Gen spesifik ifadesi ile DNA Methylation değişiklikler astrositik transkripsiyonel Aktivite ilişkilendirilmesi KCNJ10 (Kir4.1)

Epigenetik, genomun transkripsiyonel aktivitesini etkileyebilecek kimyasal modifikasyonların incelenmesidir. Esasen, DNA dizisinde bir değişiklik olmadan, DNA metilasyonu, histon asetilasyonu ve histon metilasyonu gibi epigenetik modifikasyonlar, gen ekspresyonu ^1'in modellerini geri dönüşümlü olarak değiştirmek için yeterlidir. Gen ekspresyonunun güçlü bir düzenleyicisi olan DNA metilasyonu, en iyi karakterize edilen epigenetik modifikasyondur. DNA metilasyonu, metil gruplarının bir sitozinin C5 pozisyonu üzerinde, tipik olarak bir CpG bölgesi olarak da bilinen bir sitozin-guanin dinükleotidinin sitozininde kovalent bağlanmasıdır. Yüksek yoğunluklu CpG siteleri içeren alanlar, CpG adaları (CGI'ler) olarak bilinir. CGI'lar sıklıkla transkripsiyonel başlangıç bölgeleri (TSS) ve gen promotörleri ^1-3 ile ilişkilidir. Bu nedenle, CGI'larda DNA metilasyonundaki değişiklikler her zaman hücresel ekspresyon veya fonksiyondaki değişikliklerle eşzamanlı olmasa da, CGI'lardaki DNA metilasyonundaki değişiklikler transkripsiyonel aktivite ² üzerinde güçlü bir düzenleme uygulayabilir.

Tarihsel olarak, DNA metilasyonunun embriyogenez, damgalama ve gelişimde gerekli olduğu gözlemlenmiştir, post-mitotik hücrelerde meydana gelen DNA metilasyon seviyelerinde çok az değişiklik olmuştur (kanserle ilişkili genlerdeki değişiklikler hariç) ^4,5. Bununla birlikte, nöroepigenetik alanı, DNA metilasyonu için önemli bir gelişimsel olmayan rolü vurgulamıştır. Spesifik olarak, bilişsel epigenetik, DNA metilasyonunu, öğrenme ve hafıza süreci için gerekli olan genlerin hem transkripsiyonel aktivasyonuna hem de baskılanmasına aracılık etmede ayrılmaz bir rol oynayan oldukça plastik bir mekanizma olarak yeniden tanımlamıştır ⁶. Bilişsel epigenetiğin yanı sıra, iskemik yaralanma ve nöropatik ağrıyı modelleyen çalışmalar, DNA metilasyonunu çeşitli CNS hakaretlerine hızla yanıt veren kararsız bir mekanizma olarak karakterize eder ^7-9. Astrositlerle ilgili olarak, birkaç kanıt dizisi DNA metilasyonunun astrogliogenezde önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Fan ve ark., nöral progenitör hücrelerde (NPC'ler) DNMT1'in koşullu KO'sunun, küresel bir hipometilasyon ^{durumu 10} ile uyumlu astrositlerin erken gelişmesine yol açtığını buldu. Ek olarak, Perisic ve ark., GLT-1 promotörünün diferansiyel DNA metilasyon seviyelerinin, korteks ve beyincikteki glutamat taşıyıcısının diferansiyel ekspresyon seviyelerine aracılık ettiği sonucuna vararak, astrositik gen ekspresyonunun beyin bölgesine özgü modellerinin oluşturulmasında DNA metilasyonunda bir rol olduğunu vurguladı ¹¹. Genel olarak, çok sayıda çalışma, çevre, ilaçlar ve yaralanmaların hepsinin DNA metilasyonunu ve sıklıkla gen ekspresyonunu ^4,9 değiştirdiği gösterildiğinden, CNS'deki DNA metilasyonunun dinamik ve kararsız doğasının altını çizmektedir. Birlikte, bu nöroepigenetik çalışmalar, çeşitli CNS patolojilerini hafifletme potansiyeline sahip uygun bir terapötik hedef olarak DNA metilasyonuna işaret etmektedir.

Epigenetik alanı, DNA metilasyonunun nörogelişim ve hastalıktaki rolüne ilişkin anlayışını genişlettikçe, DNA metilasyonunu terapötik bir hedefe doğru hareket ettirmenin zorluğu, yalnızca korelasyon değil, aynı zamanda belirli gen hedeflerini ve bölgelerini tanımlayan nedensel çalışmalar gerçekleştirmektedir. Ek olarak, beyin bölgesine ve hücre tipine özgü DNA metilasyonundaki değişiklikleri araştırmak, nöroepigenetik alanına özgü, devam eden ve zamana değer bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu protokol, astrositlerin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS), metilasyona duyarlı yüksek çözünürlüklü eriyik analizi (MS-HRM) ve Kir4.1'i kodlayan bir gen olan KCNJ10'un DNA metilasyon durumunu araştırmak için bir metilasyon lusiferaz testi dahil olmak üzere çeşitli teknikler kullanır. Kir4.1, CNS ^12-16'da hem beyin bölgesini hem de hücreye özgü ekspresyon modellerini gösteren glial spesifik bir potasyum kanalıdır. Kir4.1 ekspresyonu, rostraldan kaudal CNS bölgelerine doğru hareket ederek artar ve en yüksek ekspresyon omurilikte ^{meydana gelir 15}. Kanal ependimal hücrelerde, oligodendrositlerde ve bunların öncü hücrelerinde eksprese edilmesine rağmen, Kir4.1 ağırlıklı olarak astrositlerde eksprese edilir ve astrositik dinlenme membran potansiyelini hiperpolarize -80mV'ye ayarlayarak homeostatik potasyum seviyelerini korumak ve glutamat alımını desteklemek için gerekli olduğu düşünülmektedir ^12,16-19. Daha da önemlisi, Kir4.1'in ekspresyonu hem gelişim sırasında hem de ^20-25 CNS yaralanmasının çoklu formlarını takiben statik değildir. Bu kanalın epigenetik düzenlemesini, özellikle gelişim sırasında astrositlerde incelemek istedik. Kullanılan teknikler, KCNJ10 gen ekspresyonunun düzenlenmesinde DNA metilasyonunun rolü için nedensel kanıt sağlayan gene özgü ve hedeflenmiş CpG bölge analizleri sunar. Bu teknikler diğer genlere de uygulanabilir.

Tüm hayvanlar Sağlık kurallar National Institutes uyarınca ele alındı. Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'nde Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi hayvan kullanımını onayladı.

1. Tüm Beyin Dokusu gelen Astrositler (FACS) Sıralama Floresan Aktif Hücre kullanarak Zenginleştirilmiş Astrositik Populasyonundan RNA ve DNA elde edilmesi

1. 1 dakika boyunca _CO2 ve daha sonra hızlı bir decapitate ile oturaklı bir hayvan. Albuquerque ve diğerleri içinde tarif edilen korteks teşrih ^26.; Bu meninksleri kaldırmak için gerekli değildir.
   Not:. S100β altında eGFP (bir astrosit belirteci) promotör ifade transgenik fareler Itakura ve ark ²⁷ tarafından üretilen ve astrositlerde FACS sıralama için kullanılmıştır.
2. Üreticinin protokolüne göre, steril olmayan koşullarda papain ayrılma kiti kullanılarak tüm beyin homojenatı hazırlayın. 10 dakika boyunca bir su banyosunda 37 ° C 'de papain ısı aktive eder. Not:Papain çözüm üretici tarafından sağlanan ve L-sistein ve EDTA (Malzeme Tablo bakınız) içerir.
   1. Kesme veya boru 95,% O ₂ taşıyan izin vermek için bir 50 mL konik tüp tepesi içine bir delik dremel:% 5 _CO2 kapalı bir konik tüp içine beslenmeleri için (Şekil 1A). Ayrışma ortamı içeren 10 mm kültür kaplarına parçalara korteksleri yerleştirin (20 mM glikoz ve penisilin / streptomisin (500 U / ml) ile desteklenmiş ve% 95 O dengelenmiş MEM _2:% 5 _CO2) ve 1 içine dokusunu inceltmek için temiz bir traş makinesi bıçak kullanımı x 1 mm ² adettir.
3. Papain çözeltisi içeren 50 ml konik tüp 10 ml manuel pipetman kullanarak doku transferi. Doku taşınan ayrışma ortamı miktarını en aza indirmek için boşaltmadan önce transfer pipeti altına yerleşmek için izin verin. % 95 _O 2 dengelenmiş papain çözüm tutun:% 5 CO ₂ inkübasyon süresi boyunca yüzey gaz alışverişi yoluyla. Değil kabarcık papain soluti yapınüzerinde. 37 ° C su banyosu içinde 20 dakika boyunca doku inkübe edin.
4. Papain çözeltisi içinde İnkübasyonun ardından, çiğnemek dokusu yavaş bir hızda 10 ml transfer pipetle 10 kere. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin parçalı hücre süspansiyonu.
   1. Yüzey gaz değişimi ile (üretici tarafından sağlanan) DNase / albümin önleyicisi çözüm dengelenmesi ve DNaz / albümin, inhibitör çözeltisinin 3 ml pelet hücrelerin yeniden askıya. Üretici talimatları izleyerek ticari kesintili yoğunluk gradiyenti hazırlayın.
5. 6 dakika boyunca 1.000 xg'de kesintili yoğunluk gradiyenti Spin. Bir pipet kullanılarak taban pelet emme tüpün tabanından ayrışmış hücrelerin izole edin.
6. % 0.02 sığır serumu albümini ve 1 mg / ml DNase ve kültür ortamı tamponlu tercih HEPES DPBS 2-3 ml ayrışmış hücrelerin askıya Re. FACS (Şekil 2A) önce 40 um'lik bir filtreden geçirin. Sıralama kadar buz üzerinde hücreleri tutun.
   1. FACS ²⁸ gerçekleştirin. </ li>
   2. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 2000 x g'de 1,5 ml santrifüj tüplerine Pelet hücreleri.
      Not: Topak haline getirilen astrositler derhal kullanılan veya DNA ekstraksiyon kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
7. RNA ve DNA izolasyon yöntemi tercih ^{29 30} kullanarak ayıklayın. Spektrofotometre ve Bioanalyzer ³¹ üzerinden RNA ve DNA konsantrasyonu ve kalitesini değerlendirmek.
   Not: sonraki adımlarda sadece yüksek kaliteli RNA ve DNA yararlanın, sırasıyla 260/280 = 2.0-2.2 ve 1.8-1.9. Bioanalyzer analizi RNA veya bozunma kaynaklı DNA fragmantasyonu için değerlendirilmesi esastır. RNA veya DNA, hemen kullanılabilir da -20 ° C, sırasıyla, daha sonraki çalışmalar için C ° -80 saklanabilir.

2. Metilasyona duyarlı Yüksek Çözünürlüklü eritin Analizi (MS-HRMA sayesinde) kullanarak bir Genin DNA Metilasyonu Durumu değerlendirilmesi

1. Geninin herhangi bir CpG adaları tespit edilmesi tercih çevrimiçi metilasyon haritalama yazılımı içine ilgi konusu genin dizisinin girinilgi ^32.
   1. Bisülfit karşı tasarımı Primerler DNA dizisini ³³ dönüştürülür ve üreticinin protokolüne uygun olarak tercih edilen bir DNA polimerazı kullanılarak amplifiye. 45 dakika boyunca 100 V'de bir% 1 agaroz jeli bir DNA çalıştırarak güçlendirilmiş ürün boyutu kontrol edin. -20 ° C'de 20 uM stok konsantrasyonu mağazası primerler.
2. Bisülfit aynı hayvan türlerinin ³⁴ 0-100% arasında değişen, her numune ve metillenmiş DNA standartları DNA 500-1000 ng dönüştürün. Elute numuneler 20 ng / ul konsantrasyon elde edildi. Spektrofotometre ³¹ üzerinden bisülfitle dönüştürülmüş DNA'nın konsantrasyonu doğrulayın.
3. Tablo 1 ve 2'ye göre 5 uM konsantrasyonda tercih edilen bir DNA polimeraz ve primerler kullanılarak MS-İK amplifikasyonu için kurulum 20 ul reaksiyonlar., Üç kez FACS DNA ve metillenmiş standartlar dahil olmak üzere, tüm örnekler, çalıştırın.
4. Analiz yazılımına bağlı olarak, önceden ayarlanmış ve başlangıç ​​ve parametreleri durdurmak sonrasıeriyik eğrisinin geçişleri etrafında. Set önceden eriyik başlangıç ​​ve ikisi arasındaki fark 0,2 yani pre-eritme durdurma parametreleri - 0.5 ° C. Post-eriyik başlangıç ​​ve post-eriyiği benzer durdurmak ayarlayın. Her numune için pik sıcaklık farkı verileri ayıklayın.
5. Yüzde metilatlı standartları (y-değer) ve bunlara karşılık gelen ortalama pik sıcaklık farkları (x değeri) kullanarak lineer regresyon denklemini (Şekil 3A-B, Tablo 3-4) üretir. Bilinmeyen numunelerin ³⁵ metilasyon durumunu tahmin etmek için bu lineer regresyon denklemini kullanın.

3. Lusiferaz Testi Kullanımı yoluyla Hyper-metillenmiş Promoter Etkinliği değerlendirilmesi

1. Hedef genin (Adım 2.1) CpG adaları tanımlayın. PCR CpG-ada-luc2 plazmidler ³⁷ üretmek için luc2 ateş böceği lusiferaz raportör geninin yukan çıkar ³⁶ ve klon bölgelerin yükseltilmesi.
2. Kısıtlaması ile CpG-ada-luc2 plazmidin 30 ug Linearizeenzim sindirimi ^38. Kısıtlama sindirmek için siteleri doğrulayın ve tercih edilen kesici yazılımı ³⁸ kullanılarak çift keser kaçının. Üreticinin protokolüne uygun olarak sindirimi takiben uygun sıcaklık ve sürede enzimleri ısı etkisiz hale getirirler. DNA Minimal kaybı doğrusallaştırma adımı sırasında oluşur.
3. 30 ° C 'de CpG metilaz (M.Sssl) O / N ile veya aşağıdaki ayarlamalar haricinde işlenmemiş aşağıdaki üretici protokolü terk metilat linearize plazmidler.
4. 50 ul reaksiyonları gerçekleştirin.
5. Lineerleştirilmiş plazmid 700 ng metillenmesi için CpG metilaz 5 birimlerini kullanın.
6. 13-19 saat boyunca tepkileri O / N çalıştırın.
7. CpG metilaz reaksiyonundan sonra, ticari olarak temin edilebilen silis jel membran üreticinin protokolüne uygun kit temizlemek standardı kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. DNA'nın önemli kayıplar CpG metilaz reaksiyonu,% 30-60 kaybı takiben ortaya çıkar.
8. Bir Hpa II kısıtlama sindirmek yoluyla Plazmidlerin metilasyon doğrulayın. Metillenmiş ya da olmayan metillenmiş DNA 1 ug al ve sınırlama, 37 ° C'de 1 saat boyunca Hpa II ile sindirmek. Her ug DNA için Hpa II 5-10 birimlerini kullanın. Hpa II sindirim ardından, tercih, ticari olarak mevcut silis jel membran temizlemek kiti kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. Görselleştirme için 45 dakika (Şekil 4B) süreyle, 100 V TAE veya çin TBE tamponu içinde bir% 1 agaroz jeli üzerinde, DNA hem de CpG metile olmayan metillenmiş plazmidler çalıştırın.
9. Uygun kısıtlayıcı enzimlerle çift sindirim Konu hem metil ve metillenmemiş plazmidler tam uzunlukta luc 2 (vektör) ve CpG ada (insert) ³⁸ fragmanları serbest bırakmak için. Üreticinin protokolüne uygun olarak yumuşatıldıktan sonra uygun sıcaklık ve ısı etkisizleştirilmiş enzimler çift sindirim O / N gerçekleştirin. DNA konsantrasyonu minimum kayıp çift kısıtlama sindirmek sırasında oluşur.
10. O ayrılması için izin vermek için 1 saat boyunca 100 V'ta% 1 DNA agaroz jeli üzerinde iki sindirilmiş plazmidler başlatf vektörü ve takın (Şekil 4C). Dikkat. Koruyucu UV yüz siperi giyen, bantları görselleştirmek için bir masa siyah ışık DNA jel yerleştirin. Temiz cerrahi bıçak kullanarak boyutu, tüketim metile ve non-metile insert ve non-metile vektörü dayanarak.
11. Doymuş fenol, pH'ı 6.6 kullanılarak jel ekstresi, DNA. Kısaca, vektör ve inserti ihtiva eden bir DNA jel tartın. DNA jel 0,1 gramı başına fenol 100 ul kullanabilir. Cam Dounce homojenleştirici kullanılarak fenol DNA jel homojenize edilir.
12. Kloroform (fenol hacminin 1/5 kullanarak) ekleyin ve 20 saniye boyunca numune sallayın. 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 4 ° C'de maksimum hızda (16.1 x 1000 xg) 15 dakika boyunca santrifüj.
13. Sulu çözeltinin çıkarın ve 3 M sodyum asetat ve etanol 2.5X hacminin 0.1x hacmi ekleyin. -80 ° C'de 1 saat süre ile inkübe edin. Bir kuluçkaya yatırmayı takiben, etanolü ortadan kaldırmak ve tercih edilen tampon 30 ul DNA yeniden askıya. DNA'nın önemli bir kayıp ekler ve vektörlerin aşağıdaki izolasyonunu oluşur% 30-50 loss.
14. Yeniden bağlanması için metile olmayan metillenmiş uçlar T4 DNA ligazı kullanılarak ³⁸ vektörü metillenmemiş. Ligasyon reaksiyonları için eklemek için vektörün 4 oranında bir 1: kullanın. Üretici talimatlarına göre Kurulum tepki. Reaksiyonları için 50 ul bir toplam hacim kullanma ve C ° veya buz kovası fazla kapaklı buz üzerinde -20 ° C'de O / N inkübe edin.
15. Bağlanmasından sonra, tercih edilen, piyasada mevcut silika-jel membran temizlemek kiti kullanılarak DNA temizleme gerçekleştirmek. DNA'nın önemli bir kayıp ligasyonu reaksiyonu, DNA'nın yaklaşık% 30-50 kaybı takiben ortaya çıkar. 45 dakika boyunca 100 V'ta% 1 agaroz jeli üzerinde, DNA çalıştırarak yeniden ligasyonu doğrulamak ve yeniden lige plazmidler (Şekil 4D) konsantrasyonunu değerlendirmek.
16. Imalatçının protokolüne göre, ticari bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak D54 hücreleri içine metile veya non-metillenmiş plazmidler transfekte. De bir 0.14 x 10 ⁶ hücre / 12-yuvalı bir plaka uzerinde Tohum D54 hücreleri.
17. 24 saat sonra, transfekte hücreler, wi(1) non-methyated CpG luc2 plazmid + Renilla veya başka bir kontrol lusiferaz vektörü ya da (2), metile edilmemiş CpG-luc2 plazmid + Renilla veya başka bir kontrol lusiferaz vektörü ya da inci eşit konsantrasyonlarda.
18. Hücreler Çift Lusiferaz analiz yapılmadan önce 24 saat boyunca transfekte izin verin. Üretici talimatlarına göre tahlil gerçekleştirin. Bir luminometre kullanılarak okuma gerçekleştirin. Üç kopya halinde her bir okuyun.
19. Renilla Firefly lusiferaz aktivitesinin oranının veya başka bir kontrol lusiferaz aktivitesi hesaplayın. Metillenmemiş Firefly kontrol lusiferaz aktivitesi: metillenmiş Firefly normalize kontrol lusiferaz aktivitesi olmayan metile lusiferaz aktivitesi ile metile lusiferaz aktivitesi bölünmesiyle

Astrositlerde zenginleştirilmiş nüfus eGFP-S100β transgenik hayvanların 27 FACS sıralama yoluyla satın alındı. Nedeniyle p0-p40 yaşlı hücrelerin ve doğum sonrası gün 50 (p50) 'den daha büyük hayvanlardan izole edilen molekül moleküllerin, hayvanlar kalitesini düşüren bu tür deneyler için en uygun olan. Kortikal dokusu Bu deneyler için kullanılmıştır. Iki ila altı hayvandan korteks birlikte havuzlandı. FACS UAB Kapsamlı Sitometrisi Çekirdek tesisinde gerçekleştirildi. Sıralama Becton Dickinson FacsAria II üzerinde gerçekleştirilmiştir. eGFP eksitasyon 488 nm lazer kullanarak elde edildi; hiçbir tazminat gerekliydi. Bir kapı nüfus ileri ve yan dağılım (Şekil 1B) dayalı olarak hedeflenmiştir. Canlı hücre popülasyonu bir etidyum bromür ölü hücre göstergesi kullanılarak belirlendi (Şekil 1C) Geçitli. İki farklı popülasyonlar eGFP profili (Şekil 1D) göre tespit edilmiştir. Ampirik test yüksek eGFP ile hücre popülasyonunun yoluylaprofil eGFP pozitif hücre popülasyonu (Şekil 1F-F ') olarak tespit edilmiştir. Daha düşük eGFP profili ile ikinci nüfusun Görsel analiz olasılıkla astrositik süreçler (Şekil 1G-G ') enkaz temsilen eGFP ifade eden hücre parçaları ortaya, ama çekirdekleri yoksun. Ayrışma aşağıdaki ayrışmış eGFP pozitif astrositlerin Temsilcisi görüntüler, ancak (Şekil 2A) sıralama ve (Şekil 2B) gösterilmektedir sıralama sonra önce. İzole eGFP pozitif hücre popülasyonu ALDH1L1 mRNA, astrositik bir özgün bir işaret 39 (Şekil 2C) ve 40-kat bir artış olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, NG2 + OPC ve astrositler 39 S100β ortak ekspresyonu rağmen biz zenginleştirilmiş bir astrositik hücre popülasyonu (Şekil 2C-D) izolasyonuna gösteren NG2 mRNA 4 kat bir azalma, oligodendrosit öncü hücreler 39 için bir işaretleyici ile gözlendi. RNAve FACS izole edilmiş DNA astrositler daha sonra metilasyon çalışmalarında kullanılmak üzere yeterli kalite ve miktar vardı kriteri. Farklı yaş ve hayvan sayısı izole toplam RNA ve DNA FACS (Tablo 5), aşağıdaki molekül moleküllerin beklenen verimi için bir referans olarak yer almaktadır. Bu verimi de kullanılan hayvan sayısı, kuluçka dönemi ve araştırmacının deneyimine göre değişir unutulmamalıdır. Tablo 6 olayların değişkenlik kullanılan hayvanların ve kuluçka dönemleri sayısına bağlı olarak edinilen göstermektedir.

Metilasyon çalışmaları için, yüksek kalite ve DNA yeterli miktarda başlayarak başarılı bir alt uygulamalar için çok önemlidir. RNA ya da DNA ekstraksiyonu için doku yeterli parçalama sağlamak için doku veya hücrelerin homojenleştirme parçalama sırasında köpürmesini önlemek için dikkatli bir şekilde bir 23G iğne 7x ile ezilmiştir izledi. Bir kez yüksek kalitede DNA ayıklanır ve bisülfit dönüştürmek olduğunued, ilgi konusu bölgelerin MS-hrmA için hedef olabilir. Kalite ve bisülfitle dönüştürülmüş DNA konsantrasyonu değerlendirirken, spektrofotometre bisülfit Tek sarmal kollu DNA olduğu dönüştürülmüş olarak 33 OD faktörü okumak için ayarlanması gerektiğine dikkat ediniz. Bisülfitle dönüştürülmüş DNA 260/280 değerleri 2.20-2.70 arasında değişmektedir.

Metilasyon çalışmaları başlamadan önce, uygun bir şekilde seçmek ve MS-HRMA sayesinde çalışmalar için bir termal döngü kalibre etmek için kritiktir. Ayrıca, bir MS-hrmA üretilen ham verileri dışa ve kullanmak için nasıl belirlemeniz gerekir. Applied Biosystems Yüksek Çözünürlüklü Erime Kılavuzu 7900HT termal döngü kalibre yardım kullanılmıştır Başlarken. Son olarak, veri ayıklanır ve sonraki veri analizi için HRM analizi yazılımı ithal edildi. Protokolde ayrıntılı olarak öncesi ve sonrası başlangıç ​​ve parametreler eriyik eğrisinin geçişleri yakın kuruldu durdurun. Tepe sıcaklık farkları bilinmiyor sa metilasyon durumunu hesaplamak için kullanıldıörnek olarak şunlar verilebilir. MS-hrmA elde tahmini metilasyon verileri (piro veriler MS-İK primerleri ile aynı bölgelerini hedefleyen primerler kullanılarak evde oluşturulan) (Şekil 3C), 15, piro elde edilen metilasyon verilerine yakın karşılık geldi.

Çift Lusiferaz analiz oranı (Şekil 4A) geninin hiper-metillenmiş bölgelerin transkripsiyon aktivitesini değerlendirmek için kullanılmıştır. Her CpG-ada-luc2 plazmid doğrusallaştırılmış ve daha sonra metile oldu. Bununla birlikte, ek parçası (CpG ada) ve vektör (luc2) her iki reaksiyon esnasında metile edilir, çünkü, bir metile ekleme tüketim olması ve yeniden lige bir metillenmemiş vektörüne. Nedeniyle plazmid geniş manipülasyon, önemli kayıplar ortaya çıkar ve kimse yeterli başlangıç ​​malzemesi ile başlamalıdır. HpaII sindirim HpaII yalnızca metillenmemiş DNA (Şekil 4B) digests her plazmid metilasyon durumunu kontrol etmek için kullanılmıştır. Bu dikkat edilmelidirO / N metilasyon yetersiz ise, CpG metilaz ek SAM 1x ve 1 x 30 ° C'de inkübasyondan 1 saat, aşağıdaki ilave edilebilir. Ek SAM ve CpG metilaz ilave edildikten sonra O / N inkübasyon devam edin. Metil ve metıllenmemış CpG-ada-luc2 plazmidin Üretimi lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi ile, DNA metilasyon ve transkripsiyonel faaliyet arasındaki değişikliklerin doğrudan değerlendirilmesi için sağlar.

Şekil 1. FACS sıralama eGFP + hücre popoulation izole eder. Delik kesim 50 ml konik tüp (A) Kullanımı üst papain sindirim sırasında yüzey gaz değişimi için izin verir gör. (B) Sıralama hücreleri ileri ve yan dağılım araziler dayanarak kapı bulundu. (C) bir etidyum bromür göre, ölü hücre göstergesi kapısı için canlı hücre popülasyonu (kırmızı) kullanılmıştır. (D) Canlı celYüksek eGFP profili (yeşil) ve düşük eGFP profili (mor) ile bir - l nüfusu iki nüfusları gösterdi. Tüm grafikler için, y ekseni yan dağılım alanı (SSC-A) temsil eder; x-ekseni ön yan saçılma alanı (FSC-A), yeşil flüoresan proteini alanını (GFP-A) ya da etidyum bromid (EtBr) temsil eder. (EG) Ayrılan hücreler, Hoechst ile inkübe edildi ve ayrışmış hücreleri 20 ul lamel yerleştirilmiş ve görüntüsü alınmıştır. Kapsamlı süreçlerle (EE ') eGFP + astrositler, (NS) sıralamadan önce görüntülendi. Sıralama, yüksek eGFP + nüfus (POS) ardından (FF '') Hoechst boyama ile lokalize co eGFP + hücre soma göstermektedir. (GG '') Düşük eGFP nüfusu. Ihtimalle (tüm görüntüler için, ölçek = 20 mikron) astrositik enkaz temsil Hoechst boyama ile birlikte lokalize vermedi eGFP + boyama gösteriyor LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

EGFP-S100 β transgenik hayvanların sıralama Şekil 2. FACS astrositlerin zenginleştirilmiş popülasyonu sağlar. FACS (NS) önce ayrışmış hücreleri 20 ul gösterilir (A), işlemler gibi kalır (ölçek = 50 um). (B) Temsilcisi görüntü sonrası FACS (FACS) hücreleri gösterilir; astrositik süreçler kaldırıldı ve hücre soma kalıntıları (ölçek = 20 mikron) vardır. (C) qPCR verileri değil kriteri nüfus (NS) göre FACS hücreleri kriteri olarak ALDH1L1 mRNA'da 40 kat bir artış (FACS) göstermektedir. (D) NG2 mRNA FACS 4 kat azalır hücreler sıralanır nüfus (NS) ile karşılaştırıldığında sıralı. Için tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümünü görüntüleyin.

MS-HRM çalışmaları için Şekil 3. Örnek veri ve analiz. Metilasyon standartlarından oluşan sıcaklık farkı araziler (A) Örnek. Sorumlu yüzde metilasyon sıçan metillenmiş standartlara üretilen lineer regresyon denkleminin her eğri (B) Örnek etiketlenir. (Pyroseq, yeşil çubuklar) ve MS-hrmA (gri çubuklar) piro elde yüzde metilasyon (C) karşılaştırması KCNJ10 bölgeleri değiştiren metilasyon benzer düzeylerde gösterir. MS-insan kaynakları yönetimi aynı bölgelerini hedefleyen primerler kullanılarak evde oluşturulan piro verileri analizi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Her zaman ">:" keep-together.within-sayfa = fo "çadır
Şekil 4. Çift Lusiferaz analiz farklı olarak metillenmiş gen bölgelerin transkripsiyon aktivitesinin değerlendirilmesi için izin verir. (A) Diyagram lusiferaz transkripsiyonel aktivite deneyinin protokol iş akışını göstermektedir. HpaII sindirimin ardından metillenmemiş plazmidler karşısında metillenmiş (B) DNA jel görüntüler farklılıklar. Non-metillenmiş DNA kolaylıkla DNA plazmidi başarılı metilasyon gösteren metile edilmiş DNA ile karşılaştırıldığında HpaII sindirimin ardından sindirilmiştir. (C) DNA jel çift sindirim aşağıdaki Ovülden vektör ayrılmasını göstermektedir. DNA ayrılması, vektör ve insert ardından jel ayıklanır vardır. (D) DNA jel vektör ve ek parçanın başarılı bir şekilde yeniden bağlanmasını gösterir. Yeniden Bağlanmış plazmid içindeki bir moleküler ağırlığa muamele edilmemiş plasmid olarak (untx) sahiptir. NM, sigara araya geldihylated; M, metil; RL, yeniden lige; untx, tedavi edilmezse. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

.	Hacim (ul)	x3 +% 10 aşırı	Örneklerin x #
MeltDoc MM	10 ul	33 ul
Primer 1	1.2 ul	3.96 ul
Primer 2	1.2 ul	3.96 ul
gDNA	1 ul	---
DH 2 0	6.6 ul	21.78 ul

MeltDoctor Mastermix Tablo 1. hesaplama örneği. Her MS-HRM rea çalıştırın% 10 fazlası ile üç nüsha olarak ction pipetleme hatayı telafi etmek. Son sütun numunelerinin birden fazla numara için gerekli hesaplama gösterir. Her bir reaksiyon için toplam hacmi 20 ul'dir.

Döngü	Sıcaklık (° C)	Süresi (sn)	Rampa oranı (%)
	95 ° C	: 15	100
40x	95 ° C	: 15	100
	60 ° C	: 60	100
Erime parametreleri	95 ° C	: 10	100
	60 ° C	: 60	100
	95 ° C	: 15	1
	60 ° C	: 15	100
Tutmak	4 76 C

Tablo 2:. Amplifikasyonu için örnek protokolü eriyik eğrisinin amplifikasyonu ve kuşağın 40 döngü izledi 10 dakika boyunca 95 ° C 'de numuneler denatüre. Erime parametreleri tablo içinde listelenir. Yüksek çözünürlüklü erime sıcaklığının edinimi için izin veren rampa oranında değişiklik unutmayın.

Yüzde Metilasyon (sıçan Standardı)	Tepe sıcaklık farkı
y	x
0	5.670116
5	10,70448
10	15,5044
25	25,52295
50	34,43047
75	43,80894
100	53,88717

nt "zirve sıcaklık farkı verilerinin> Tablo 3. Örnek. Yüzde metilasyon standardı. Tepe sıcaklık farkı veri x koordinatı olarak etiketlendi. y koordinatı olarak etiketlenmiş Temsilcisi tepe sıcaklık farkı verileri tek gen bölgesi MS-HRM kullanılarak elde edilmiştir.

Tepe Sıcaklık Farkı	Tahmini metilasyon
X	Y
Örnek 1 (n = 4)
47,450	81,115
46,292	78,657
41,694	68,894
47,292	80,779
Örnek 2 (n = 4)
29,925	43,904
24,269	31,894
25,061	33,575
25,389	34,272

Tablo hesaplanan tahmini yüzdesi metilasyon 4. Örnek. Bilinmiyor metilasyon durumunun numunelerin tepe sıcaklık farkı, bir lineer regresyon denklemi kullanılarak, yüzde metilasyonu tahmin etmek için kullanılır. Iki farklı durumdaki, Örnek 1 ve Örnek 2 ile ilgili Örnek veriler gösterilir; n = her durum için 4.

Yaş	Hayvan sayısı	Toplam RNA (ng)	Toplam DNA, (ng)
p4-p10	3-6	455-868	265-1523
p19-p22	1-2	220-680	583-1483
p40-p50	3-4	198-260	578-1700

FACS alınan Tablo 5. Toplam RNA ve DNA hücrelerini sıralanır. Yaş ve hayvan sayısı FA kullanılanCS deneyleri listelenir. Not Her iki korteks her N. Toplam RNA için kullanılmıştır ve DNA beklenen verim için bir referans olarak listelenir.

Yaş	Hayvan sayısı	Pos Olaylar	Neg Olaylar	Kuluçka süresi (37 ° C'de),
p26	1	2.18X10 ^ 6	1.15X10 ^ 6	20:00 dak
p26	2	4.4X10 ^ 6	2.78X10 ^ 6	20:00 dak
p26	2	9.2x10 '^ 6	3.3X10 ^ 6	30:00 dak

Pozitif (+ eGFP) olaylar ve olumsuz olayların p26 sayısının ise doğum sonrası günde 26 FACS alınan olayların Tablo 6. sayısı kullanılan hayvanlar ve kuluçka dönemi sayısına bağlı olarak değişir.

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.