Method Article

Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi KCNJ10 (Kir4.1)

DOI:

10.3791/52406

⸱

September 26th, 2015

 , 
1Department of Cell Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA metilasyonu, çeşitli uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunda dinamik değişikliklere izin vermenin yanı sıra, gen ekspresyonunun stabil seviyelerini koruyabilir. DNA metilasyonundaki gene özgü değişikliklerin ve bu değişikliklerin gen ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine izin veren teknikleri detaylandırıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA metilasyonu, bir sitozin-guanin dinükleotidindeki bir sitozinin C5 pozisyonuna bir metil grubunun kovalent bağlanması yoluyla gen ekspresyonunu düzenlemeye hizmet eder. DNA metilasyonu, gen ekspresyonunda uzun süreli ve stabil değişiklikler sağlarken, DNA metilasyonunun kalıpları ve seviyeleri de çeşitli sinyallere ve uyaranlara bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, DNA metilasyonu, gen ekspresyonunun güçlü ve dinamik bir düzenleyicisi olarak işlev görür. Nöroepigenetik çalışması, DNA metilasyonunda hem küresel hem de gene özgü değişikliklerle ilişkili çeşitli fizyolojik ve patolojik durumları ortaya çıkarmıştır. Spesifik olarak, gen ekspresyonundaki değişiklikler ile DNA metilasyonu arasındaki çarpıcı korelasyonlar, nöropsikiyatrik ve nörodejeneratif bozukluklarda, sinaptik plastisite sırasında ve CNS hasarını takiben mevcuttur. Bununla birlikte, nöroepigenetik alanı, DNA metilasyonunun CNS fizyolojisindeki rolüne ilişkin anlayışını genişletmeye devam ettikçe, gen ekspresyonu ve DNA metilasyonundaki değişiklikler açısından nedensel ilişkilerin tanımlanması esastır. Ayrıca, daha geniş sinirbilim alanıyla ilgili olarak, geniş bölge ve hücreye özgü farklılıkların varlığı, transkriptom, proteom ve epigenomu incelerken bu farklılıkları ele alan teknikler gerektirir. Burada, hem RNA transkripsiyonunun hem de DNA metilasyonunun daha sonra incelenmesine izin veren kortikal astrositlerin FACS sıralamasını açıklıyoruz. Ayrıca, DNA metilasyonunu, metilasyona duyarlı yüksek çözünürlüklü eriyik analizini (MS-HRMA) ve ayrıca bir lusiferaz promotör testini incelemek için bir tekniği detaylandırıyoruz. Bu kombine tekniklerin kullanılmasıyla, yalnızca DNA metilasyonu ve gen ekspresyonu arasındaki korelasyon değişikliklerini keşfetmekle kalmaz, aynı zamanda belirli bir gen bölgesinin DNA metilasyon durumundaki değişikliklerin transkripsiyonel aktiviteyi etkilemek için yeterli olup olmadığını doğrudan değerlendirebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetik, genomun transkripsiyonel aktivitesini etkileyebilecek kimyasal modifikasyonların incelenmesidir. Esasen, DNA dizisinde bir değişiklik olmadan, DNA metilasyonu, histon asetilasyonu ve histon metilasyonu gibi epigenetik modifikasyonlar, gen ekspresyonu 1'in modellerini geri dönüşümlü olarak değiştirmek için yeterlidir. Gen ekspresyonunun güçlü bir düzenleyicisi olan DNA metilasyonu, en iyi karakterize edilen epigenetik modifikasyondur. DNA metilasyonu, metil gruplarının bir sitozinin C5 pozisyonu üzerinde, tipik olarak bir CpG bölgesi olarak da bilinen bir sitozin-guanin dinükleotidinin sitozininde kovalent bağlanmasıdır. Yüksek yoğunluklu CpG siteleri içeren alanlar, CpG adaları (CGI'ler) olarak bilinir. CGI'lar sıklıkla transkripsiyonel başlangıç bölgeleri (TSS) ve gen promotörleri 1-3 ile ilişkilidir. Bu nedenle, CGI'larda DNA metilasyonundaki değişiklikler her zaman hücresel ekspresyon veya fonksiyondaki değişikliklerle eşzamanlı olmasa da, CGI'lardaki DNA metilasyonundaki değişiklikler transkripsiyonel aktivite 2 üzerinde güçlü bir düzenleme uygulayabilir.

Tarihsel olarak, DNA metilasyonunun embriyogenez, damgalama ve gelişimde gerekli olduğu gözlemlenmiştir, post-mitotik hücrelerde meydana gelen DNA metilasyon seviyelerinde çok az değişiklik olmuştur (kanserle ilişkili genlerdeki değişiklikler hariç) 4,5. Bununla birlikte, nöroepigenetik alanı, DNA metilasyonu için önemli bir gelişimsel olmayan rolü vurgulamıştır. Spesifik olarak, bilişsel epigenetik, DNA metilasyonunu, öğrenme ve hafıza süreci için gerekli olan genlerin hem transkripsiyonel aktivasyonuna hem de baskılanmasına aracılık etmede ayrılmaz bir rol oynayan oldukça plastik bir mekanizma olarak yeniden tanımlamıştır 6. Bilişsel epigenetiğin yanı sıra, iskemik yaralanma ve nöropatik ağrıyı modelleyen çalışmalar, DNA metilasyonunu çeşitli CNS hakaretlerine hızla yanıt veren kararsız bir mekanizma olarak karakterize eder 7-9. Astrositlerle ilgili olarak, birkaç kanıt dizisi DNA metilasyonunun astrogliogenezde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Fan ve ark., nöral progenitör hücrelerde (NPC'ler) DNMT1'in koşullu KO'sunun, küresel bir hipometilasyon durumu 10 ile uyumlu astrositlerin erken gelişmesine yol açtığını buldu. Ek olarak, Perisic ve ark., GLT-1 promotörünün diferansiyel DNA metilasyon seviyelerinin, korteks ve beyincikteki glutamat taşıyıcısının diferansiyel ekspresyon seviyelerine aracılık ettiği sonucuna vararak, astrositik gen ekspresyonunun beyin bölgesine özgü modellerinin oluşturulmasında DNA metilasyonunda bir rol olduğunu vurguladı 11. Genel olarak, çok sayıda çalışma, çevre, ilaçlar ve yaralanmaların hepsinin DNA metilasyonunu ve sıklıkla gen ekspresyonunu 4,9 değiştirdiği gösterildiğinden, CNS'deki DNA metilasyonunun dinamik ve kararsız doğasının altını çizmektedir. Birlikte, bu nöroepigenetik çalışmalar, çeşitli CNS patolojilerini hafifletme potansiyeline sahip uygun bir terapötik hedef olarak DNA metilasyonuna işaret etmektedir.

Epigenetik alanı, DNA metilasyonunun nörogelişim ve hastalıktaki rolüne ilişkin anlayışını genişlettikçe, DNA metilasyonunu terapötik bir hedefe doğru hareket ettirmenin zorluğu, yalnızca korelasyon değil, aynı zamanda belirli gen hedeflerini ve bölgelerini tanımlayan nedensel çalışmalar gerçekleştirmektedir. Ek olarak, beyin bölgesine ve hücre tipine özgü DNA metilasyonundaki değişiklikleri araştırmak, nöroepigenetik alanına özgü, devam eden ve zamana değer bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu protokol, astrositlerin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS), metilasyona duyarlı yüksek çözünürlüklü eriyik analizi (MS-HRM) ve Kir4.1'i kodlayan bir gen olan KCNJ10'un DNA metilasyon durumunu araştırmak için bir metilasyon lusiferaz testi dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanır. Kir4.1, CNS 12-16'da hem beyin bölgesini hem de hücreye özgü ekspresyon modellerini gösteren glial spesifik bir potasyum kanalıdır. Kir4.1 ekspresyonu, rostraldan kaudal CNS bölgelerine doğru hareket ederek artar ve en yüksek ekspresyon omurilikte meydana gelir 15. Kanal ependimal hücrelerde, oligodendrositlerde ve bunların öncü hücrelerinde eksprese edilmesine rağmen, Kir4.1 ağırlıklı olarak astrositlerde eksprese edilir ve astrositik dinlenme membran potansiyelini hiperpolarize -80mV'ye ayarlayarak homeostatik potasyum seviyelerini korumak ve glutamat alımını desteklemek için gerekli olduğu düşünülmektedir 12,16-19. Daha da önemlisi, Kir4.1'in ekspresyonu hem gelişim sırasında hem de 20-25 CNS yaralanmasının çoklu formlarını takiben statik değildir. Bu kanalın epigenetik düzenlemesini, özellikle gelişim sırasında astrositlerde incelemek istedik. Kullanılan teknikler, KCNJ10 gen ekspresyonunun düzenlenmesinde DNA metilasyonunun rolü için nedensel kanıt sağlayan gene özgü ve hedeflenmiş CpG bölge analizleri sunar. Bu teknikler diğer genlere de uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvanlar Sağlık kurallar National Institutes uyarınca ele alındı. Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'nde Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi hayvan kullanımını onayladı.

1. Tüm Beyin Dokusu gelen Astrositler (FACS) Sıralama Floresan Aktif Hücre kullanarak Zenginleştirilmiş Astrositik Populasyonundan RNA ve DNA elde edilmesi

  1. 1 dakika boyunca CO2 ve daha sonra hızlı bir decapitate ile oturaklı bir hayvan. Albuquerque ve diğerleri içinde tarif edilen korteks teşrih 26.; Bu meninksleri kaldırmak için gerekli değildir.
    Not:. S100β altında eGFP (bir astrosit belirteci) promotör ifade transgenik fareler Itakura ve ark 27 tarafından üretilen ve astrositlerde FACS sıralama için kullanılmıştır.
  2. Üreticinin protokolüne göre, steril olmayan koşullarda papain ayrılma kiti kullanılarak tüm beyin homojenatı hazırlayın. 10 dakika boyunca bir su banyosunda 37 ° C 'de papain ısı aktive eder. Not:Papain çözüm üretici tarafından sağlanan ve L-sistein ve EDTA (Malzeme Tablo bakınız) içerir.
    1. Kesme veya boru 95,% O 2 taşıyan izin vermek için bir 50 mL konik tüp tepesi içine bir delik dremel:% 5 CO2 kapalı bir konik tüp içine beslenmeleri için (Şekil 1A). Ayrışma ortamı içeren 10 mm kültür kaplarına parçalara korteksleri yerleştirin (20 mM glikoz ve penisilin / streptomisin (500 U / ml) ile desteklenmiş ve% 95 O dengelenmiş MEM 2:% 5 CO2) ve 1 içine dokusunu inceltmek için temiz bir traş makinesi bıçak kullanımı x 1 mm 2 adettir.
  3. Papain çözeltisi içeren 50 ml konik tüp 10 ml manuel pipetman kullanarak doku transferi. Doku taşınan ayrışma ortamı miktarını en aza indirmek için boşaltmadan önce transfer pipeti altına yerleşmek için izin verin. % 95 O 2 dengelenmiş papain çözüm tutun:% 5 CO 2 inkübasyon süresi boyunca yüzey gaz alışverişi yoluyla. Değil kabarcık papain soluti yapınüzerinde. 37 ° C su banyosu içinde 20 dakika boyunca doku inkübe edin.
  4. Papain çözeltisi içinde İnkübasyonun ardından, çiğnemek dokusu yavaş bir hızda 10 ml transfer pipetle 10 kere. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin parçalı hücre süspansiyonu.
    1. Yüzey gaz değişimi ile (üretici tarafından sağlanan) DNase / albümin önleyicisi çözüm dengelenmesi ve DNaz / albümin, inhibitör çözeltisinin 3 ml pelet hücrelerin yeniden askıya. Üretici talimatları izleyerek ticari kesintili yoğunluk gradiyenti hazırlayın.
  5. 6 dakika boyunca 1.000 xg'de kesintili yoğunluk gradiyenti Spin. Bir pipet kullanılarak taban pelet emme tüpün tabanından ayrışmış hücrelerin izole edin.
  6. % 0.02 sığır serumu albümini ve 1 mg / ml DNase ve kültür ortamı tamponlu tercih HEPES DPBS 2-3 ml ayrışmış hücrelerin askıya Re. FACS (Şekil 2A) önce 40 um'lik bir filtreden geçirin. Sıralama kadar buz üzerinde hücreleri tutun.
    1. FACS 28 gerçekleştirin.
    2. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2000 x g'de 1,5 ml santrifüj tüplerine Pelet hücreleri.
      Not: Topak haline getirilen astrositler derhal kullanılan veya DNA ekstraksiyon kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
  7. RNA ve DNA izolasyon yöntemi tercih 29 30 kullanarak ayıklayın. Spektrofotometre ve Bioanalyzer 31 üzerinden RNA ve DNA konsantrasyonu ve kalitesini değerlendirmek.
    Not: sonraki adımlarda sadece yüksek kaliteli RNA ve DNA yararlanın, sırasıyla 260/280 = 2.0-2.2 ve 1.8-1.9. Bioanalyzer analizi RNA veya bozunma kaynaklı DNA fragmantasyonu için değerlendirilmesi esastır. RNA veya DNA, hemen kullanılabilir da -20 ° C, sırasıyla, daha sonraki çalışmalar için C ° -80 saklanabilir.

2. Metilasyona duyarlı Yüksek Çözünürlüklü eritin Analizi (MS-HRMA sayesinde) kullanarak bir Genin DNA Metilasyonu Durumu değerlendirilmesi

  1. Geninin herhangi bir CpG adaları tespit edilmesi tercih çevrimiçi metilasyon haritalama yazılımı içine ilgi konusu genin dizisinin girinilgi 32.
    1. Bisülfit karşı tasarımı Primerler DNA dizisini 33 dönüştürülür ve üreticinin protokolüne uygun olarak tercih edilen bir DNA polimerazı kullanılarak amplifiye. 45 dakika boyunca 100 V'de bir% 1 agaroz jeli bir DNA çalıştırarak güçlendirilmiş ürün boyutu kontrol edin. -20 ° C'de 20 uM stok konsantrasyonu mağazası primerler.
  2. Bisülfit aynı hayvan türlerinin 34 0-100% arasında değişen, her numune ve metillenmiş DNA standartları DNA 500-1000 ng dönüştürün. Elute numuneler 20 ng / ul konsantrasyon elde edildi. Spektrofotometre 31 üzerinden bisülfitle dönüştürülmüş DNA'nın konsantrasyonu doğrulayın.
  3. Tablo 1 ve 2'ye göre 5 uM konsantrasyonda tercih edilen bir DNA polimeraz ve primerler kullanılarak MS-İK amplifikasyonu için kurulum 20 ul reaksiyonlar., Üç kez FACS DNA ve metillenmiş standartlar dahil olmak üzere, tüm örnekler, çalıştırın.
  4. Analiz yazılımına bağlı olarak, önceden ayarlanmış ve başlangıç ​​ve parametreleri durdurmak sonrasıeriyik eğrisinin geçişleri etrafında. Set önceden eriyik başlangıç ​​ve ikisi arasındaki fark 0,2 yani pre-eritme durdurma parametreleri - 0.5 ° C. Post-eriyik başlangıç ​​ve post-eriyiği benzer durdurmak ayarlayın. Her numune için pik sıcaklık farkı verileri ayıklayın.
  5. Yüzde metilatlı standartları (y-değer) ve bunlara karşılık gelen ortalama pik sıcaklık farkları (x değeri) kullanarak lineer regresyon denklemini (Şekil 3A-B, Tablo 3-4) üretir. Bilinmeyen numunelerin 35 metilasyon durumunu tahmin etmek için bu lineer regresyon denklemini kullanın.

3. Lusiferaz Testi Kullanımı yoluyla Hyper-metillenmiş Promoter Etkinliği değerlendirilmesi

  1. Hedef genin (Adım 2.1) CpG adaları tanımlayın. PCR CpG-ada-luc2 plazmidler 37 üretmek için luc2 ateş böceği lusiferaz raportör geninin yukan çıkar 36 ve klon bölgelerin yükseltilmesi.
  2. Kısıtlaması ile CpG-ada-luc2 plazmidin 30 ug Linearizeenzim sindirimi 38. Kısıtlama sindirmek için siteleri doğrulayın ve tercih edilen kesici yazılımı 38 kullanılarak çift keser kaçının. Üreticinin protokolüne uygun olarak sindirimi takiben uygun sıcaklık ve sürede enzimleri ısı etkisiz hale getirirler. DNA Minimal kaybı doğrusallaştırma adımı sırasında oluşur.
  3. 30 ° C 'de CpG metilaz (M.Sssl) O / N ile veya aşağıdaki ayarlamalar haricinde işlenmemiş aşağıdaki üretici protokolü terk metilat linearize plazmidler.
  4. 50 ul reaksiyonları gerçekleştirin.
  5. Lineerleştirilmiş plazmid 700 ng metillenmesi için CpG metilaz 5 birimlerini kullanın.
  6. 13-19 saat boyunca tepkileri O / N çalıştırın.
  7. CpG metilaz reaksiyonundan sonra, ticari olarak temin edilebilen silis jel membran üreticinin protokolüne uygun kit temizlemek standardı kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. DNA'nın önemli kayıplar CpG metilaz reaksiyonu,% 30-60 kaybı takiben ortaya çıkar.
  8. Bir Hpa II kısıtlama sindirmek yoluyla Plazmidlerin metilasyon doğrulayın.
  9. Metillenmiş ya da olmayan metillenmiş DNA 1 ug al ve sınırlama, 37 ° C'de 1 saat boyunca Hpa II ile sindirmek. Her ug DNA için Hpa II 5-10 birimlerini kullanın. Hpa II sindirim ardından, tercih, ticari olarak mevcut silis jel membran temizlemek kiti kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. Görselleştirme için 45 dakika (Şekil 4B) süreyle, 100 V TAE veya çin TBE tamponu içinde bir% 1 agaroz jeli üzerinde, DNA hem de CpG metile olmayan metillenmiş plazmidler çalıştırın.
  10. Uygun kısıtlayıcı enzimlerle çift sindirim Konu hem metil ve metillenmemiş plazmidler tam uzunlukta luc 2 (vektör) ve CpG ada (insert) 38 fragmanları serbest bırakmak için. Üreticinin protokolüne uygun olarak yumuşatıldıktan sonra uygun sıcaklık ve ısı etkisizleştirilmiş enzimler çift sindirim O / N gerçekleştirin. DNA konsantrasyonu minimum kayıp çift kısıtlama sindirmek sırasında oluşur.
  11. O ayrılması için izin vermek için 1 saat boyunca 100 V'ta% 1 DNA agaroz jeli üzerinde iki sindirilmiş plazmidler başlatf vektörü ve takın (Şekil 4C). Dikkat. Koruyucu UV yüz siperi giyen, bantları görselleştirmek için bir masa siyah ışık DNA jel yerleştirin. Temiz cerrahi bıçak kullanarak boyutu, tüketim metile ve non-metile insert ve non-metile vektörü dayanarak.
  12. Doymuş fenol, pH'ı 6.6 kullanılarak jel ekstresi, DNA. Kısaca, vektör ve inserti ihtiva eden bir DNA jel tartın. DNA jel 0,1 gramı başına fenol 100 ul kullanabilir. Cam Dounce homojenleştirici kullanılarak fenol DNA jel homojenize edilir.
  13. Kloroform (fenol hacminin 1/5 kullanarak) ekleyin ve 20 saniye boyunca numune sallayın. 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 4 ° C'de maksimum hızda (16.1 x 1000 xg) 15 dakika boyunca santrifüj.
  14. Sulu çözeltinin çıkarın ve 3 M sodyum asetat ve etanol 2.5X hacminin 0.1x hacmi ekleyin. -80 ° C'de 1 saat süre ile inkübe edin. Bir kuluçkaya yatırmayı takiben, etanolü ortadan kaldırmak ve tercih edilen tampon 30 ul DNA yeniden askıya. DNA'nın önemli bir kayıp ekler ve vektörlerin aşağıdaki izolasyonunu oluşur% 30-50 loss.
  15. Yeniden bağlanması için metile olmayan metillenmiş uçlar T4 DNA ligazı kullanılarak 38 vektörü metillenmemiş. Ligasyon reaksiyonları için eklemek için vektörün 4 oranında bir 1: kullanın. Üretici talimatlarına göre Kurulum tepki. Reaksiyonları için 50 ul bir toplam hacim kullanma ve C ° veya buz kovası fazla kapaklı buz üzerinde -20 ° C'de O / N inkübe edin.
  16. Bağlanmasından sonra, tercih edilen, piyasada mevcut silika-jel membran temizlemek kiti kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. DNA'nın önemli bir kayıp ligasyonu reaksiyonu, DNA'nın yaklaşık% 30-50 kaybı takiben ortaya çıkar. 45 dakika boyunca 100 V'ta% 1 agaroz jeli üzerinde, DNA çalıştırarak yeniden ligasyonu doğrulamak ve yeniden lige plazmidler (Şekil 4D) konsantrasyonunu değerlendirmek.
  17. Imalatçının protokolüne göre, ticari bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak D54 hücreleri içine metile veya non-metillenmiş plazmidler transfekte. De bir 0.14 x 10 6 hücre / 12-yuvalı bir plaka uzerinde Tohum D54 hücreleri.
  18. 24 saat sonra, transfekte hücreler, wi(1) non-methyated CpG luc2 plazmid + Renilla veya başka bir kontrol lusiferaz vektörü ya da (2), metile edilmemiş CpG-luc2 plazmid + Renilla veya başka bir kontrol lusiferaz vektörü ya da inci eşit konsantrasyonlarda.
  19. Hücreler Çift Lusiferaz analiz yapılmadan önce 24 saat boyunca transfekte izin verin. Üretici talimatlarına göre tahlil gerçekleştirin. Bir luminometre kullanılarak okuma gerçekleştirin. Üç kopya halinde her bir okuyun.
  20. Renilla Firefly lusiferaz aktivitesinin oranının veya başka bir kontrol lusiferaz aktivitesi hesaplayın. Metillenmemiş Firefly kontrol lusiferaz aktivitesi: metillenmiş Firefly normalize kontrol lusiferaz aktivitesi olmayan metile lusiferaz aktivitesi ile metile lusiferaz aktivitesi bölünmesiyle

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrositlerde zenginleştirilmiş nüfus eGFP-S100β transgenik hayvanların 27 FACS sıralama yoluyla satın alındı. Nedeniyle p0-p40 yaşlı hücrelerin ve doğum sonrası gün 50 (p50) 'den daha büyük hayvanlardan izole edilen molekül moleküllerin, hayvanlar kalitesini düşüren bu tür deneyler için en uygun olan. Kortikal dokusu Bu deneyler için kullanılmıştır. Iki ila altı hayvandan korteks birlikte havuzlandı. FACS UAB Kapsamlı Sitometrisi Çekirdek tesisinde gerçekleştirildi. Sıralama Becton Dickinson FacsAria II üzer...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, zenginleştirilmiş bir astrosit popülasyonunun FACS yoluyla izolasyonunun yanı sıra DNA metilasyonu ve gen ekspresyonu arasında hem bağıntılı hem de nedensel çalışmalara izin veren çeşitli teknikleri açıklar. Tek başına veya kombinasyon halinde kullanılan bu teknikler, özellikle yüksek hücresel heterojenliğe sahip dokularla çalışan veya belirli bir genin veya gen bölgesinin DNA metilasyon durumuna karşı global DNA metilasyon değişiklikleriyle ilgilenen laboratuvarlar için yararlıdır. CNS'nin epigenomunu incel...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma R01NS075062-01A1 tarafından desteklenmiştir. UAB Kapsamlı Akış Sitometrisi Çekirdek tesisinde (P30 AR048311, P30 A1027767) gerçekleştirilen FACS sınıflandırması. UAB Nörobiyoloji Çekirdek tesisinden Dr. Scott Philips ve UAB CDIB'den Dr. Susan Nozell, lusiferaz testinin teknik yönlerine yardımcı oldu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Papain Ayrışma SistemiWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep DNA/RNA Mini KitiQiagen80204
Metil AstarCpGyerelleştirmek için Uygulamalı Biyosistemlerçevrimiçi
Zymo ResearchD5001
Sıçan Önceden Karıştırılmış Kalibrasyon StandardıEpiGenDx80-8060R-Premiks
CpG Metilaz (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAquick Jel Ekstraksiyonu QIagen28704Jel ekstraksiyonu ve DNA temizliği için kullanılır
Kısıtlama enzimleriNew England BioLabs
NEB kesiciNew England BioLabsçevrimiçikısıtlama özet sitelerini doğrulayın
Çift Luciferase Raportör Test SistemiPromegaE1910
Luc2 vektörü, pGL4.10PromegaE6651
renilla vektörü, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometreTurner Tasarımları
Lipofektamin LTX ve Artı ReaktifYaşam TeknolojileriA12621
Fenol, doymuş pH 6.6 / 6.9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000 / 2000c SpectrophtometerThermoScientific
MeltDoctor Master MixYaşam Teknolojileri4415440
Yüksek Çözünürlüklü Eriyik (HRM) Yazılımı v2.0Yaşam Teknolojileri4397808
AB SDS yazılımı v2.3Yaşam Teknolojileriçevrimiçi
AB Yüksek Çözünürlüklü Eritme Başlangıç Kılavuzu Yaşam Teknolojilerionline
AB 7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı SistemYaşam Teknolojileri
Adaları EZ DNA metilasyon Kiti yazılımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M. Intragenic DNA methylation alters chromatin structure and elongation efficiency in mammalian cells. Nat Struct. Mol Biol. 11 (11), 1068-1075 (2004).
  4. Moore, L. D., Le, T. DNA methylation and its basic function. Neuropsychopharmacol. 38, 23-38 (2013).
  5. Santos, K. F., Mazzola, T. N. The prima donna of epigenetics: the regulation of gene expression by DNA methylation. Braz.J.Med.Biol.Res. 38 (10), 1531-1541 (2005).
  6. Day, J. J., Sweatt, J. D. Cognitive neuroepigenetics: a role for epigenetic mechanisms in learning and memory. Neurobiol. Learn.Mem. 96, 2-12 (2011).
  7. Denk, F., McMahon, S. B. Chronic pain: emerging evidence for the involvement of epigenetics. Neuron. 73, 435-444 (2012).
  8. Endres, M., et al. DNA methyltransferase contributes to delayed ischemic brain injury. J. Neuroscience. 20 (9), 3175-3181 (2000).
  9. Qureshi, I. A., Mehler, M. F. Emerging role of epigenetics in stroke: part 1: DNA methylation and chromatin modifications. Arch.Neurol. 67, 1316-1322 (2010).
  10. Tian, R., et al. disease mutant glial fibrillary acidic protein compromises glutamate transport in astrocytes. J Neuropathol. Exp Neurol. 69, 335-345 (2010).
  11. Perisic, T., Holsboer, F., Rein, T. The CpG island shore of the GLT-1 gene acts as a methylation-sensitive enhancer. Glia. 60 (9), 1345-1355 (2012).
  12. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  13. Poopalasundaram, S., et al. Glial heterogeneity in expression of the inwardly rectifying K+ channel, Kir4.1, in adult rat CNS. Glia. 30, 362-372 (2000).
  14. Hibino, H., Fujita, A., Iwai, K., Yamada, M. Differential assembly of inwardly rectifying K+ channel subunits. Kir4.1 and Kir5.1, in brain astrocytes. 279, 44065-44073 (2004).
  15. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  16. Li, L., Head, V. Identification of an inward rectifier potassium channel gene expressed in mouse cortical astrocytes. Glia. 33, 57-71 (2001).
  17. Kucheryavykh, Y. V., et al. Downregulation of Kir4.1 inward rectifying potassium channel subunits by RNAi impairs potassium transfer and glutamate uptake by cultured cortical astrocytes. Glia. 55 (3), 274-281 (2007).
  18. Djukic, B., Casper, K. B., Philpot, B. D., Chin, L. S. Conditional knock-out of Kir4.1 leads to glial membrane depolarization, inhibition of potassium and glutamate uptake, and enhanced short-term synaptic potentiation. J. Neuroscience. 27, 11354-11365 (2007).
  19. Fujita, A., et al. Clustering of Kir4.1 at specialized compartments of the lateral membrane in ependymal cells of rat brain. Cell Tissue Res. 359 (2), 627-634 (2015).
  20. MacFarlane, S. N., Sontheimer, H. Electrophysiological changes that accompany reactive gliosis in vitro. J Neuroscience. 17 (19), 7316-7329 (1997).
  21. Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R. Impaired K(+) homeostasis and altered electrophysiological properties of post-traumatic hippocampal glia. J. Neuroscience. 19 (18), 8152-8162 (1999).
  22. Anderova, M., et al. Voltage-dependent potassium currents in hypertrophied rat astrocytes after a cortical stab wound. Glia. 48 (4), 311-326 (2004).
  23. Olsen, M. L., Campbell, S. C., McFerrin, M. B., Floyd, C. L. Spinal cord injury causes a wide-spread, persistent loss of Kir4.1 and glutamate transporter 1: benefit of 17 beta-oestradiol treatment. Brain. 133, 1013-1025 (2010).
  24. Koller, H., Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Time course of inwardly rectifying K(+) current reduction in glial cells surrounding ischemic brain lesions. Brain Res. 872, 1-2 (2000).
  25. Bordey, A., Lyons, S. A., Hablitz, J. J. Electrophysiological characteristics of reactive astrocytes in experimental cortical dysplasia. J Neurophysiol. 85 (4), 1719-1731 (2001).
  26. Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P. plating, and maintenance of cortical astrocyte cultures. 8, Cold Spring. 10-1101 (2009).
  27. Itakura, E., et al. Generation of transgenic rats expressing green fluorescent protein in S-100beta-producing pituitary folliculo-stellate cells and brain astrocytes. Endocrinology. 148, 1518-1523 (2007).
  28. Foo, L. C. Purification of astrocytes from transgenic rodents by fluorescence-activated cell sorting. Cold Spring Harb.Protoc. 2013, 551-560 (2013).
  29. Smith, C., Otto, P., Bitner, R. A silica membrane-based method for the isolation of genomic DNA from tissues and cultured cells. CSH. Protoc. 2006, 2006-201 (2006).
  30. Sambrook, J., Russell, D. W. A Single-step Method for the Simultaneous Preparation. of DNA, RNA, and Protein from Cells and. 1, 2006-201 (2006).
  31. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K. Quantitation of DNA and. , (2007).
  32. Zhao, Z., Han, L. CpG islands: algorithms and applications in methylation studies. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 643-645 (2009).
  33. Srivastava, G. P., Guo, J., Shi, H. PRIMEGENS-v2: genome-wide primer design for analyzing DNA methylation patterns of CpG islands. Bioinformatics. 24, 1837-1842 (2008).
  34. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J.Vis.Exp.(56), doi:3170 [pii];10.3791/3170. , (2011).
  35. Drummond, G. B., Vowler, S. L. Categorized or continuous? Strength of an association-and linear regression. Adv.Physiol Educ. 36, 89-92 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. The basic polymerase chain reaction. CSH.Protoc. 1, (2006).
  37. Arpa, P. Strategies for cloning PCR products. Cold Spring Harb.Protoc. 8, (2009).
  38. Makovets, S. Basic DNA electrophoresis in molecular cloning: a comprehensive guide for beginners. Methods Mol.Biol. 1054, 11-43 (2013).
  39. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neuroscience. 28, 264-278 (2008).
  40. Maldonado, P. P., Velez-Fort, M., Levavasseur, F. Oligodendrocyte precursor cells are accurate sensors of local K+ in mature gray matter. J Neuroscience. 33, 2432-2442 (2013).
  41. Kalsi, A. S., Greenwood, K., Wilkin, G. Kir4.1 expression by astrocytes and oligodendrocytes in CNS white matter: a developmental study in the rat optic nerve. J.Anat. 204, 475-485 (2004).
  42. Higashi, K., et al. An inwardly rectifying K(+) channel, Kir4.1, expressed in astrocytes surrounds synapses and blood vessels in brain. Am.J.Physiol Cell Physiol. 281 (3), (2001).
  43. Olsen, M. L., Higashimori, H., Campbell, S. L., Hablitz, J. J. Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes. Glia. 53 (5), 516-528 (2006).
  44. Neusch, C., Rozengurt, N., Jacobs, R. E., Lester, H. A. Kir4.1 Potassium Channel Subunit Is Crucial for Oligodendrocyte Development and In Vivo Myelination. J. Neuroscience. 21 (15), 5429-5438 (2001).
  45. Kofuji, P., et al. Genetic Inactivation of an Inwardly Rectifying Potassium Channel (Kir4.1 Subunit) in Mice: Phenotypic Impact in Retina. J. Neuroscience. 20 (15), 5733-5740 (2000).
  46. Kofuji, P., Connors, N. C. Molecular substrates of potassium spatial buffering in glial cells. Mol.Neurobiol. 28, 195-208 (2003).
  47. Nwaobi, S. E., Lin, E., Peramsetty, S. R. DNA methylation functions as a critical regulator of Kir4.1 expression during CNS development. Glia. 62 (3), 411-427 (2014).
  48. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high-resolution melting. Nat.Protoc. 3, 1903-1908 (2008).
  49. Wojdacz, T. K., Dobrovic, A. Methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM): a new approach for sensitive and high-throughput assessment of methylation. Nucleic Acids Res. 35, 10-1093 (2007).
  50. Laird, P. W. Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis. Nat.Rev.Genet. 11, 191-203 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA MethylationGene ExpressionAstrocyte IsolationFACS SortingMS HRMALuciferase AssayKCNJ10 PromoterTranscriptional ActivityMethylation Sensitive High Resolution Melt AnalysisCortical Astrocytes

Related Articles