Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

12.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52353

⸱

4 Mart 2015

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Toronto, 2Institute of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, National Yang-Ming University, 3Department of Education and Research, Taipei City Hospital

Bu makalede

Özet

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

Özet

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak kemirgen beyin hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Gelişmekte olan hipokamp kıvrımlarının farmakolojik maddelerin doğrudan uygulanmasını sağlayan, bu yöntem, hipokampus karakteristik topografik morfolojisini muhafaza eder. Buna ek olarak, dilim kültürlerinin kadar, 4 hafta boyunca muhafaza edilebilir ve böylece, tek bir yeni doğmuş granül nöronların olgunlaşma sürecini çalışma sağlar. Karmaşık değişkenler hariç ederken Dilim kültürleri gibi hipokampus derin anatomik konumu yanı sıra, kan beyin bariyerinin ilgili belirsizlikler gibi hipokampal dilim verimli farmakolojik manipülasyon için izin verir. Bu nedenlerden dolayı, doğum sonrası nöron araştırma için özel Organotipik dilim kültürlerinin optimize etmek için çalışmıştır.

Giriş

Memeli hipokampusundaki yetişkin nörogenezi, beynin doğuştan gelen uyum sağlama ve plastisite kapasitesinin dikkate değer bir örneğini temsil eder. Dentat granül hücreleri (DGC'ler), memeli beyninde şu anda iyi karakterize edilmiş iki nörojenik bölgeden biri olan hipokampal dentat girustaki yenilenebilir bir nöral progenitör hücre havuzundan üretilir ve öğrenme ve hafıza için özellikle önemli olduğu düşünülmektedir. Hipokampus, limbik sistemin bir parçasıdır ve memeli beyninde derin bir konuma sahiptir, bu da onu hassas farmakolojik manipülasyon için zor bir hedef haline getirir. Ek olarak, anormal nörogenez, epilepsi, şizofreni ve Alzheimer hastalığı gibi durumlarda rol oynamıştır ve bu da yenidoğan nöronlarının olgunlaşması ve hayatta kalması sırasında çeşitli farmakolojik ajanların etkisini anlamaya ilgi uyandırmıştır. Postnatal ve erişkin nörojenez arasındaki ayrım bulanıktır ve önceki çalışmalar, erken postnatal dönemde ve yetişkinlikte in vivo nöronal gelişimin birçok özelliğinin benzer olduğunu göstermiştir25. Burada postnatal nörogenezi vurguluyor ve erişkin nörogenezi için olası uygulamaları öneriyoruz.

Organotipik dilim kültürleri, memeli hipokampusunun çeşitli fizyolojik özelliklerini incelemek için etkili bir in vitro yöntem sağlar. Kemirgen beyinlerinden hazırlanan dilim kültürlerinin değeri üç ana nitelikte özetlenebilir: 1) protokol basittir ve hazır malzemeler gerektirir; 2) dilim kültürleri, hipokampusun derin anatomik konumu gibi karmaşık değişkenleri ortadan kaldıran ve kan beyin bariyerini aşan farmakolojik çalışmalaraizin verir 1; ve 3) hipokampus ve tri-sinaptik devrenin iyi karakterize edilmiş yapısı korunur2. Önceki araştırmacılar, sinaptik gelişim ve fizyoloji3,4, gliogenez5-7, iskemik beyin hasarı8,9, nöroproteksiyon ve nöroonarım10-12 ve epilepsi13-15'i incelemek için organotipik hipokampal kültürü kullanmışlardır. Dilim kültürler ayrıca, hücrelerin yeşil floresan proteini (GFP) veya diğer hayati belirteçlerle etiketlenmesiyle bağlantılı olarak hücre gelişiminin izlenmesine izin veren yararlı bir model sistemi sağlayabilir.

Dilim kültürleri daha önce doğum sonrası hipokampal nörogenezi incelemek için de kullanılmıştır16-19, ancak bu çalışmaların çoğunda önemli bir faktör, in vitro olarak yaklaşık 2 hafta sonra yetişkin hayvanlardan doku çıkarılmasından kaynaklanan iyi karakterize edilmiş dejenerasyondur 20,21. Bu nedenle, dilim kültürler tipik olarak erken doğum sonrası (P5-P10) farelerden veya sıçan yavrularından hazırlanır, bu dakültürleme için erken doğum sonrası beyin dokusunun gelişmiş canlılığını kullanır 22. Önceki çalışmalar, erken postnatal ve yetişkin hipokampusun sinaptik fizyoloji ve spesifik nöronal alt tiplerin ekspresyonu açısından farklılık gösterdiğini göstermiş olsa da23,24, yenidoğan dentat granül hücrelerinin olgunlaşma sırasında ilerlediği koreografisi yapılmış gelişimsel programın önemli ölçüde korunması vardır25. Ek olarak, son çalışmalar, kültürdeki yenidoğan DGC'lerinin fizyolojik özelliklerinin, akut hipokampal dilim hazırlığındaki olgunlaşmamış nöronlara çok benzer olduğunu göstermiştir16.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Tüm hayvan prosedürleri Toronto Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Anabilim hayvan sağlığı ve refahı kurallarına uyduğu.

Hipokampal Dilimleri hazırlanması 1.

  1. 125 ° C'de kuru otoklav kullanarak aşağıdaki aletleri sterilize: Neşter kolu (# 3) (2), Standart desen forseps, büyük (1), Küçük disektör makas (yan açılı) (1), Mikro kaşık (kaşık ve düz spatula uçları) (1), yuvarlak Mikro-spatula (ve konik uçları yuvarlatılmış) (2), İnce fırça (1), Yangın parlatılmış Pasteur pipeti (2), tül kareler, 2 x 2 inç (5).
  2. Ne zaman steril, steril bir kap içine koyun ve aletleri kullanıma kadar kapalı tutun. Hemen diseksiyon önce% 70'lik bir etanol çözeltisi içinde aletleri bırakın.
  3. 35 ° C a kuvöz plaka de / kültür ortamı, 1 ml ilave edilmesi ve depolanması ile diseksiyon işlemine başlamadan önce, bir kültür olarak yerleştirilmiş bir 6-yuvalı kültür plakası hazırlayınnd% 5 CO 2.

2. Steril Laminer Akış kaputu Diseksiyon Araçlar düzenleyin

  1. % 70 etanol ile laminer akış kaputu Sprey ve alkolden sterilize diseksiyon aletleri çıkarın. Steril Petri kabı üzerinde duran alkol ve disseke beyin dokusu arasındaki teması önlemek için ise araçlar kurumasını bekleyin.
  2. 2 büyük steril Petri kapları içinde steril, buz gibi soğuk kesme çözeltisi Deposit 5-7 mi. Bir tabak soğuk ve kafa (kirli), soğutma ve scooped beyin (temiz) durulama için diğerini temizler. Beyin dışarı Anatomi için Petri kabı kapaklarının birinde steril filtre kağıdı yerleştirin.
  3. Hipokampus diseksiyon küçük Petri kabı kapağının birinde küçük, sterilize filtre kağıdı yerleştirin. 2 küçük steril Petri kapları içinde sterilize buz soğukluğunda kesme çözeltisi Deposit 3-5 mi. Bir çanak, bir hipokampal bölümlere ayrılması sırasında bölümleri yapacak, scooped hipokampus yapacakdiseksiyon mikroskop altında.
  4. Kesme aşamasına steril filtre kağıdı parçası ölçme ve steril bir traş makinesi bıçak ağzı tarafından, doku kesicisi hazırlayın. Sterilize diseksiyon çözümü ile filtre kağıdı ıslatın.
  5. Alkol ile temiz bir biyo-çanta Sprey ve laminer akış temiz tezgah yerleştirin.

3. Hipokampal Diseksiyon

  1. Laminer akımlı temiz tezgah dışında% 70 etanol ile P7 Sprague Dawley sıçan yavru Sprey ve hızlı bir şekilde laminer akış tezgah içinde büyük steril cerrahi makas kullanarak hayvan başını kesmek. Baş Petri yemekleri biri buz gibi soğuk diseksiyon çözüm içine bırakalım.
  2. Petri kabındaki, kan durulayın ve hızlı bir şekilde aşağı sterilize filtre kağıdına kafa, ventral tarafı aktarmak.
  3. Sagital düzlemde dorsal yüzeyi boyunca kesilmiş neşter kullanarak altta yatan kafatası ortaya çıkarmak. Yumuşak ve t sıçanlarda kolayca nüfuz altta yatan kemik, deri yoluyla kesin değilOnun yaşı. Kenara bu "kirli" neşter ayarlayın ve beyin dokusu üzerinde kullanmayın.
  4. Küçük disektör (yan açılı) makas ve forseps kullanarak, bregmaya kafatası sagital sütür boyunca koronal sütür sagital sütür ile dik kesişen kafatası üzerinde anatomik nokta kafatasını açık kesti. Kafatasının orta hattan yukarı ve uzağa kafatası kanatları çekmek için forseps kullanın.
  5. Yavaşça kafatasının dışında beyin kaldırmak için, beyin sapı altındaki beynin alt, mikro kaşık yerleştirin. Beynin bazal yüzeyinde optik sinirler ve koku ampul maruz beyin kaldırın. Tam kafatası beyin ayırmak için küçük makas ile bu yapıları kesin. Çıkarın ve buz soğukluğunda bir kesme çözeltisini ihtiva eden başka bir büyük bir Petri tabağına sağlam beyin aktarın.
  6. Mikro kaşık kullanarak, steril filtre kağıdı içeren küçük bir Petri-çanak kapak beyin aktarın. Steril bir Pasteur pipeti ile dis birkaç damla ile beyin durulayınçözüm secting doku nemli tutmak için.
  7. "Temiz" neşter bıçak kullanarak arayla iki hemisfer kesti. Mikro kaşıkla büyük Petri kabı sol arka yarımkürede aktarın ve sonraki kullanım için buz gibi soğuk diseksiyon çözeltisi içinde aşağı yarımkürede pia tarafı yerleştirin.
  8. Sağ hemisfer medial yüzünü görüntüleyin ve kenar forniksinin, hipokampusun medial kenarı boyunca beyaz cevher önemli bir bant tespit. Steril bir neşter kullanarak, forniksten aracılığıyla bir sagital kesim yapmak, ancak neşter ucu sadece 0,5 cm forniksinin kesmek için yeterli olacaktır, çünkü dikkat çekmek.
  9. 2 mikro-spatula kullanarak, beyin sapı üzerinde sağ-spatula yerleştirerek ve sol spatula ile örten korteks kaldırarak sağ hemisfer ilk hipokampus çıkarın. Yavaşça hipokampus lateral ventrikül ve medial yüzeyi ortaya çıkarmak için korteks kaldırın. Beyaz eğri çizgi, Fimbria, şimdi görünür olmalıdır.
  10. Curva ile spatula eğrilik hizalayınfimbrial Ture ve yavaşça fimbrial altında spatula basın. Sol spatula kaydırın ve rostral-kaudal ekseni boyunca binmek ve daha sonra hipokampus çıkarmak için dorsal yönde spatula kaldırın.
  11. Buz gibi soğuk diseksiyon çözeltisi ile bir 2. küçük Petri kabı hipokampus aktarın. Sol hipokampus kaldırmak için sol yarımkürede aynı işlemi tekrarlayın.
  12. Bir mikro spatula kullanarak, dikkatle doku kıyıcı aşamasına hippocampi aktarın. Kıyıcı bıçak eksenine birbirine dik bunları bitişik ve paralel düzenlemek. Doku konumuna Hipokampuslardan ve üst kesme solüsyonu ve bir kaç damla eklemek için bir fırça kullanılır.
  13. Bireysel dilimleri kaldırmak için duraklamadan 400 mikron dilimleri doku kesin (genellikle bıçak uygun olmaz). Bütün hipokamp kesilmiş sonra, yavaşça diseksiyon çözeltisi ile 2. küçük bir Petri tabağına bölümleri aktarmak için fırça kullanılır.
  14. Reklamın altındamikroskop issecting, dikkatle amicro-spatula ve fırça kullanarak kayan dilimleri ayırmak.
  15. Bir laminar akış başlığı içinde kuluçka ve yerine kültür girişi ile önceden hazırlanmış bir kültür tabağı çıkarın.
  16. Bir yangın cilalı Pasteur pipet kullanarak, kültür insert membran apikal yüzeye pipet ve transfer dilimler halinde 4-5 dilim çizin. Sonraki, bir fırça ile konumlandırma ayarlayın ve bireysel bölümlere ve kültür insert sınırında arasında boşluk bırakın.
  17. Steril bir Pasteur pipeti kullanılarak, zarın tepe yüzey aşırı kesme uzaklaştırın.
    NOT: pipet içine doku bölümleri çizim çözüm kaçınınız çıkarırken. Alternatif olarak, yavaş yavaş çözüm kaldırmak için sterilize pipet uçları ile düzenli pipet (P200 veya P1000) kullanın.
  18. Serum içeren kültür ortamı ile, 35 ° C'de tekrar inkübatör içine hipokampal dilimler ve% 5 CO2 ile birlikte kültür plakası yerleştirin.
    NOT: Deney aramaları durumundaBirden hayvanlardan kültürleri üretmek için, iyice diseksiyonların arasındaki laminer akış temiz tezgah temizleyin. Alkol çözüm araçları dönün ve tüm Petri-yemekleri, filtre kağıtları ve ikinci diseksiyon öncesinde steril Jilet değiştirin.

4. Beslenme ve Organotipik Dilimleri bakımı

  1. Steril bir laminer akımlı temiz tezgah Yem kültürleri.
  2. Kültürlü bölümlerde 2 gün sonrası diseksiyon ilk beslenmesini yapın. Steril cam pipet kullanarak aspire eski kültür ortamı.
  3. Çukurlara, taze, steril, serum ihtiva eden ortamda 1 ml eklemek için 5 ml steril serolojik pipet kullanın.
  4. Yavaşça kültür yuvasını yerine ve membran yüzeyinde altında oluşmuş olabilecek herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için özen gösterin.
  5. İlk besleme sonra, her gün orta değiştirin.

Timidin Analoglarının 5. Enkübe Doku Dilimleri Yenidoğan Nöronlar Etiket için

  1. Incelemek için,olgunlaşma ve hipokampus dentat granül hücrelerin entegrasyonu Bromodoksiüridin (BrdU) veya Chlorodeoxyuridine (CldU) gibi bir timidin analoğu olan Organotipik dilimleri inkübe edin. Burada, çünkü tuzlu su içinde daha yüksek çözünürlüğe sahip CldU kullanır.
  2. 3DIV sonra, 10 ug / ml'lik bir son konsantrasyon için, kültür ortamı içinde 1 ml tuzlu su içinde 10 mg / ml CldU stok çözeltisi 1 ul ekle. BrdU kullanılırsa, molekül ağırlığı farklılıkları konsantrasyonu düzeltin. Kültür çukurlarına CldU ile ortamı ilave edin ve 35 ° C'de 2 saat boyunca ortam CldU-içeren doku inkübe edin.
  3. 35 ° C'de inkübasyon 2 saat sonra, CldU içeren orta kaldırmak ve (aşağıda belirtilmiştir), normal beslenme programı devam etmek için düzenli olarak besleme ortamı ile değiştirin.

6. Doku Fiksasyon ve Depolama

  1. Tedavileri uygulayarak ve kültür deneyleri (Şekil 2B) başlamadan önce doku örnekleri sabitlemek için bir zaman çizelgesi oluşturulması.
    2. <önceden tespit edilmiş bir gün sonraki diseksiyon Li>, bir laboratuar bir davlumbaz aşağıdaki hazırlamak: 10-50 ml'lik beher cam, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ihtiva etmektedir; atılan kültür ortamı için boş bir beher; küçük forseps; tek kullanımlık uçları olan ve 1.000 ml'lik pipet.
  2. Davlumbaz için kuluçka odası ve transfer kültür plakası (ler) sökün. Forseps ile bireysel kuyu plaka ekler eğin. Sonraki, bir bertaraf beher kültür ortamı ve transferi kaldırmak için bir pipet kullanın. Tüm kültür ortamı çıkarılır emin olmak için bir açıyla kültürü plakası yatırın.
  3. Bir seferde bir kültür plaka için ortamı çıkarmadan bitirin. Orta kaldırıldığında, her bir kültür için% 4 PFA 1 ml ekleyin ve iyice parafilm plaka sızdırmaz. 24 saat süre ile 4 ° C'de bir buzdolabı için gerekli ve aktarma levhaları kadar kültür plakaları için tekrarlayın.
  4. 24 saat sonra, bir çeker ocak içinde, aşağıdaki hazırlama: 10-50 PBS içinde% 0.1 sodyum azid ihtiva eden mi beher; Boşatılan PFA (toksik maddelerin imha ederken güvenlik önlemlerine uyun) için beher; küçük forseps; tek kullanımlık uçları olan ve 1.000 ml pipet.
  5. PFA eklemek için 6.4 özetlenen prosedürü uygulayın, ancak bunun yerine sodyumazid ile PBS 1 ml ekleyin. Bir kez tamamen parafilm kenarları sarılması ve 4 ° C'de buzdolabında muhafaza gelecekteki kullanım için, sızdırmaz kuyucuğu aktarılır.

7. İmmünohistokimya için Doku Kesit

  1. Bir vibratome kullanarak kesit doku gerçekleştirin. adımlar aşağıdaki serisi organotipik kültürlerden kullanılabilir doku kesitlerinin verimi üst düzeye çıkarmanıza yardımcı.
    Not: hemen hipokampal diseksiyon ve dilimlerin kaplama ardından doku yaklaşık 400 um'lik bir kalınlığa sahiptir. Bununla birlikte, inkübasyon odasında 2-3 hafta sonra doku dilimleri 150-300 um'lik bir son kısmı kalınlığı ile sonuçlanarak, düzleştirmek başlayacaktır.
  2. Bölüm kültürlü dokuya aşağıdaki öğeleri hazırlayın: # 11 neşter bLade ve idare, doku monte buz soğuk PBS, bir mikro-diseksiyonu forseps ve temiz bir vibratome kesme aşamasını içeren bir cam Petri.
  3. Plastik uç gövdesinden ayrılmış, böylece bir neşter kullanarak dikkatli bir şekilde dairesel uç zarın çevresi boyunca kesmek için kullanılır. Kültürlü dilim ve neşter arasındaki geniş boşluk bırakın.
  4. PBS içeren bir petri tabağına konulacak ve müstakil uç membran aktarın. PBS ile durulandıktan sonra vibratome montaj aşamasına membran aktarmak için forseps kullanır.
  5. Sonraki, kültürlü dilimleri çevreleyen membran aşırı ortadan kaldırmak ve temiz kenarları oluşturmak için fazla malzeme kesip neşter kullanın. Membran sağlayacak bu adım, düz ve kolayca kesme yüzeyine yapışabilir.
  6. Vibratome kesme sahnede yapışkan 1-2 damla koyun ve hatta 22 G iğne kullanılarak katmanda yayıldı. Vibratome kesme bıçağının uzun kenar paralel bir dikdörtgen şekil yapıştırıcıyı yayıldı. Bu adımı gerçekleştirinhızlı bir şekilde, kurutma yapıştırıcıyı önler.
  7. Kesme aşamasına hipokampal dilimleri içeren kesilmiş membran aktarmak ve yavaşça tutkal membran konumlandırmak ve hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olmak için forseps kullanın.
  8. Süper yapıştırıcı kurudukça geri içeren PBS Petri kabı yapıştırılmış membran ile vibratome aşamasına aktarılır. Vibratome bıçak ve doku bölümleri depolamak için bir 48 oyuklu plaka ihtiva eden sodyum azid hazırlayın.
  9. Depolama ve daha sonra immünohistokimyasal boyanması için bir 48 oyuklu plaka içeren sodyum azide Organotipik dilim doku ve transferin 30 um bölümler oluşturmak için vibratome kullanın.
  10. Immünohistokimyasal boyama 26,29 için protokolleri mevcut önceden başvurun.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

1) dilimleri, in vitro olarak 10-21 gün sonra (DIV), sonra hipokampal dilimler karakteristik morfolojik özelliklerini korumak ve 2) yenidoğan KEGM sayısal edilebilir: Organotipik kültürler yetişkin nöron araştırma için uygun olacağını belirlemek iki ana kriterlerine uygun olması gerekmektedir erişkin nöron araştırma kullanılan standart immünohistokimyasal teknikler kullanılarak. İlk kriter ilgili olarak, Şekil 1A ve 1B korunmuş hipokampal morfolojisi vurgulayın. Böyle kıvrımlar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CldU (veya BrdU) uygulamasını takiben, farmakolojik ajanların uygulama çizelgesi belirli bir gelişme pencereleri sırasında doğan KEGM hedef olarak seçilebilir. Örneğin, bir varsayımsal madde, GABA depolarize yerde bir gelişme aşamasında olgunlaşmamış nöronların yaşı denk önerilmiştir ikinci hafta sonra CldU enjeksiyon sırasında uygulanabilir. Bu protokolü kullanarak gelecekteki çalışmalar farmakolojik ajan ve "terzi" özel ilgi deneysel soruya yaklaşım maruz kalma penceresi adapte olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü tarafından JMW'ye 119271 bir araştırma hibesi MOP tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, olağanüstü teknik yardımı için Bayan Yao Fang Tan'a teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5-kloro-2'-deoksiüridin (CldU)MP Biyomedikal105478Tehlikeli, Kanserojen
Hücre kültürü ekleri, 30 mm çap, 0.4 ve mikro; m gözenek boyutuThermo scientific 140660Bu kesici uçlar üzerindeki Nuclon delta kaplama, daha iyi doku yapışması sağlar ve dilim kalitesini artırır.
Konik Santrifüj tüpleri (steril)Fisher Scientific14-432-22
Dissektör makası (yana açılı)Güzel Bilim Aletleri 14082-09
Minimum esansiyel ortam (MEM)Gibco11095; sıvı4 &°C'de saklayın; C
Eclipse Ni-U floresan mikroskobuNikon
Doku için YapıştırıcıKrazy GlueKG585Yapıştırıcıya maruz kalan herhangi bir doku IHC için kullanılamaz olacağından, yapışma elde etmek için minimum miktarda yapıştırıcı kullanın.
Hank' s Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) (500 ml)Gibco14025-0924 °C'de saklayın; C
At Serumu Isıyla İnaktive Edilmiş (500 ml)Gibco16050-12250 ml alikot yapın ve -20 °C'de saklayın; C
KimwipesKimberly-ClarkeTW 31KYPBX
Modifiye cam pipetler (Pasteur pipetinin alt kısmı çıkarılmış ve kenarı Bunsen alevi ile düzeltilmiş)
Petri Kabı (100 mm x 15 mm) ve (60 mm x 15 mm)Fisher MarkaFB0875712 ve FB0875713A
Neşter bıçakları #11Güzel Bilim Araçları10011-00
Neşter sapı #3İnce Bilim Araçları10003-12
Serolojik PipetlerSorfa Medikal Plastik A.Ş.P8050
Standart Model forsepsGüzel Bilim Araçları11000-12
Steril vakum filtresiThermo-Scientific565-0020
Cerrahi MakasGüzel Bilim Araçları14054-13
Şırınga tahrikli filtre ünitesiMillipore-MillexSLGP033RS
Hareketli kademeliStoelting ve nbsp;51425
İnce uçlu boya fırçası

Kaynaklar

  1. Buchs, P. A., Stoppini, L., Muller, D. Structural modifications associated with synaptic development in area CA1 of rat hippocampal organotypic cultures. Brain research. Developmental Brain Research. 71 (1), 81-91 (1993).
  2. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  3. Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  4. Muller, D., Buchs, P. A., Stoppini, L. Time course of synaptic development in hippocampal organotypic cultures. Developmental Brain Research. 71 (1), 93-100 (1993).
  5. Rio, J. A., Heimrich, B., Soriano, E., Schwegler, H., Frotscher, M. Proliferation and differentiation of glial fibrillary acidic protein-immunoreactive glial cells in organotypic slice cultures of rat hippocampus. Neuroscience. 43 (2-3), 335-347 (1991).
  6. Ziemka-Nalecz, M., Stanaszek, L., Zalewska, T. Oxygen-glucose deprivation promotes gliogenesis and microglia activation in organotypic hippocampal slice culture: involvement of metalloproteinases. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 73 (1), 130-142 (2013).
  7. Subramanian, L., et al. Transcription factor Lhx2 is necessary and sufficient to suppress astrogliogenesis and promote neurogenesis in the developing hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), E265-E274 (2011).
  8. Strassburger, M., Braun, H., Reymann, K. G. Anti-inflammatory treatment with the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB239063 is neuroprotective, decreases the number of activated microglia and facilitates neurogenesis in oxygen-glucose-deprived hippocampal slice cultures. European Journal Of Pharmacology. 592 (1-3), 55-61 (2008).
  9. Sadgrove, M. P., Chad, J. E., Gray, W. P. Kainic acid induces rapid cell death followed by transiently reduced cell proliferation in the immature granule cell layer of rat organotypic hippocampal slice cultures. Brain Research. 1035 (2), 111-119 (2005).
  10. Wise-Faberowski, L., Robinson, P. N., Rich, S., Warner, D. S. Oxygen and glucose deprivation in an organotypic hippocampal slice model of the developing rat brain: the effects on N-methyl-D-aspartate subunit composition. Anesthesia and Analgesia. 109 (1), 205-210 (2009).
  11. Cho, S., Wood, A., Brain Bowlby, M. R. slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  12. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS And Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  13. Berdichevsky, Y., et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 33 (21), 9056-9067 (2013).
  14. Koyama, R., et al. GABAergic excitation after febrile seizures induces ectopic granule cells and adult epilepsy. Nature Medicine. 18 (8), 1271(2012).
  15. Staley, K. J., White, A., Dudek, F. E. Interictal spikes: harbingers or causes of epilepsy. Neuroscience Letters. 497 (3), 247-250 (2011).
  16. Lee, H., Lee, D., Park, C. H., Ho, W. K., Lee, S. H. GABA mediates the network activity-dependent facilitation of axonal outgrowth from the newborn granule cells in the early postnatal rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 36 (6), 2743-2752 (2012).
  17. Raineteau, O., et al. Conditional labeling of newborn granule cells to visualize their integration into established circuits in hippocampal slice cultures. Molecular and Cellular Neurosciences. 32 (4), 344-355 (2006).
  18. Raineteau, O., Rietschin, L., Gradwohl, G., Guillemot, F., Gahwiler, B. H. Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Molecular And Cellular Neurosciences. 26 (2), 241-250 (2004).
  19. Kamada, M., et al. Intrinsic and spontaneous neurogenesis in the postnatal slice culture of rat hippocampus. The European Journal Of Neuroscience. 20 (10), 2499-2508 (2004).
  20. Kim, H., Kim, E., Park, M., Lee, E., Namkoong, K. Organotypic hippocampal slice culture from the adult mouse brain: a versatile tool for translational neuropsychopharmacology. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 41, 36-43 (2013).
  21. Legradi, A., Varszegi, S., Szigeti, C., Gulya, K. Adult rat hippocampal slices as in vitro models for neurodegeneration: Studies on cell viability and apoptotic processes. Brain Research Bulletin. 84 (1), 39-44 (2011).
  22. Sadgrove, M. P., Laskowski, A., Gray, W. P. Examination of granule layer cell count, cell density, and single-pulse BrdU incorporation in rat organotypic hippocampal slice cultures with respect to culture medium, septotemporal position, and time in vitro. The Journal of Comparative Neurology. 497 (3), 397-415 (2006).
  23. Mielke, J. G., et al. Cytoskeletal, synaptic, and nuclear protein changes associated with rat interface organotypic hippocampal slice culture development. Developmental Brain Research. 160 (2), 275-286 (2005).
  24. Fabian-Fine, R., Volknandt, W., Fine, A., Stewart, M. G. Age-dependent pre- and postsynaptic distribution of AMPA receptors at synapses in CA3 stratum radiatum of hippocampal slice cultures compared with intact brain. European Journal of Neuroscience. 12 (10), 3687-3700 (2000).
  25. Laplagne, D. A., et al. Functional convergence of neurons generated in the developing and adult hippocampus. PLoS Biology. 4 (12), e409(2006).
  26. McDonald, H. Y., Wojtowicz, J. M. Dynamics of neurogenesis in the dentate gyrus of adult rats. Neuroscience Letters. 385 (1), 70-75 (2005).
  27. Stone, S. S., et al. Functional convergence of developmentally and adult-generated granule cells in dentate gyrus circuits supporting hippocampus-dependent memory. Hippocampus. 21 (12), 1348-1362 (2011).
  28. Wang, S., Scott, B. W., Wojtowicz, J. M. Heterogenous properties of dentate granule neurons in the adult rat. Journal of Neurobiology. 42 (2), 248-257 (2000).
  29. Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
  30. Fritsch, R. S. E. R., Weibel, E. R. Stereological Methods, Vol. 1: Practical Methods for Biological Morphometry. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie. 21 (8), 630-630 (1981).
  31. Bunk, E. C., Konig, H. G., Bonner, H. P., Kirby, B. P., Prehn, J. H. NMDA-induced injury of mouse organotypic hippocampal slice cultures triggers delayed neuroblast proliferation in the dentate gyrus: an in vitro model for the study of neural precursor cell proliferation. Brain Research. 1359, 22-32 (2010).
  32. Kolb, B., Pedersen, B., Ballermann, M., Gibb, R., Whishaw, I. Q. Embryonic and postnatal injections of bromodeoxyuridine produce age-dependent morphological and behavioral abnormalities. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 19 (6), 2337-2346 (1999).
  33. Morris, S. M. The genetic toxicology of 5-bromodeoxyuridine in mammalian cells. Mutation Research. 258 (2), 161-188 (1991).
  34. Bannigan, J., Langman, J. The cellular effect of 5-bromodeoxyuridine on the mammalian embryo. Journal Of Embryology And Experimental Morphology. 50, 123-135 (1979).
  35. Breunig, J. J., Arellano, J. I., Macklis, J. D., Rakic, P. Everything that glitters isn't gold: a critical review of postnatal neural precursor analyses. Cell Stem Cell. 1 (6), 612-627 (2007).
  36. Duque, A., Rakic, P. Different effects of bromodeoxyuridine and [3H]thymidine incorporation into DNA on cell proliferation, position, and fate. The Journal Of Neuroscience : The Official Journal Of The Society For Neuroscience. 31 (42), 15205-15217 (2011).
  37. Namba, T., Mochizuki, H., Onodera, M., Namiki, H., Seki, T. Postnatal neurogenesis in hippocampal slice cultures: early in vitro labeling of neural precursor cells leads to efficient neuronal production. Journal of Neuroscience Research. 85 (8), 1704-1712 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Organotipik Dilim KültürüHipokampal NörojenezDentat GirusMitotik Markör Etiketlemeİmmünohistokimyasal BoyamaDoku Kesit AlmaVibratom ile Kesit AlmaHücre Sayım AnaliziFarmakolojik ManipülasyonPostnatal Nöron Matürasyonu
POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.