Method Article

Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi KCNJ10 (Kir4.1)

DOI:

10.3791/52406

⸱

September 26th, 2015

 , 
1Department of Cell Developmental and Integrative Biology, University of Alabama at Birmingham

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA metilasyonu, çeşitli uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunda dinamik değişikliklere izin vermenin yanı sıra, gen ekspresyonunun stabil seviyelerini koruyabilir. DNA metilasyonundaki gene özgü değişikliklerin ve bu değişikliklerin gen ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine izin veren teknikleri detaylandırıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA metilasyonu, bir sitozin-guanin dinükleotidindeki bir sitozinin C5 pozisyonuna bir metil grubunun kovalent bağlanması yoluyla gen ekspresyonunu düzenlemeye hizmet eder. DNA metilasyonu, gen ekspresyonunda uzun süreli ve stabil değişiklikler sağlarken, DNA metilasyonunun kalıpları ve seviyeleri de çeşitli sinyallere ve uyaranlara bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, DNA metilasyonu, gen ekspresyonunun güçlü ve dinamik bir düzenleyicisi olarak işlev görür. Nöroepigenetik çalışması, DNA metilasyonunda hem küresel hem de gene özgü değişikliklerle ilişkili çeşitli fizyolojik ve patolojik durumları ortaya çıkarmıştır. Spesifik olarak, gen ekspresyonundaki değişiklikler ile DNA metilasyonu arasındaki çarpıcı korelasyonlar, nöropsikiyatrik ve nörodejeneratif bozukluklarda, sinaptik plastisite sırasında ve CNS hasarını takiben mevcuttur. Bununla birlikte, nöroepigenetik alanı, DNA metilasyonunun CNS fizyolojisindeki rolüne ilişkin anlayışını genişletmeye devam ettikçe, gen ekspresyonu ve DNA metilasyonundaki değişiklikler açısından nedensel ilişkilerin tanımlanması esastır. Ayrıca, daha geniş sinirbilim alanıyla ilgili olarak, geniş bölge ve hücreye özgü farklılıkların varlığı, transkriptom, proteom ve epigenomu incelerken bu farklılıkları ele alan teknikler gerektirir. Burada, hem RNA transkripsiyonunun hem de DNA metilasyonunun daha sonra incelenmesine izin veren kortikal astrositlerin FACS sıralamasını açıklıyoruz. Ayrıca, DNA metilasyonunu, metilasyona duyarlı yüksek çözünürlüklü eriyik analizini (MS-HRMA) ve ayrıca bir lusiferaz promotör testini incelemek için bir tekniği detaylandırıyoruz. Bu kombine tekniklerin kullanılmasıyla, yalnızca DNA metilasyonu ve gen ekspresyonu arasındaki korelasyon değişikliklerini keşfetmekle kalmaz, aynı zamanda belirli bir gen bölgesinin DNA metilasyon durumundaki değişikliklerin transkripsiyonel aktiviteyi etkilemek için yeterli olup olmadığını doğrudan değerlendirebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Epigenetik, genomun transkripsiyonel aktivitesini etkileyebilecek kimyasal modifikasyonların incelenmesidir. Esasen, DNA dizisinde bir değişiklik olmadan, DNA metilasyonu, histon asetilasyonu ve histon metilasyonu gibi epigenetik modifikasyonlar, gen ekspresyonu 1'in modellerini geri dönüşümlü olarak değiştirmek için yeterlidir. Gen ekspresyonunun güçlü bir düzenleyicisi olan DNA metilasyonu, en iyi karakterize edilen epigenetik modifikasyondur. DNA metilasyonu, metil gruplarının bir sitozinin C5 pozisyonu üzerinde, tipik olarak bir CpG bölgesi olarak da bilinen bir sitozin-guanin dinükleotidinin sitozininde kovalent bağlanmasıdır. Yüksek yoğunluklu CpG sit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvanlar Sağlık kurallar National Institutes uyarınca ele alındı. Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'nde Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi hayvan kullanımını onayladı.

1. Tüm Beyin Dokusu gelen Astrositler (FACS) Sıralama Floresan Aktif Hücre kullanarak Zenginleştirilmiş Astrositik Populasyonundan RNA ve DNA elde edilmesi

  1. 1 dakika boyunca CO2 ve daha sonra hızlı bir decapitate ile oturaklı bir hayvan. Albuquerque ve diğerleri içinde tarif edilen korteks teşrih 26.; Bu meninksleri kaldırmak için gerekli değildir.
    Not:. S100β altında eGFP (bir astrosi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Astrositlerde zenginleştirilmiş nüfus eGFP-S100β transgenik hayvanların 27 FACS sıralama yoluyla satın alındı. Nedeniyle p0-p40 yaşlı hücrelerin ve doğum sonrası gün 50 (p50) 'den daha büyük hayvanlardan izole edilen molekül moleküllerin, hayvanlar kalitesini düşüren bu tür deneyler için en uygun olan. Kortikal dokusu Bu deneyler için kullanılmıştır. Iki ila altı hayvandan korteks birlikte havuzlandı. FACS UAB Kapsamlı Sitometrisi Çekirdek tesisinde gerçekleştirildi. Sıralama Becton Dickinson FacsAria II üzer.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, zenginleştirilmiş bir astrosit popülasyonunun FACS yoluyla izolasyonunun yanı sıra DNA metilasyonu ve gen ekspresyonu arasında hem bağıntılı hem de nedensel çalışmalara izin veren çeşitli teknikleri açıklar. Tek başına veya kombinasyon halinde kullanılan bu teknikler, özellikle yüksek hücresel heterojenliğe sahip dokularla çalışan veya belirli bir genin veya gen bölgesinin DNA metilasyon durumuna karşı global DNA metilasyon değişiklikleriyle ilgilenen laboratuvarlar için yararlıdır. CNS'nin epigenomunu incel.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma R01NS075062-01A1 tarafından desteklenmiştir. UAB Kapsamlı Akış Sitometrisi Çekirdek tesisinde (P30 AR048311, P30 A1027767) gerçekleştirilen FACS sınıflandırması. UAB Nörobiyoloji Çekirdek tesisinden Dr. Scott Philips ve UAB CDIB'den Dr. Susan Nozell, lusiferaz testinin teknik yönlerine yardımcı oldu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Papain Ayrışma SistemiWorthington Biochemical CorporationLK003150
AllPrep DNA/RNA Mini KitiQiagen80204
Metil AstarCpGyerelleştirmek için Uygulamalı Biyosistemlerçevrimiçi
Zymo ResearchD5001
Sıçan Önceden Karıştırılmış Kalibrasyon StandardıEpiGenDx80-8060R-Premiks
CpG Metilaz (M.Sssl)Zymo ResearchE2010
QIAquick Jel Ekstraksiyonu QIagen28704Jel ekstraksiyonu ve DNA temizliği için kullanılır
Kısıtlama enzimleriNew England BioLabs
NEB kesiciNew England BioLabsçevrimiçikısıtlama özet sitelerini doğrulayın
Çift Luciferase Raportör Test SistemiPromegaE1910
Luc2 vektörü, pGL4.10PromegaE6651
renilla vektörü, pGL4.74PromegaE2241
TD-20/20 LuminometreTurner Tasarımları
Lipofektamin LTX ve Artı ReaktifYaşam TeknolojileriA12621
Fenol, doymuş pH 6.6 / 6.9Fisher ScientificBP 17501-100
Nanodrop 2000 / 2000c SpectrophtometerThermoScientific
MeltDoctor Master MixYaşam Teknolojileri4415440
Yüksek Çözünürlüklü Eriyik (HRM) Yazılımı v2.0Yaşam Teknolojileri4397808
AB SDS yazılımı v2.3Yaşam Teknolojileriçevrimiçi
AB Yüksek Çözünürlüklü Eritme Başlangıç Kılavuzu Yaşam Teknolojilerionline
AB 7900HT Hızlı Gerçek Zamanlı SistemYaşam Teknolojileri
Adaları EZ DNA metilasyon Kiti yazılımı

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bird, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev. 16 (1), 6-21 (2002).
  2. Deaton, A. M., Bird, A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 25, 1010-1022 (2011).
  3. Lorincz, M. C., Dickerson, D. R., Schmitt, M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA MethylationGene ExpressionAstrocyte IsolationFACS SortingMS HRMALuciferase AssayKCNJ10 PromoterTranscriptional ActivityMethylation Sensitive High Resolution Melt AnalysisCortical Astrocytes

Related Articles