemius kas gruplarını bulma ve ligament diseksiyon ile kalça eklemi de bacak dezartikülasyon.
    3. Öne başlayın ve dikkatle böylece eklem disarticulating, bacak dönen ve ligament transecting ile ortak etrafında devam.
  3. Aseptik hazırlanmasını sağlamak için 90 sn arasında, en az% 96 etanol ile femur ve tibia yıkayın. Etanol kalan durulayın steril PBS ile yıkama işlemini devam edin.
    Not: Tüm takip eden aşamalar kirlenmesini önlemek için steril olmak zorundadır.

Kemik İliği 1.2 Hasat

  1. Femoral ve tibial milleri erişmek için ince bir makas her kemiğin proksimal ve distal ucu kesilir. Bu kemikler çok kolay kırılabilir, çünkü bu adımı dikkatli olun.
  2. Sıcak ortam ile kemik yıkayın (M199 +% 10 fetal dana serumu (FCS), +% 1 Penisilin / Streptomisin). Bir steril 28 G iğne, bir 1 ml şırınga ve 10-15 mi medya başına arasında kullanındurulama için kemik.
  3. Ince forseps ile kemik tutun ve yarı-saydam olana kadar teker teker yıkayın. Dikkatle hücre stresi en aza indirmek için, enjektör pistonunun ucuna baskı uygulanır.
  4. 70 mikron naylon web üzerinden kemik iliği Filtre ve süzüntü toplamak. Kemik iliği, azami miktarda çıkarmak için, uzak ve yakın uçlarında tekrar tekrar yıkayın.
  5. PBS ile elek durulayın ve süzüntü toplamak. Dikkatle enkaz ve nazik karıştırma ve pipetleme hücresel holdingleri yerinden.

1.3 Yetiştirme

  1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve orta yaklaşık 25 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Kez tekrarlayın.
  2. Ikinci yıkama aşamasından sonra, ortam, 6 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Tripan mavisi 50 ul hücre çözeltisinin 50 ul karıştırın. Bir ışık mikroskobu altında bir sayım odasında hücreleri sayın. C sayısını hesaplayınBu formül kullanılarak çözelti içinde arşın:
    figure-protocol-1
  3. Plakasının tabanına kadar kalıcı yapışmasını önlemek için bir 6-çukurlu ultra-düşük-bağlantı yüzeyi tabakalarına hücreleri Tohum. Oyuk başına en fazla 6 ml, ml başına 10 6 hücre konsantrasyonuna kullanın.
  4. Hücre farklılaşmasını teşvik etmek için 20 ng / ml M-CSF ile bir süspansiyon Supplement.
  5. Kültür, 37 ° C de 5 gün süre ile hücre ve% 5 karbon dioksit ve hergün incelenmiştir.

Hücreler 1.4 Hasat

Not: Bu aşamaları, buz üzerinde gerçekleştirilmelidir. Buna göre 1.4.1 veya 1.4.2 ya devam edin.

  1. Bu noktada, ultra-düşük-bağlantı yüzeyi plakalardır bile, kültür plakalarına yapışacak farklı makrofajlar dahil olmak üzere, tüm kültür hasat edilir.
    1. Nazik pipetleme tüm kültür Hasat ve 4 ° C PB çözeltisi ile ayırmaS,% 0.5 büyükbaş hayvan serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA. Emin eğer mikroskop altında teyit - plakaları yapışık hücrelerin kalan net kadar tekrarlayın.
  2. Seçenek olarak ise, esas olarak monositler içeren süspansiyon hücreleri ile süpernatant hasat etmek suretiyle yapışkan makrofajlar atın.
    1. Bir EDTA içermeyen PBS çözeltisi ve% 0.5 BSA ile yıkanarak yapışmayan hücreler hasat edilir. Hafif yapışık makrofajlar yerinden oynatmamaya önlemek için çok fazla kuvvet uygulamayın.

1.5 FACS-Analiz (İsteğe bağlı)

Not: MACS kullanılarak CD117 + stem- ve projenitör hücrelerin hücre süspansiyonu tüketmek için mümkündür. Bu prosedür üretici protokollerini kullanın.

  1. Ya 1.4.1 veya 1.4.2 adımları göre hücreleri Hasat.
  2. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj hücreleri ve yine bu adımı tekrarlayın.
  3. FACS b 300 ul süspanse en az 250.000 hücreprob başına uffer.
  4. 96 oyuklu bir plaka (kuyu başına 30 ul) üzerine hücre çözeltisi aktarın.
  5. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin.
  6. Süpernatantı ve her bir kuyu (kullanım üreticisi seyreltme) antikor 25 ul ekleyin.
  7. Adımdan sonra hücre feno üretici protokolleri takiben antikor ile (hücreler 1.5.1-1.5.6. Monosit / makrofaj tanımlanması için yaygın olarak kullanılan belirteçler CD11b, F4 / 80 (Şekil 3), CD115 içerir leke (Şekil 2), ve GR- 1.
    Not: Hücre çözümleri ilişkin ayrıntılı bilgi için, CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, LY6C, Ly6G ve CD192 gibi belirteçlerin kullanılması tavsiye edilir. Hücresel özellikleri önceden 12 tarif edilmiştir.
  8. 4 ° C'de 20 dakika için sondalar inkübe edin.
  9. Santrifüj 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de problar ve FACS tamponu içinde 200 ul süspansiyon haline getirin. Tekrar inciiki adım olduğunu.
  10. FACS tüpler içine sondaları aktarın ve FACS analizi 12 gerçekleştirin.
  11. Hücre farklılaşmasını analiz için 0, 3 ve 5, FACS analizi 12 yapın.

2. Kuyruk Ven Enjeksiyon

2.1 Hazırlık

  1. Yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C'de bir ısıtma plakası üzerinde hayvanlar ısıtın. Aşırı ısınma işaretleri tanımak ısınırken hayvanları gözlemlemek.
  2. NaCI 150 ul, adım 1.1- 1.4 izole monositler, süspanse edin ve bir 30G iğne ile 1 ml insülin şırınga içine hücreleri yükleyin. Hafif tüm monositler enjekte sağlamak için şırınga yüklemeden önce çözüm vorteks. Her zaman ısı aracılı eki ve monositlerin aktivasyonunu önlemek için buz üzerinde hücreleri ele.

2.2 frenleyici

  1. Damardan enjeksiyon için bir fare seçerken kafes Diğer fareler rahatsız kaçının.
  2. Süzgeç içine fare yerleştirin. Çok pr kaçınınessure arka bacaklarda dikkatli olmak ve. (Şekil 4)
    Not: Alternatif olarak, hayvanların stres ücretsiz kullanımını garanti etmek için genel anestezi kullanın.
  3. Fare koruyucularını kapatmadan önce nefes için yer olduğundan emin olun.

2.3 Enjeksiyon

  1. Dezenfeksiyon maddesi ile enjeksiyon yerinde dezenfekte edin. Fare kuyruğu Sprey ve en az 1 dakika bekletin.
  2. Damarların daha iyi görüş için, enjeksiyon yerinde yukarıdaki yan kuyruk tarafına hafif basınç uygulayarak kuyruk venöz kan akışını durdurun.
  3. Enjeksiyon öncesinde, kuyruk 90 derece çevirin. (Şekil 5)
  4. 45 derecelik bir açıyla enjekte. Yavaş yavaş enjekte ve g başına en fazla 5 ul zarar hayvanlar önlemek için.
  5. Başarısız bir enjeksiyon bir işaretidir bir kabarcık, varsa, derhal bırakın ve daha proksimal enjeksiyonunu tekrarlamak.
  6. Nazik p uygulayarak enjeksiyon tarafında kanama durdurmayaklaşık 1 dakika boyunca basıncını kontrol edin.
  7. Prosedürün sonunda, toplayıcı açmak ve kafeste fare koyun.
  8. 20 dk hayvan enjeksiyonu zarar değildi ve sternum yatma muhafaza edilmesini sağlamak için fareyi gözlemleyin. Fare yeterli bilince kavuşur kadar gözlem süresini uzatın. Tam kurtarıldı sonra diğer hayvanların şirkete fare dönün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fare kemik iliğinden elde edilen hücre çözeltisi çeşitli hücre tiplerinin oluşur. ana hücre tipi lenfositler, granülositler ve monositlerdir. Hücre tipi farklılaşma 5 gün sonra hasat hem doğal süspansiyonlar ve hücreler için Şekil 1 'de gösterilen boyutta ve ayrıntı ile tahmin edilebilir. Yetiştirilmesi sırasında değişen hücresel bileşim edin. Ancak, nüfusun doğru sınıflandırma hücresel belirteçlerin ayırt edici ifadesi güvenmek gerekir.

MPS-Sisteminin hücreleri tanımlamak i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliğinden sıçangil monosit büyük miktarda izole etmek için basit ve maliyet-etkin bir yöntem tarif eder. Monosit verimleri 5 x10 6 1.4 elde periferik kan kullanan diğer protokoller ile karşılaştırıldığında, biz tek bir donör fare 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monositlerin yüksek verim elde edebiliyoruz.

Bu yöntemle zorlukları göz önüne alındığında, bu steril olmayan koşullarda çalışırken kontaminasyon potansiyeli söz önemlidir. Durulama ve sonraki yık...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Alman Araştırma Vakfı) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, işbirlikçi araştırma merkezi) tarafından desteklenmiştir.

Teknik destek için Otto-von-Guericke Üniversitesi Magdeburg, Magdeburg, Almanya'dan Audiovisuelles Medienzentrum'dan Hans-Holger Gärtner'e teşekkürler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
6 kuyulu ultra düşük bağlantı plakasıCorning Incorporated, NY, ABD6 kuyulu ultra düşük bağlantı plakası, kapaklı, steril
8-12 haftalık, erkek, balb/c fareler Charles Nehri, Sulzfeld, Almanya
96 kuyulu plakaGreiner bio one GmbH, Frickenhausen, Almanya
Mavi ölü hücre lekesiLife technologies GmbH, Darmstadt, Almanya
Sığır serum albüminiGE Healthcare, Freiburg, AlmanyaFraksiyon V, pH 7.0
KanüllerB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Almanya28G, 30G
CD115eBioscience, San Diego, ABD12-1152
CD11beBioscience, San Diego, ABD53-0112
Hücre kültürü kabıGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, AlmanyaKapaklı, steril
SantrifüjBeckman Coulter GmbH, Krefeld, AlmanyaAllegra® X-15R santrifüj
Tüy dökücü kremVeet, Mannheim, Almanya
Dezenfeksiyon maddesiSchü lke& Mayr GmbH, Norderstedt, AlmanyaKodan Tinktur forte
Tek kullanımlık neşter No.10 Tüy emniyetli tıraş bıçağı Co.Ltd, Osaka, Japonya 
EDTASigma Aldrich, Hamburg, Almanya
Etanol %96 Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrü cken, Almanya
Ekstraksiyon ünitesi PipetusHirschmann Laborgerä te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Almanya
F4/80AbD Serotec, Dü sseldorf, AlmanyaMCA497APC
FACS tamponu Tek bileşenligrubumuz tarafından üretilmiştir PBS, %0.5 BSA, %0.1 NaN3
FACS cihazıBecton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, ABDBD FACS Canto II
FACS tüpleri       Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, ABD
Falcon® pipetBecton Dickenson Labware, NY, ABD
Fetal buzağı serumuSigma Aldrich, Hamburg, Almanya
İnce forsepsRubis, Stabio, İsviçre
EldivenRö sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Almanya
Gr1eBioscience, San Diego, ABD53-5931
Isıtma plakası Labotect GmbH, Gö ttingen, Almanya Hot Plate 062
İnkübatörEwald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, AlmanyaIncu safe
IsofluranBaxter Deutschland GmbH, Unterschleiß heim, Almanya
Işık mikroskobuCarl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, AlmanyaAxiovert 40 ° C
Makrofaj-Koloni Uyarıcı FaktörSigma Aldrich, Hamburg, AlmanyaSRP3110 
Mekanik çalkalayıcıIKA, Staufen, Almanyams2 minishaker
Orta 199PAA Laboratories GmbH, Pasching, Avusturya37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu
Mikro test tüpleriEppendorf AG, Hamburg, Almanya
Mikrobiyolojik çalışma tezgahıThermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, AlmanyaHera güvenli
Monosit yıkama tamponu Grubumuz tarafından tek bileşenliPBS, %0,5 BSA, 2 mM EDTA
Fare tutucuÇeşitli
NaClBerlin Chemie AG, Berlin, Almanya
NaN3 (sodyum asit)Sigma Aldrich, Hamburg, Almanya
Neubauer sayma odasıPaul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Kö nigshofen, Almanya
Naylon hücrelerBecton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, ABDHücre süzgeci, 70 & m ağ boyutu
Penisilin/StreptomisinSigma Aldrich, Hamburg, Almanya
Fosfat tamponlu salinLife technologies GmbH, Darmstadt, AlmanyapH 7.4, steril
PipetlerEppendorf AG, Hamburg, Almanya10&mikro; L / 100 ve mikro; L / 200 ve mikro; L / 1.000 ve mikro; l
Pipetleme kafalarıEppendorf AG, Hamburg, Almanya
Serolojik pipetGreiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, AlmanyaCellstar 5 ml, 10 ml
Aspirasyon ünitesiIntegra bioscience, Fernwald, AlmanyaVacusafe konfor
Cerrahi makasWord Precision Instruments, Inc., Sarasota, ABD
ŞırıngaB. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Almanya1 ml Omnifix® -F insülin şırınga
Kapaklı tüplerGreiner bio one GmbH, Frickenhausen, Almanya15 ml/50 ml Cellstar tüpleri
Sıcak su banyosuJulabo Labortechnik GmbH, Seelbach, AlmanyaJulabo SW22

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
  2. Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391 (2), 72-82 (2006).
  3. Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5 (2), 155-169 (2013).
  4. Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103 (7), 2668-2676 (2004).
  5. Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
  6. Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
  7. Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99 (5), 1517-1526 (2002).
  8. Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
  9. Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
  10. Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28 (6), 766-772 (2007).
  11. Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
  12. Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59 (9), 813-825 (2011).
  13. Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108 (4), 753-761 (2009).
  14. Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55 (1), 17-25 (2009).
  15. Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).
  16. Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kemik li i MonositleriMonosit zolasyonuAk SitometrisiUltra D k Yap maM CSF UygulamasCD11b CD115 F4 80Kuyruk Ven EnjeksiyonuMonosit SaflKemik li i Toplama

İlgili makaleler