Yöntem makalesi

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

DOI:

10.3791/52421

⸱

19 Mart 2015

 , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bereketli tavuk yumurtaları, yüksek miktarda insan influenza A virüsü üretmek için yaygın olarak kullanılır, çünkü yüksek virüs verimini kanıtlamak için uygun ve uygun maliyetli bir sistem sağlarlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grip enfeksiyonu yaklaşık 36.000 ölüm ve Amerika Birleşik Devletleri'nde 200.000 'den fazla hastaneye yatış her yıl ile ilişkilidir. Mutasyon ve yeniden çeşitler nedeniyle yeni influenza virüs türlerinin sürekli ortaya çıkması virüsün kontrol komplike ve yeni ilaçların ve aşıların kalıcı geliştirilmesini gerekli kılmaktadır. Grip laboratuar tabanlı çalışma virüsün yayılması için güvenilir ve maliyet-etkin bir yöntem gerektirir. Burada, bir kapsamlı protokol sürekli olarak yüksek titre virüs stokları elde edilir verimli tavuk yumurta influenza A virüs yayılması için sağlanır. 11 gün - Kısaca, serum patojen içermeyen (SPF) döllenmiş tavuk yumurtası 37 ° C ve 10% 55-60 nemde bekletilir. Bu süre içinde, embriyo gelişimi kolaylıkla bir yumurta Candler kullanılarak izlenebilir. Virüs aşı, bir iğne ile allantoik oyuğuna virüs stokunun püskürtülmesiyle gerçekleştirilir. 37 ° C'de inkübasyon 2 gün sonra yumurta4 ° C'de en az 4 saat süre ile donduruldu. Hava kesesi ve chorioallantoic membran üzerinde yumurta kabuğu sonra dikkatlice açılır, ve virüs içeren allantoik sıvı hasat edilir. sıvı, santrifüj ile etrafı temizlenmiş alikotlandı ve uzun süreli depolama için -80 ° C'ye kadar aktarılır. büyük miktarda, genellikle, bu protokol ile elde edilir ve yüksek virüs titresi (bir virüs içeren yumurta başına sıvının 5-10 mi) büyük miktarlarda ihtiyaç in vitro çalışmalar için, özellikle, virüs preparatı eden uygun bir yöntem için yumurta kullanımını yapmıştır virüs içinde, aynı virüs stokunun yüksek dozlar gereklidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grip A insan sağlığı için büyük bir tehdit olmaya devam ediyor. Büyük bir küresel yük dünya çapında yılda 1 500.000 ölüme kadar neden olan bir yıkıcı solunum hastalığıdır. Grip virüsleri ailesi Orthomyxoviridae olup genomları 1,2, 8 negatif sens, tek iplikçikli RNA taşır. Viral genomun yüksek değişebilirlik (yani, antijenik "sürüklenme") uzun vadeli bağışıklık engeller. Ayrıca, grip, anti-viral ilaçlar 3 giderek dayanıklıdır.

2009 H1N1 pandemik influenza hastalığının (pandemik suşu anti-viral direnç, gecikmiş aşı üretimi) ile ilgili tüm zorlu konuları vurgulanır. Aşı formülasyonu büyük olasılıkla patojenik influenza suşları 4 (H1N1, H3N2 ve İnfluenza B için birer adet) için Dünya Sağlık Örgütü tarafından her yıl belirlenir. Bu yöntem tahmin grip suşu dayandığındans, patojen suşları bazen yanlış tespit ve aşı etkinliği önemli ölçüde düşer vardır. Ayrıca, yeni grip suşları görünümü pandemik hastalık 2 neden bu koruyucu programları aşmak olabilir.

evrensel grip aşısının oluşturulması 5 zor olmuştur. Bu nedenle, araştırma akciğer hasarının patogenezinde anlamak içine devam etmelidir. Tesis laboratuar araştırmaları için, çeşitli yöntemler viral izolasyon ve yayılma 6 geliştirilmiştir. İnsan grip virüsleri, memeli hücre çeşitli substratlar olarak amplifiye edilebilir. Bununla birlikte, büyük miktarlarda üretilmesi yüksek titre virüsleri iyi embriyo haline gelmiş yumurtalardan elde edilmektedir. Aşağıdaki protokol grip için mevcut virüs stoklarından bir virüs yayılımını ve depolama tekniğini açıklar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genel sözleri: NOT steril koşullar altında yumurta manipülasyonu ile ilgili tüm prosedürleri uygulayın ve steril tekniği buna göre kullanılmalıdır. % 70 etanol ile tüm ekipman kullanmadan önce ön-temiz. Genel olarak, influenza virüsü aşılama ve hasat BSL-2 laboratuvarda yapılmalıdır. Ancak, bu protokol yaymak için kullanıldığında çok daha patojenik grip virüsleri (örneğin, salgın ve pandemi öncesi suşları, kümes hayvanları ve hayvancılık, yüksek patojen kuş gribi suşları, 1918 H1N1 suşu için bir tehlike teşkil suşları), yüksek biyogüvenlik düzeyleri ve Bazı durumlarda, biyogüvenlik önlemleri ve izinler gereklidir. Yerel Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi grip virüsü ile ilgili tüm araştırmaları onaylaması gerekir.

Aşılama için Yumurta 1. Hazırlık

  1. Uygun bir satıcıdan serum patojen içermeyen (SPF) taze döllenmiş yumurta kuş edinin. Tipik haliyle, tavuk yumurtası kullanılır. Yumurta bizi olmalıhemen girişte ed.
  2. Otomatik yumurta turner ile nemlendirilmiş yumurta inkübatör varış yeri yumurta düzenli yumurta döndürmek için üzerine. Otomatik yumurta turner mevcut değilse, elle en az 2-3 kez bir gün (eldiven giymek ve mümkün olduğunca steril olarak her şeyi tutmak için emin olun) yumurta döndürün.
  3. 37 ° C ve 10-11 gün boyunca% 55-60 nemde kuluçkaya.

2. Yumurta Mum

  1. Inkübasyon yaklaşık 7 veya 8 gün sonra candling ile infertilite yumurta kontrol etmek için karanlık bir odada bir parlak ışığa karşı yumurta incelemek için bir yumurta Candler kullanın.
    1. % 70 etanol ile yumurta Candler silin. Genellikle eldiven değiştirme ve patojenlerin kontaminasyon riskini en aza indirmek için% 70 etanol ile dezenfekte edin.
    2. Inkübatör yumurta çıkarın ve boş yumurta kartonları koyun.
    3. Odada ışıkları kapatın.
    4. Candler karşı bir defada her yumurta bir büyük ucunu tutun.
    5. Determin için yumurta uyunE o bereketli ya infertil olup olmadığını.
      NOT: Bir fasulye şeklinde embriyo giden İnce kan damarları açıkça görünür olmalıdır. Döllenmemiş yumurta görünür yumurta sarısı ile küçük bir kan nokta olarak görünecektir.
  2. Döllenmemiş yumurta olan atın ve inkübatör canlı yumurta dönün. Fazla 30 dakika inkübatör dışında yumurta bırakmayın. Bir yumurtanın durumu teyit edilememesi halinde, bunu işaretleyin ve daha sonra gözlemlemek.

Virüs İnokulum 3. hazırlanması

  1. 10 mM HEPES (pH 7.4) ihtiva eden steril PBS içinde 10 4 pfu / ml - yaklaşık 10 ila 3 grip virüsü stokunu. Kritik adım: kullanımdan hemen önce virüs stokunu ve buz üzerinde her zaman seyreltilmiş virüs tutmak.

Alantoik Rota aracılığıyla 4. Grip Virüsü Aşılama

  1. Virüs inokülasyonundan (gün 10 ve 11) gün, daha yumurta mum ve herhangi bir ölü embriyolar ortadan kaldırır. Canlı embriyoların ayırtyumurta içinde hareket arıyor.
  2. Inkübatör üç yumurta çıkarın ve hava kesesi kadar ayrı bir tutucu yumurta düzenlemek.
  3. Kalıcı bir kalem ile yumurta hava sahasını işaretleyin.
  4. % 70 etanol ile hava alanı üzerinde eggshell yıkayın.
  5. Bir yumurta karton ve bir biyogüvenlik kaput (BSL-2) içine hava boşluğu yukarı yumurta koyun.
  6. Her bir yumurta hava torbasının hemen üzerinde bir kabuk içinde küçük bir delik açmak için bir steril 18G iğne kullanın. Embriyo veya sarısı bıçaklama önlemek için çok derinden iğne eklemek için dikkatli olun.
  7. Steril 1 ml şırınganın içine seyreltilmiş grip virüsü çizin ve bir 22G iğne takın.
  8. Dikkatle allantoik boşluğuna 45 ° açıyla iğne ile şırınga ilerlemek.
  9. Seyreltilmiş grip virüsünün 0.2 ml enjekte edilir.
  10. Diğer iki yumurta enjeksiyon tekrarlayın ve sonra şırınga ve iğne atın.
  11. Bir tutkal tabancası (ya da erimiş parafin mumu) den tutkal bir damla ile delik mühür. Be tutkal yumurta içinde sızıntı olmadığını dikkatli.
  12. Hava alanı yukarı çekti yumurta kuvöz içine yumurta geri yerleştirin.
  13. Tekrarlayın 4.2 adımları - 4.12 tüm yumurtaları aşılanmış kadar.

5. İnkübasyon Süresi

  1. 37 ° C'de ve •% 60 nemde açmadan enfekte yumurta inkübe edin.
  2. Grip virüsü tipine bağlı olarak optimum inkübasyon süresi seçin. 48 saat boyunca influenza A inkübe; 72 saat grip B ve C kuluçkaya yatmaktadır.

6. Grip Virüsü Hasat

  1. İnkübasyon süresinden sonra, embriyo öldürmek ve kan ile enfekte alantoik akışkan kontrol etme riskini azaltmak için kan damarları, 4 saat (ya da O / N), en az 4 ° C 'de yumurta soğutun. Verimi azaltır virüs, emici kırmızı kan hücrelerini engellemek için bunu yapın. Seçenek olarak ise, soğuk yumurta, 30 dakika boyunca -20 ° C 'de; Bununla birlikte, bu, kan kirlenme riskini arttırır.
  2. Yumurta yeterince soğutulmuş olmuştur sonra, bir biyogüvenlik kaput yumurta transferi. Hava kesesi yukarı bakacak şekilde bir firma tutucu içine yumurta yerleştirin. % 70 etanol ile yumurta yüzeyini temizleyin.
  3. Hava kesesi üzerindeki kabuğu açmak için steril makas kullanın. Koryoalantoik zar yok etmek değil dikkat ederek hava kesesi etrafında kabuk çıkarın.
  4. Steril künt forseps ile koryoalantoik zar açın. Yavaşça embriyo ve küçük bir spatula ya da kaşık ile yumurta sarısı kesesi kenara taşıyın. Sarısını yırtılmasına dikkat edin.
  5. 1 ml'lik bir Eppendorf pipet yardımıyla, allantoik akışkanın toplanması. Gerekirse, yan biraz kadar sıvı mümkün olduğunca toplamak için yumurta eğin.
  6. 50 ml'lik plastik konik tüp içine bütün yumurta, allantoik akışkanın birleştirin. Virüs hasat sırasında her zaman buz üzerinde tüpler tutun. Bir yumurta verimi 5 - hafif sarımsı bir sıvı 10 mi.
  7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'de virüs içeren alantoik akışkan Spin6, C yıkıntıları pelet haline getirildi. Yeni 50 ml tüp içine net sıvıyı aktarın buz tuttu. Bir BSL-2 atık kabına yumurta bertaraf edin.

7. Depolama

  1. Hemen allantoik açıklık sıvının (örneğin, 50, 100 veya 500 ul tümbölenler) bölmeyin ve ek-freeze sıvı azot içinde. Dondurulmuş virüs stokları, uzun süreli depolama için -80 ° C dondurucu transfer.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli yöntemlerle grip virüsü titre edilmesi için geliştirilmiştir. Uygun bir yöntem seçerek Bir göz bazı canlı viryonlarını değerlendirecek olan, ne olursa olsun başkalarının enfekte dayalı ise canlılığı (örneğin, hemaglutinin deneyi) toplam parçacıkları tespit olduğunu (örneğin, plak deneyi) 6. Burada, bir fare adapte influenza virüsü (A / PR / 8/34) ile aşılanır tavuk yumurtalarından elde alantoik akışkan viral titresi plak deneyi (Şekil 1) ve hemaglüsinasyon tahlilinde...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grip hastalığının büyük bir küresel yük olur, ve iş akciğer hasarı 7 patogenezi anlayış içine devam ediyor. Bu ölümcül hastalık kolaylaştırdı araştırma, çeşitli yöntemler grip virüsü 6 yaymak için geliştirilmiştir. Burada, biz tavuk yumurtası influenza virüsü üretmek için bir tekniği açıklar. Bu yöntemin avantajı, yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu ve çoğu zaman, in vitro çalışmalar için gerekli olan yüksek titre grip virüsü hisse senetleri, büyük miktarlarda elde edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH hibe HL120947 (PC), HL103868 (PC) ve Amerikan Kalp Derneği Yardım Hibesi (PC) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)Cellgro 21-040-CV
serum patojen içermeyen (SPF) döllenmiş tavuk yumurtası VALO BioMedia
nemlendirilmiş yumurta kuluçka makinesi ÇİFTLİK yenilikçileriModel 2100
otomatik yumurta çeviriciÇİFTLİK iNNOVATORSModel 3200
yumurta mumcusuÇİFTLİK iNNOVATORSModel 3300 
1 ml şırıngaBD Bioscience309659
18G iğneBD Bioscience305196
20G / 22G iğneBD Bioscience305176 / 305156
HEPESSigma-AldrichH3375
Etanol>%99,5Sigma-Aldrich459844tabancası kullanılarak %70'e kadar seyreltilmiş
"Ad tech Hi Temp Project Pro"Ad tech, Yapıştırıcı Teknolojileri A.Ş.Model 1105
tutkal "Reklam teknolojisi MINI SIZE, Multi Temp"Reklam teknolojisi, Yapıştırıcı Teknolojileri, Inc.220-34ZIP30
MDCK hücreleriATCCCRL-2935
Yıkanmış Havuzlanmış Hindi Kırmızı Kan Hücreleri,% 10Lampire Biyolojik Laboratuvarları724908
su tutkalı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
  2. Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
  3. Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
  4. Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
  5. Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
  6. Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , Wiley. (2006).
  7. Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
  8. Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
  9. Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
  10. Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tavuk Yumurtas nok lasyonuAllantoik Kese EnjeksiyonuVir s Titresinin BelirlenmesiPlak Analizi Y ntemiHemagl tinin AnaliziYumurta Kandilleme Tekni iSerum Patojenlerinden Ar nd r lm YumurtalarAllantoik S v HasadS v Azot Depolamas

İlgili makaleler