Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler
Bu makalede
Özet
Özet
Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak kemirgen beyin hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Gelişmekte olan hipokamp kıvrımlarının farmakolojik maddelerin doğrudan uygulanmasını sağlayan, bu yöntem, hipokampus karakteristik topografik morfolojisini muhafaza eder. Buna ek olarak, dilim kültürlerinin kadar, 4 hafta boyunca muhafaza edilebilir ve böylece, tek bir yeni doğmuş granül nöronların olgunlaşma sürecini çalışma sağlar. Karmaşık değişkenler hariç ederken Dilim kültürleri gibi hipokampus derin anatomik konumu yanı sıra, kan beyin bariyerinin ilgili belirsizlikler gibi hipokampal dilim verimli farmakolojik manipülasyon için izin verir. Bu nedenlerden dolayı, doğum sonrası nöron araştırma için özel Organotipik dilim kültürlerinin optimize etmek için çalışmıştır.
Giriş
Memeli hipokampusundaki yetişkin nörogenezi, beynin doğuştan gelen uyum sağlama ve plastisite kapasitesinin dikkate değer bir örneğini temsil eder. Dentat granül hücreleri (DGC'ler), memeli beyninde şu anda iyi karakterize edilmiş iki nörojenik bölgeden biri olan hipokampal dentat girustaki yenilenebilir bir nöral progenitör hücre havuzundan üretilir ve öğrenme ve hafıza için özellikle önemli olduğu düşünülmektedir. Hipokampus, limbik sistemin bir parçasıdır ve memeli beyninde derin bir konuma sahiptir, bu da onu hassas farmakolojik manipülasyon için zor bir hedef haline getirir. Ek olarak, anormal nörogenez, epilepsi, şizofreni ve Alzheimer hastalığı gibi durumlarda ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Tüm hayvan prosedürleri Toronto Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Anabilim hayvan sağlığı ve refahı kurallarına uyduğu.
Hipokampal Dilimleri hazırlanması 1.
- 125 ° C'de kuru otoklav kullanarak aşağıdaki aletleri sterilize: Neşter kolu (# 3) (2), Standart desen forseps, büyük (1), Küçük disektör makas (yan açılı) (1), Mikro kaşık (kaşık ve düz spatula uçları) (1), yuvarlak Mikro-spatula (ve konik uçları yuvarlatılmış) (2), İnce fırça (1), Yangın parlatılmış Pasteur pipeti (2), tül kareler, 2 x 2 inç (5).
- Ne zaman steril, steril bir kap içine koyun ve aletleri kullanıma kadar kapalı tutun. Hemen diseksiyon önce% ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
1) dilimleri, in vitro olarak 10-21 gün sonra (DIV), sonra hipokampal dilimler karakteristik morfolojik özelliklerini korumak ve 2) yenidoğan KEGM sayısal edilebilir: Organotipik kültürler yetişkin nöron araştırma için uygun olacağını belirlemek iki ana kriterlerine uygun olması gerekmektedir erişkin nöron araştırma kullanılan standart immünohistokimyasal teknikler kullanılarak. İlk kriter ilgili olarak, Şekil 1A ve 1B korunmuş hipokampal morfolojisi vurgulayın. Böyle kıvrımlar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
CldU (veya BrdU) uygulamasını takiben, farmakolojik ajanların uygulama çizelgesi belirli bir gelişme pencereleri sırasında doğan KEGM hedef olarak seçilebilir. Örneğin, bir varsayımsal madde, GABA depolarize yerde bir gelişme aşamasında olgunlaşmamış nöronların yaşı denk önerilmiştir ikinci hafta sonra CldU enjeksiyon sırasında uygulanabilir. Bu protokolü kullanarak gelecekteki çalışmalar farmakolojik ajan ve "terzi" özel ilgi deneysel soruya yaklaşım maruz kalma penceresi adapte olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü tarafından JMW'ye 119271 bir araştırma hibesi MOP tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, olağanüstü teknik yardımı için Bayan Yao Fang Tan'a teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 5-kloro-2'-deoksiüridin (CldU) | MP Biyomedikal | 105478 | Tehlikeli, Kanserojen |
| Hücre kültürü ekleri, 30 mm çap, 0.4 ve mikro; m gözenek boyutu | Thermo scientific | 140660 | Bu kesici uçlar üzerindeki Nuclon delta kaplama, daha iyi doku yapışması sağlar ve dilim kalitesini artırır. |
| Konik Santrifüj tüpleri (steril) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Dissektör makası (yana açılı) | Güzel Bilim Aletleri | 14082-09 | |
| Minimum esansiyel ortam (MEM) | Gibco | 11095; sıvı | 4 &°C'de saklayın; C |
| Eclipse Ni-U floresan mikroskobu | Nikon | ||
| Doku için Yapıştırıcı | Krazy Glue | KG585 | Yapıştırıcıya maruz kalan herhangi bir doku IHC için kullanılamaz olacağından, yapışma elde etmek için minimum miktarda yapıştırıcı kullanın. |
| Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (500 ml) | Gibco | 14025-092 | 4 °C'de saklayın; C |
| At Serumu Isıyla İnaktive Edilmiş (500 ml) | Gibco | 16050-122 | 50 ml alikot yapın ve -20 °C'de saklayın; C |
| Kimwipes | Kimberly-Clarke | TW 31KYPBX | |
| Modifiye cam pipetler (Pasteur pipetinin alt kısmı çıkarılmış ve kenarı Bunsen alevi ile düzeltilmiş) | |||
| Petri Kabı (100 mm x 15 mm) ve (60 mm x 15 mm) | Fisher Marka | FB0875712 ve FB0875713A | |
| Neşter bıçakları #11 | Güzel Bilim Araçları | 10011-00 | |
| Neşter sapı #3 | İnce Bilim Araçları | 10003-12 | |
| Serolojik Pipetler | Sorfa Medikal Plastik A.Ş. | P8050 | |
| Standart Model forseps | Güzel Bilim Araçları | 11000-12 | |
| Steril vakum filtresi | Thermo-Scientific | 565-0020 | |
| Cerrahi Makas | Güzel Bilim Araçları | 14054-13 | |
| Şırınga tahrikli filtre ünitesi | Millipore-Millex | SLGP033RS | |
| Hareketli kademeli | Stoelting ve nbsp; | 51425 | |
| İnce uçlu boya fırçası |
Kaynaklar
- Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
