Yöntem makalesi

İşitsel Yolu ve optogenetic Stimülasyon için Murin Dorsal Koklear Çekirdek Doğrudan Görselleştirme

DOI:

10.3791/52426

⸱

20 Ocak 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otology and Laryngology, Harvard Medical School, 2Department of Communication Sciences and Disorders, Worcester State University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, bir murin modelinde dorsal koklear çekirdeğe doğrudan erişim sağlamak için cerrahi bir yaklaşımın ana hatlarını çizmektir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutuklama veya işitme kaybı ters virüs aracılı gen transferi kullanımı soruşturma büyük ölçüde çevresel işitme sisteminin küme olmuştur. Birkaç çalışma, merkezi işitme sistemine gen transferi inceledik. işitsel yolun ikinci dereceden nöronları içeren beyin sapı dorsal koklear nükleus (DCN), gen transferi için potansiyel bir sitedir. Bu protokol, posterior fossa yaklaşımı ile kemirgen DCN doğrudan ve maksimal maruz kalma bir tekniktir gösterilmiştir. Bu yaklaşım, akut ya da hayatta kalma cerrahi sağlar. DCN doğrudan görselleştirme sonra, deney bir ana bilgisayar, bir mavi ışık lazer bağlanmış bir fiber optik ile koklear nükleus ve daha sonra stimülasyon içine opsins püskürtülmesi de dahil olmak üzere uygulanabilir. Böyle elektrik stimülasyonu ve nöral enjektör iz gibi diğer nörofizyoloji deneyler de mümkün bulunmaktadır. Visualiza düzeyiyon ve uyarılma süresi elde deneyler geniş bu yaklaşım uygulanamaz hale.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşitme kaybını tersine çevirmek için virüs aracılı gen transferi, büyük ölçüde periferik işitme sistemine odaklanmıştır. 1 Kokleayı hedef alan araştırmacılar, ozmotik mini pompa infüzyonu2, vektör-transgen kompleksine batırılmış Jel Köpük®2 veya jelatin sünger3, doğrudan mikroenjeksiyon4 dahil olmak üzere bir dizi dağıtım yolunu incelediler; adeno ile ilişkili viral vektörler5,6, lentiviral vektörler7 ve katyonik lipozomlar2 dahil olmak üzere çok sayıda gen transfer vektörü; ve gen transfer vektörlerinin hedef dokunun ötesine yayılması2. Son zamanlarda, adeno-ilişkili virüs (AAV)-1, veziküler glutamat taşıyıcı-3 kaybına bağlı farelerde sağırlığı tedavi etmek için kokleaya dahil edilmiştir. 8 Ayrıca, optogenetiğin periferik işitsel sistemde uygulanması yakın zamanda tanımlanmıştır. 9

Bununla birlikte, çok az sayıda çalışma, merkezi işitme sistemine gen transferini incelemiştir. Beyin sapının dorsal koklear çekirdeği (DCN), işitsel yolun ikinci dereceden nöronlarını içerir. Koklear çekirdekteki (CN) gen transfer teknikleri bir dizi araştırma için kullanılabilirken, opsinlerin, ışığa duyarlı proteinlerin DCN'ye gen transferi de optogenetik tabanlı deneysel teknikleri mümkün kılmak için kullanılabilir. Lovarhodopsin-2 (ChR2) gibi bir opsinin virüs aracılı gen transferi iletimini takiben, DCN'nin nöronları ışık uyaranlarına duyarlı hale gelir. Optogenetik gen transferi daha önce sıçan retrotrapezoid çekirdeği, fare lokusu coeruleus, maymun superior colliculus ve fare ventral tegmental alanı dahil olmak üzere çeşitli beyin sapı bölgelerinde denenmiştir. 10-14 yaş arası

Son zamanlarda, araştırmacılar DCN'de optogenetik kullanımını incelediler. 15,16 DCN, insanlarda işitsel beyin sapı implantlarının yerleştirildiği yerdir ve bu da onu işitsel nöroprotezler üzerine translasyonel çalışmalar için çalışmak için işitsel sistemin çekici bir parçası haline getirir. Bununla birlikte, DCN'nin konumu göz önüne alındığında, cerrahi maruziyet zordur. Burada açıklanan teknik, bir fare modelinde viral vektör gen transferini ve optogenetik tabanlı deneyleri mümkün kılmak için posterior fossa yaklaşımı yoluyla DCN'nin maksimum maruziyeti için bir protokol sağlar. Önceki çalışmalarda channelrhodopsin-2 ile DCN'ye stereotaktik mikroenjeksiyon kullanılmıştır. 16 Bununla birlikte, stereotaksik enjeksiyonlar, özellikle DCN kadar beyin sapı boyunca küçük ve derin bir çekirdekte, doğrudan görselleştirme yoluyla yapılan enjeksiyonlardan potansiyel olarak daha az doğrudur. CN'de dokuya özgü proteinleri eksprese eden transgenik fareler de çekici bir seçenektir ve gen transferi ihtiyacını ortadan kaldırır. DCN'ye maruz kalma protokolümüz, DCN'nin optik stimülasyon için doğrudan maruz kalması gerekeceğinden, transgenik farelerde de işe yarayacaktır. DCN'nin cerrahi maruziyeti için bu teknik, farelerde ve sıçan modellerinde işitme siniri ve koklear çekirdekten kayıtları içeren önceki protokollerden uyarlanmıştır. 15,17-20

Protokolün genel amacı, gen transfer tekniklerine izin vermek için CN'ye doğrudan maruz kalma sağlamaktır. Daha spesifik olarak, yaklaşım hem akut hem de sağkalım cerrahisi ile uyumludur ve hazırlık, sonraki nörofizyolojik testler için aynı hayvanda tekrarlanabilir. DCN protokolünün doğrudan maruz kalması, beyin sapının diğer çekirdeklerinde optogenetik ve virüs aracılı gen transferine dayalı deneyler için etkilere sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bütün deneysel prosedürler Halk Sağlığı Servisi İnsanca Bakım Politikası ve laboratuvar Hayvanların Kullanımı, dahil olmak üzere ulusal hayvan bakımı yönergeleri izleyin Massachusetts Göz Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Kulak Revir ve Harvard Tıp Okulu, uygun yapılmaktadır Ilar Kılavuzu ve Hayvan Refahı Yasası. Deneysel işlemler sol DCN detay maruz aşağıda listelenen. Sağkalım ameliyat yaparken steril aletler kullanın.

1. İlköğretim Kraniyotomi ve Dorsal Cochlear Nucleus Pozlama

  1. Anestezi
    1. Bir intraperitonal uygulama yoluyla ksilazin 20 mg / kg ve ketamin 100 mg / kg ile 18-24 g ağırlığında 8-12 haftalık, yaşlı bir fare, anestezisi. Izleme kalp hızı, solunum hızı, yanı sıra ayak tutam çekilme refleksi ile uygun anestezi onaylayın. Gözleri yerleştirin veteriner merhem anestezi altında iken kuruluğu önlemek için. Bir kez yeterli anestezi altında, tıraş saç örten tO cerrahi siteye engelsiz erişim sağlamak için kafa derisi.
  2. Cerrahi konumlandırma
    1. Bir burun kelepçe ile yerinde tutulan küçük bir hayvan steryotaksik tutucu, güvenli bir şekilde fare yerleştirin.
    2. Burun kelepçe tamamen fare kafasını hareketsiz yeterli solunum ama yeterince sıkı sağlamak için yeterli gevşek olduğundan emin olun. Fare kafası gevşek ise, hayvan prosedürünün kraniotomi bölümü sırasında baş yuvasından dışarı düşmesi muhtemeldir.
    3. Kalp hızı izleme sağlar standart moda, işitsel beyinsapı implantı elektrotları yerleştirin. Solunum hızı görselleştirme tarafından takip edilmelidir. Normal kalp hızı ve solunum hızı fare yaşına bağlı olarak değişecektir unutmayın.
    4. Bir homotermik ısıtma battaniye yerleştirme yoluyla bir termometre yerleştirilir ve euthermia sağlanır.
  3. Cilt kesi ve kafatası interparietal ve oksipital kemikler maruz
    1. Bir Microsc altındaope, deri yoluyla dikey kesi doğrudan kepçesi arasında, orta hatta başlayan ve oksiputa kaudal kısmına uzanan yapmak. Orta hat cilt kesi ardından, yanal cildi yerinden. Kafatasının sol arka yönünü kapsayan kasları gözünüzde canlandırın.
    2. Bir neşter veya iris makas ile kendi kemiklere, kas ekleri dezartikülasyon ile kas sol parietal, interparietal örten ve kafatasının oksipital kemikleri çıkarın. Kesme kas kenarları boyunca kanama küçük bir derecede dikkat edin. 10-15 saniye için bir pamuk uçlu bir aplikatör ile hafif basınç ile bu en aza indirin.
  4. Kranyotomi üstteki Cochlear Nucleus
    1. Sagital ve lambda sütür hatları (Şekil 1, Sol Panel) dahil olmak üzere ilgili dikiş hatları, tanımlayın.
    2. Rongeurs kullanarak, lambda dikiş hattına orta hat sol interparietal kemik üzerinde opera, ~ 2 mm kaudal yapmak. Bu bölge DCN üzerler.
    3. Following kraniotomi, beyincik üzerinde uzanan dura ince bir tabaka gözlemlemek. Bir neşter bıçak kullanarak, dura çıkarın. (Şekil 1, Orta Panel).
      Not: dura çıkarılması kanama küçük olmasına neden olabilir. Dura kaldırmak için neşter bıçak kullanarak Bu süreç beyin yüzeyinin ve DCN ve karanlık tanımlanmasına havuz olacak beyincik aspirasyon sırasında kan kaybı miktarını azaltmak için tasarlanmıştır. Fare toplam kan hacmi% 15 daha> ~ 1.5 ml geçmemelidir değildir. Kanama, bu miktarı aşarsa, fare sıvı takviyesi ile birlikte sağlanmalıdır.
    4. Pamuk uçlu aplikatör ile beyincik kaplayan pıhtılaşmış kan çıkarın. İsteğe bağlı olarak, yavaşça kan kanı temizlemek için beyincik üzerine bir diş noktası kullanarak tuzlu damla.
  5. Serebellar Aspirasyon
    1. DCN karşısında olduğu kadar 5 Fransız emme kullanarak, DCN örten sol beyincik lateral-en bölümünü aspireual (Şekil 1, Sağ Panel). Sol beyincik yaklaşık 1/4 1/3 çıkarın. DCN bitişik ana dönüm superior semisirküler kanalın ampulla olduğunu.
      NOT: beyincik Aspirasyon protokolünün önemli bir adımdır. O kanamaya neden olur, bu gibi emme birden paslar ile bir tek denemede oluşur ve eğer beyinciğin Yönetmen aspirasyon en başarılı yapılır. Aspirasyon yardımcı olmak için, beyincik yüzeyine biraz uzak olacak CN, beklenen derinlikte mikroskop odak düzlemi ayarlanır. CN odak düzlemi ayarlanması görselleştirme geliştirmek ve keskin bir görüntü sağlayacaktır.
    2. DCN aşağıdaki aspirasyon, daha kanama, beyin omurilik sıvısı (BOS) birikmesi ve beyincik deplasman bekleniyor. Kan pıhtılaşmasını önlemek için hızla Kraniotomi içine steril serum fizyolojik 0.5 cc aşılamak. Bir diş alanına ve emme ile hafifçe vurma bir kombinasyonu daha sonra olabilirDCN doğrudan görüntülenmesi için bir yol temizlemek için kullanılır. Doğrudan DCN yüzeyine temas etmeyin.

Virüs-aracılı Gen Transferi ve Cerrahi Kurtarma 2. Basınç Mikroenjeksiyon

  1. DCN örten kan ve CSF serbest olan ve net bir şekilde görülebilir sonra, 2 dakikalık bir süre boyunca, 10 ul Hamilton şırıngası kullanılarak DCN içine basınç microinjections olun.
  2. Ucu artık DCN yüzeyinin altında görünür oluncaya kadar bir micromanipulator ile iğne tanıtın.
  3. En iyi performans için, künt travma en aza indirmek ve bir ince DCN içinde enjeksiyon hacmi, lokalize, 45 ° olarak, sığ konik böyle bir 33 veya 34 gauge iğne (34 gauge iğne ile bir gaz geçirmez şırınga kullanın) kullanın ve sığ beyin yapısı (<300 mikron kalınlığında).
    NOT: Diğer mikroenjeksiyon aletleri kullanılan dayalı olabilir. İdeal olarak, enjeksiyon enstrüman bazı hafif ben izin vermek için esnek olmalıdırd eğer doğrudan DCN hedef için gerekli. Fare nedeniyle solunum prosedür boyunca hafifçe hareket gibi Ayrıca, enstrüman hareketinin küçük miktarlarda dayanacak kadar sağlam olmalıdır.

3. Cerrahi Kurtarma

  1. Hemen ardından enjeksiyon, cilt yeniden yaklaştığı ve fare standart kurtarma prosedürüne göre kurtarmak için izin verir. Kalan beyincik ve skar dokusu beyincik aspirasyonu nedeniyle boşluğunda dolduracaktır. Yeterli bilinç sternum yatma korumak için sağlanıncaya kadar sürekli hayvanları izlemek. Kalp hızı, solunum sayısı, hem de besleme becerisi izleyin.
    NOT: Tamamen iyileşene kadar hiçbir hayvan ameliyatı geçirmiş diğer hayvanlarla bir kafese geri döner.
  2. Bir fare operasyon sonrası çevrelerinde yürümeye başlarsa büyük olasılıkla zor bir zaman besleme olurdu gibi (

4. İkincil Kraniyotomi ve Cochlear Nucleus Pozlama

  1. Şifa ve virüs aracılı gen transferi inkübasyon 2-4 hafta sonra, önceden enjekte fare ve adımı tekrarlayın 1,1-1,5 Optimal inkübasyon süresi aktarılan genin tipine göre değişir yeniden uyutmak.
  2. Cımbız, neşter ve rongeurs bir kombinasyonu ile Kraniotomi sitesi üzerinden skar dokusu çıkarın.
  3. Kraniotomiye görselleştirmek sonra, DCN örten beyincik ve skar dokusu kalan bir arada tanımlamak. Örten beyincik / (önceki serebellar aspirasyon benzer) skar dokusu aspire 5 Fransız emiş kullanın.
  4. Aspirasyon ardından, daha kanama, BOS b bekliyoruzuild-up ve beyincik kalan bitleri. Hızla kan pıhtılaşmasını önlemek için Kraniotomi içine tuzlu tanıtmak. DCN doğrudan görselleştirme yolunu temizlemek için yumuşak diş nokta dabbing ve emme bir arada kullanın.
  5. DCN yüzeyini gözlemlemek. DCN artık erişilebilir olduğu gibi Optogenetik-tabanlı fizyolojisi deneyleri. Bir Optogenetik tabanlı deney sürmek için, bir fiber optik (Şekil 2), örneğin, hafif bir uyarıcı, tanıtılması.

5. Histoloji

  1. Deneylerin sonucu takiben, ketamin dozu ile fare euthanize. % 4 paraformaldehid tarafından takip normal tuzlu su ile fare serpmek.
  2. 2 saat kafatası ve post-fix gelen beyin sapı ayıklayın. 24-48 saat süreyle% 30 sukroz içinde beyin sapı cryoprotect. Bölüm 60 mikron bölümleri kullanarak standart bir kriyostat kullanarak beyin sapı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kısmi Serebellar Aspirasyon Koklear Nucleus Erişim gösterir

Kafatası örten deri ve kas gibi koronal ve lamda sütür hatları gibi, kafatası yüzey işaretlerini, kaldırıldıktan sonra, Kraniotomi yaklaşık lokalizasyonu göstermektedir. Rongeurs ile kraniyotomi ardından, beyincik görüntülenmiştir. Serebellumun küçük bir kısmı dikkatlice aspire enjekte edilebilir CN, (Şekil 1) görselleştirme gösterir.

Mavi Işık Lazer ile Uyarım için ikincil ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu kağıt, merkezi işitme sisteminin manipülasyonu için fare modelinde DCN doğrudan görselleştirme tekniği anlatılmaktadır. Doğrudan görselleştirme özetlenen yaklaşım stereotaksik yaklaşımlar ana alternatif üzerinde önemli avantajlar sağlar. Stereotaksik yaklaşımlar doğrudan görselleştirme göze değil oysa Öncelikle, DCN doğrudan görselleştirme, beyin sapı sitenin hemen onay veriyor. Virüs-aracılı gen transferi durumunda olduğu gibi, inkübasyon sürelerini uzun süreli gerektirecek deneylerde, enjeksiyon hedef konumu "...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansman: Bu çalışma Vakfı Bertarelli hibe (DJL), bir MED-EL hibe (DJL) ve Sağlık Hibeler DC01089 bir National Institutes (MCB) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Stereotaksik tutucuStoelting51500
Homeotermik battaniyeHarvard507214
Neşter bıçağı #11İnce Cerrahi Aletler10011-00
İris makasİnce Cerrahi Aletler14084-08
5 Fransız emmeSimetri Cerrahi2777914
Diş Noktaları Henry Schein100-8170
Kemik rongeurİnce Cerrahi Aletler16020-14
10 & mikro; l Hamilton şırıngaHamilton 7633-01
34 ölçü, iğneHamilton 
Rongeursİnce Cerrahi Aletler16021-14
207434

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lalwani, A., Mhatre, A. Cochlear gene therapy. Ear Hear. 24 (4), 342-348 (2003).
  2. Lalwani, A., Jero, J., Mhatre, A. Current issues in cochlear gene transfer. Audiol Neurootol. 7 (3), 146-151 (2002).
  3. Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
  4. Koh, S., Pettis, R., Mhatre, A., Lalwani, A. Cochlear microinjection and its effects upon auditory function in the guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
  5. Lalwani, A., Walsh, B., Reilly, P., Muzyczka, N., Mhatre, A. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
  6. Wareing, M., Lalwani, A. Cochlear gene therapy: current perspectives. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 5 Suppl 1. (49), 27-30 (1999).
  7. Han, J., et al. Transgene expression in the guinea pig cochlea mediated by a lentivirus-derived gene transfer vector. Hum Gene Ther. 10 (11), 1867-1873 (1999).
  8. Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
  9. Hernandez, V. H., et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124 (3), 1114-1129 (2014).
  10. Adamantidis, A., et al. Optogenetic interrogation of dopaminergic modulation of the multiple phases of reward-seeking behavior. J Neurosci. 30 (31), 10829-10835 (2011).
  11. Kim, K., et al. Optogenetic mimicry of the transient activation of dopamine neurons by natural reward is sufficient for operant reinforcement. PloS One. 7 (4), e33612(2012).
  12. Britt, J., Bonci, A. Optogenetic interrogations of the neural circuits underlying addiction. Curr Opin Neurobiol. 23 (4), 539-545 (2013).
  13. Abbott, S., Coates, M., Stornetta, R., Guyenet, P. Optogenetic stimulation of c1 and retrotrapezoid nucleus neurons causes sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats. Hypertension. 61 (4), 835-841 (2013).
  14. Carter, M., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
  15. Darrow, K., et al. Optogenetic control of central auditory neurons. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. (695), (2012).
  16. Shimano, T., et al. Assessment of the AAV-mediated expression of channelrhodopsin-2 and halorhodopsin in brainstem neurons mediating auditory signaling. Brain Res. 1511, 138-152 (2013).
  17. Doucet, J., Ryugo, D. Projections from the ventral cochlear nucleus to the dorsal cochlear nucleus in rats. J Comp Neurol. 385, 245-264 (1997).
  18. Brown, M., Drottar, M., Benson, T., Darrow, K. Commissural axons of the mouse cochlear nucleus. J Comp Neurol. 521, 1683-1696 (2013).
  19. Verma, R., et al. Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus. Hear Res. 310, 69-75 (2014).
  20. Taberner, A. M., Liberman, M. C. Response properties of single auditory nerve fibers in the mouse. J Neurophysiol. 93 (1), 557-569 (2005).
  21. Rolls, A., et al. Optogenetic disruption of sleep continuity impairs memory consolidation. Proc Natl Acad Sci. 108 (32), 13305-13310 (2011).
  22. Huff, M., Miller, R., Deisseroth, K., Moorman, D., LaLumiere, R. Posttraining optogenetic manipulations of basolateral amygdala activity modulate consolidation of inhibitory avoidance memory in rats. Proc Natl Acad Sci. 110 (9), 3597-3602 (2013).
  23. Stortkuhl, K., Fiala, A. The Smell of Blue Light: A New Approach toward Understanding an Olfactory Neuronal Network. Front Neurosci. 5 (72), (2011).
  24. Hira, R., et al. Transcranial optogenetic stimulation for functional mapping of the motor cortex. J Neurosci Methods. 179 (2), 258-263 (2009).
  25. Ayling, O., Harrison, T., Boyd, J., Foroshkov, A., Murphy, T. Automated light-based mapping of motor cortex by photoactivation of channelrhodopsin-2 transgenic mice. Nat Methods. 6 (3), 219-224 (2009).
  26. Boyden, E., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Vir s Arac l Gen TransferiKraniyotomi Tekni iSerebellar AspirasyonOptik Fiber Stim lasyonuMavi I k Lazeriitsel Beyinsap Yan tMikroenjeksiyon Tekni i

İlgili makaleler