Yöntem makalesi

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi

10.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/52437

⸱

11 Eylül 2016

 , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Burada, Buffalo Green Monkey böbrek hücresi hattını kullanarak toplam kültürlenebilir virüsleri ölçmek için bir prosedür sunuyoruz. Prosedür, çevresel ve içme sularında bulaşıcı virüslerin oluşumunu ölçmek için standartlaştırılmış bir araç sağlar.

Özet

Çevre ve içme sularında virüs oluşumu ile ilgili ulusal çalışmalarda birden fazla analitik laboratuvar kullanıldığında standartlaştırılmış bir yöntem gereklidir. ABD Çevre Koruma Ajansı'nın (USEPA) Yöntem 1615, bu sulardaki Enterovirüs ve Norovirüsü ölçmek için böyle bir standart sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. Virüs, elektropozitif bir filtre kullanılarak sudan konsantre edilir, sığır özü ile filtre yüzeyinden ayrıştırılır ve daha sonra organik flokülasyon kullanılarak daha fazla konsantre edilir. Burada, filtre elüsyonu, ikincil konsantrasyon ve toplam kültürlenebilir virüslerin ölçümü için Yöntem 1615'in protokolünü sunuyoruz. Her numuneden elde edilen konsantre elüatın bir kısmı, Buffalo Green Monkey böbrek hücrelerinin on kopya şişesine aşılanır. Sitopatik etkiler gösteren şişelerin sayısı, litre başına en olası enfeksiyöz birim sayısını (MPN) ölçmek için kullanılır. Yöntem, veri kalitesini artırmak ve laboratuvarlar arası ve laboratuvar içi varyasyonu azaltmak için bir dizi kalite kontrolü kullanır. Laboratuvarlar tanımlanmış performans standartlarını karşılamalıdır. Yöntem 1615, Sabin poliovirüsü tip 3 ile tohumlanmış reaktif dereceli ve yeraltı sularından virüs geri kazanımı incelenerek değerlendirildi. Toplam kültürlenebilir tahlil ile ortalama poliovirüs geri kazanımları, reaktif dereceli sularda %111 ve yeraltı sularında %58 idi.

Giriş

Enterik virüsler insan bağırsak sistemi bulaştırmak ve fekal-oral yolla bulaşan virüsler bir gruptur. Bu virüsler atık su arıtma tesisi ve fosseptik atıkları, yanlış tasarlanmış veya kırık septik tanklar, kırık kanalizasyon hatları, kombine kanalizasyon taşmaları ve diğer noktası ve noktasal olmayan kaynaklardan 1-4 ile yüzey ve yeraltı sularını girin. su bazlı virüslere karşı insan enfeksiyonları ve hastalık kontamine veya yetersiz dezenfekte su tüketimi yoluyla ya da eğlence su temas yoluyla meydana gelir. Hastalık belirtileri şiddetli gastroenterit hafif içerebilir; konjunktivit; ateş; Üst solunum sıkıntısı; el, ayak ve ağız hastalığı; miyokardit; aseptik menenjit; ensefalit; felç; sepsis 5-8 ve ölüm 9,10.

USEPA Yöntem 1615 çevresel ve içme sularında bulaşıcı enterik virüs parçacıkları ölçmek için bir yordam sağlar. Bu sular içerebilirbulaşıcı ve bulaşıcı olmayan virionlar karışımı, ancak bulaşıcı parçacıklar potansiyel sağlık tehlikesi oluşturmaktadır. Bulaşıcı virüs parçacıkları nedeniyle 11-13 mevcut olabilecek herhangi bir dezenfektan protein kapsid bütünlüğü nedeniyle UV ışığı radyasyon ve hasara nükleik asitlere HASARDAN çevre içme sularında zaman enfeksiyon kaybeder. yöntem temin toplam kültürlenebilir virüs prosedürü Buffalo Green Monkey türü maymun böbrek (BGM) hücre hattına sitopatik etkiler (CPE) üretimine dayanır. Bu hücre hattı tespit bulaşıcı bir virüs türlerinin aralığı belli enterovirüsler 15 öncelikle kısıtlı olsa bile, çünkü çevre viroloji alanında 14,15 yılında yaygın kullanımı seçildi. Bu çalışmanın amacı, beş inçlik electropositive kartuş filtreler elüsyon, ikincil konsantrasyon ve toplam Yetiştirilebilen virüslerin ölçümü için Yöntemi 1615 prosedürlerini tarif etmektir. bir değerlendirmeGenel olarak yöntem, Cashdollar ve ark., 16 tarif edilmiştir.

Protokol

NOT: tanımların listesi için ek malzemeler bölüm S1 bakın. USEPA Yöntem 1615 ile ilişkili QA prosedürleri ek malzemeler bölümünde S2 açıklanmıştır.

1. Filtre Elüsyon Prosedürü

  1. Birinci akıtmada
    1. tamponlu% 1.5 sığır özü, pH 9.0, 500 ml yerleştirin dereceli bir silindire, oda sıcaklığına kadar ılıtıldı. Filtre kartuşu konut açın ve tamamen elektropozitif filtreyi kapsayacak şekilde sığır özü yeterli miktarda ekleyin. Filtre gövdesi kapağını değiştirin ve steril bir behere kalan sığır özü dökün.
    2. temas süresi 1 dakika sonra, bir basınç kabı veya peristaltik pompa kullanılarak yavaş yavaş filtre ile steril bir beherde kalan birlikte gövde sığır özü solüsyonu geçirir. 2 L'lik bir cam kabın içine eluat toplayın.
  2. İkinci elüsyon
    1. Tekrarlayın tamponlu% 1.5 sığır özü ilave 500 ml kullanılarak 1.1 AdımlarıAncak 15 dakika Adım 1.1.2 de temas süresini artırır.
    2. Birinci akıtmada o ihtiva eden 2 L'lik bir kap, ikinci elüsyon sığır eti ekstresi ekleyin. behere steril bir karıştırma çubuğu ilave edin.

2. Organik Flokülasyonu Konsantrasyon Prosedürü

  1. en az 5 dakika boyunca 0,525% sodyum hipoklorit ile kombinasyonu tipi pH elektrodu sterilize edin. Steril dH 2 O ile elektrot durulayın ve sonra 0.05 M sodyum tiyosülfat ile dechlorinate. pH 4 ve 7 standartlarını kullanarak pH metre kalibre.
  2. bir heyecan plaka üzerinde eluatın içeren behere koyun. plaka açın ve bir girdap oluşana kadar karıştırma hızını artırmak.
  3. yavaş yavaş eluata 1.2 M HCl damla damla ilave edilerek 3.5 ± 0.1 eluat pH ayarlayın. Hızlı ekleme virüsü inaktive çünkü HCI damla damla ekleyin. Bir çökelti oluşmaya başlar Bu süre boyunca elüat parçalı hale gelir.
  4. Karıştırma spe azaltmakDaha sonra yavaş karışmasına Ed ve 30 dakika için oda sıcaklığında 3.5 ± 0.1 de eluat pH'sini izlenmesi ve bakımı ve devam eder.
  5. 4 ° C'de 2,500 x g'de 15 dakika boyunca çökelen sığır özü bir veya daha fazla santrifüj şişelerine süspansiyon ve santrifüj dökün. santrifüj ve her iki aspirat şişeleri kaldırmak veya yavaş topak haline çökelti kaybını önlemek için süpernatant süzün. süpernatant atın.
    NOT: çökelti miktarı ve kalitesi sığır özü sürü arasında önemli farklılıklar olabilir. Diğer birçok o güçlükle erirken bazı sürü üretilen çökelti hızla eriyecektir.
  6. çökeltiyi ihtiva eden bir santrfuj şişesine 0.15 M sodyum fosfat, 30 ml ekleyin.
    1. 0.15 M sodyum fosfat, 5 dakika içinde çözülür sığır özü partiden çökeltiler için pH 9.0 kullanın. Çökelti tamamen eritilir sonra 10 dakika süre ile karıştırılır ve daha sonra 2.7 aşamasından hemen gidin.
    2. Diğer tüm çökeltiler için 0.15 M sodyum fosfat, pH 7.0-7.5 kullanın. , Ya da daha zor çökeltiler erimesi için 10-15 dakika karıştırın orbital bir karıştırıcı üzerinde 160 rpm'de çalkalanarak çökelti, bir pipet ile karıştırılır sırasında tekrar tekrar yukarı ve aşağı çözeltisi çizerek, steril bir spatula ile ayırmak, veya bu prosedürlerin bir kombinasyonu ile.
      Not: birden fazla santrifüj şişesi kullanırken, sodyum fosfat az 30 ml kullanılarak çökeltiler birleştirmek ve daha sonra, bir şişe ya da kap içine çökeltiler birleştirildikten sonra şişe durulama 30 ml geri kalan kısmı kullanır.
    3. Birleştirilen çökelti düz tabanlı bir santrfuj şişesine ise, şişeye bir karıştırma çubuğu ilave edin. 2.6.5 Adım gidin.
    4. Birleştirilen Çökelti konik bir tabana sahip bir santrfuj şişesine ise, küçük bir cam beher içine aktarın ve beher bir karıştırma çubuğu ilave edin.
    5. Bir manyetik karıştırıcı üzerine şişe veya behere koyun ve pr kadar karıştırınecipitate tamamen çözülene.
    6. 0.525% sodyum hipoklorit ile bir kombinasyon tipi pH elektrodu yeniden sterilize ve Aşama 2.1'de tarif edildiği gibi 0.05 M sodyum tiyosülfat ile dechlorinate. pH 7 ve 10 standartlar kullanılarak pH metre kalibre. Yavaş yavaş 1 M NaOH ile 9.0'a tamamen çözünmüş çökelti pH oranını ayarlamak ve daha sonra 10 dakika boyunca karıştırılmıştır.
  7. karıştırma çubuğu çıkarın ve 4,000-10,000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca çözülmüştür çökelti santrifüj.
  8. Dikkatlice pelet bozmadan bir cam behere süpernatant dökün. beher bir karıştırma çubuğu ekleyin ve pelet atın.
  9. Bir manyetik karıştırıcı üzerine behere koyun ve çözüm karıştırın. 7,0-7,5 pH ayarlamak için akıllıca 1.2 M HCI damla ekleyin.
  10. Filtre% 1.5 sığır özü, 15 ml, 0.05 M glisin, pH 7.0-7.5 ile önceden tedavi edilmiş bir ön filtre ihtiva eden bir sterilizasyon filtresi yardımıyla geçirilerek süpernatant sterilize edin.
  11. Deney Örnek Volume (S) hesaplamaları:
    1. Kullanım Denklem 1, Lab Müstahkem Boş ve Boş Lab reaktifi dışındaki tüm test numuneleri için S hesaplamak için
      figure-protocol-1 denklem 1
      D (Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi) Yeraltı 500 L olduğu, TSV (Toplam Örneklem Hacmi) laboratuvar tarafından alınan 5-inç elektropozitif kartuş filtreden geçirilir alan numune hacmi ve FCSV (Final Konsantre Örnek Hacmi) Adım 2.10 filtrasyon aşağıdaki birimdir. Bir örnek tamamlayıcı malzemeler Bölüm S4.1 gösterilmiştir.
    2. Ve Boş Lab Reaktif (LRB; yani reaktif dereceli su kullanarak negatif kalite kontrol) 0.3 ile FCSV çarpılarak; Blank Lab Müstahkem (yani seribaşı reaktif dereceli su kullanılarak bir pozitif kalite kontrol LFB) için S hesaplayın.
  12. thre içine FCSV BölE alınan örnekler.
    1. 1.04 kat Testi Örnek Hacmi eşit bir hacmi ile alınan örnekler 1 ve 2 hazırlayın. ; Veya altında -70 ° C, toplam kültürlenebilir virüs tahlili (alt örnek 1, Adım 4) kullanılarak analiz veya 24 saat içinde (gösterilmemiştir) moleküler deneyleri için işlenemez eğer bu Alt-numûnelerin Freeze aksi halde, 4 ° C'de tutun.
    2. veya altında kalan hacmi (alt örnek 3) Freeze -70 ° C.
  13. 10 ile S bölerek Aşı Volume hesaplayın.

3. Toplam kültürlenebilir virüs Quantal Deneyi

NOT: Tüm adımlar her zaman hücre tek tabaka rahatsız etmemek için dikkatli bir şekilde çözüm eklemek için.

  1. Durusu veya 3-6 gün sonra bölme de BGM hücrelerinin bir tek tabaka içeren test gemilerden aspirat medya ve sonra kaldırılır medyaya eşit dengeli tuz çözeltisi hacmi ekleyin.
  2. Durusu veya hücre kültürü te gelen dengeli tuz çözeltisi aspirest gemiler kullanılan ve daha sonra hücre kültürü testi damarları aşılamak olan
    1. Toplam kültürlenebilir virüs quantal tahlil kontrolleri (ek malzemeler bölüm S2.4) ile birlikte Aşı Cilt eşit alt örnek 1 hacminde her test numunesi için 10 test damarları aşılamak.
    2. (LFSM, yani, tohumlanmış sulu ortam örneği) LFB ve Lab Kuvvetlendirilmiş Örnek matris için bir seyreltici olarak alt örnek 3 ve 0.15 M sodyum fosfat, pH 7.0-7.5 kullanılarak 5-, 25- ve 125-kat seyreltiler hazırlanır. seyreltileri yapmak için bir yöntem örneği, ek malzemeler bölümü S3 verilmiştir. Aşama 3.2.1 içinde seyreltilmemiş alt örnek 1 ile aşılanmış kaplara ek olarak, her bir test kabına bir inokülüm hacimde kullanılarak her bir inceltilmiş serileri için 10 yıkanmıştır hücre kültür testi damarları inoküle.
    3. inkübasyon 14 gün sonra 10 tekrarlı CPE vardır (Adım 3.2.2 aşılandı dışındaki) Adım 3.2.1 herhangi bir test örneği için, önceden (Adım 3.3)alt örnek 3. 5-, 25- ve 125- ve 625-kat seyreltme pare inoküle 10 toplam kültürlenebilir virüs quantal yeni bir dizi ile birlikte her bir test gemide bir Aşı Volume kullanarak her seyreltme serisi için hücre kültürü testi gemileri yıkanır tahlil kontrolleri (ek malzemeler bölüm S2.4).
    4. ileri ve geri damarları eğerek hücre mono tabakaları yüzeyi üzerinde inokulum dağıtın. 1-5 titreşimler / dakika ya da mevcut olan herhangi bir virüs hücrelere tutunmasını sağlamak için kapların her 15-20 dakikada bir sallanan mekanik sallanan bir platform üzerinde 80-120 dakika için oda sıcaklığında test kapları inkübe edin.
    5. önceden ısıtılmış bakım orta ekleyin ve sonra 36.5 ± 1 ° C'de deney gemileri kuluçkaya yatmaktadır.
  3. ayarlanmış bir dondurucuya ≥75% CPE gösterir herhangi bir test gemiler gün 14. Transferi kadar onları her 2-3 günde incelemek sonra ilk 3 gün günde bir mikroskop kullanılarak her test kabında CPE görünüm için bakın ve ya-70 ° C'nin altında ° C. veya altında kalan tüm kültürleri ve toplam kültürlenebilir virüs quantal tahlil kontrolleri Freeze -70 ° C son gününde gemileri inceledikten sonra.
  4. tüm kültürleri çözülme ve 0.2 mikron sterilizasyon filtresi yardımıyla her CPE-pozitif test kabından orta ≥15% filtre. Belirtilen hacim 1,500-18,000 x g'de 10 dakika süre ile tıkanması, santrifüj, filtre içinden geçerek orta geçirilir ve filtrasyona 4 ° C önceden edilemezse.
  5. Yıkanmış BGM testi gemileri kullanarak tüm 1. geçiş testi gemilerin ikinci geçişini gerçekleştirin.
    1. Tüm negatif test damarlardan ve olumlu damarlardan süzülmüş ortamdan çözülmüş ortamın% 10 temsil eden bir aşılama hacmi ile yeni test damarları aşılamak.
    2. Tekrarlayın 3.2.4-3.4.3 adımları, ancak adım 3.3 tarif edildiği gibi 2 nd 1 st geçit üzerinde olumsuz ve olumlu oldu herhangi bir test gemi dondurmak. Bir 3. geçmek gerçekleştirinYalnızca negatif tahlil kontrolleri ve 2. pasajda 1. geçişi sırasında negatif ve pozitif hücre kültürleri kullanılarak 2. geçişi için tarif edildiği gibi yaşı.
  6. Onlar 1. ve 2. pasaj ya da her ikisi de CPE gösterdiğinizde CPE 2. pasajda kadar hem 2. ve 3. geçitleri oluşmaz durumunda, virüs pozitif olarak bireysel test damarları belirleyin.
  7. Tüm test numunelerinin virüs titreleri hesaplamak için Tablo S2 gösterildiği gibi ayarlanan varsayılan program ayarları ile USEPA En Muhtemel Sayı Hesaplama kullanın.
    1. Giriş MPN / ml değeri (M mL) ve üst (CL UML) ve alt (CL lmL)% 95 güven sınırları / ml değerlerini belirlemek için hesap makinesi içine her bir test numunesi için adım 3.6 virüs pozitif çoğaltmak testi gemilerin sayısı .
    2. ODenklem 2 kullanılarak ilgili test örneğinin EMS / L değeri (M L) btain.
      figure-protocol-2 denklem 2
      M ml Adım 3.7 EMS / ml değeri, S Deneyi Numune Hacmi ve D Analiz Edilmiş Orijinal Su Numune hacmi olduğunu.
    3. M ml değeri CL UML değerini ikame ederek üst güven sınırı / L hesaplayın. M ml değeri CL lmL değerini yerine göre alt güven sınırı / L hesaplayın. Bir örnek hesaplama ek malzemeler Bölüm S4.2 gösterilmiştir.
    4. 0 / D 1 ≤ olarak Raporu M ml değerleri. Örneğin, yeraltı suyu örnekleri için 0.002 EMS / L (≤ 1/500 L) ≤.
    5. Sert her Lab MPN ve% 95 güven sınır değerlerini hesaplamak Boş ve Lab Reİlk S tarafından hesap elde edilen değerler / ml çarpılması ve daha sonra 0.3 ile sonuç bölerek Boş ajan.

Sonuçlar

Virüs üç içme suyu arıtma tesisleri ve özel kuyu kullanarak elektro filtrelerin kaynak yeraltı suyundan konsantre edildi. Bir alan numune ve LFSM kontrol oluşan iki örnek setleri, ayrı olayda arıtma tesislerinden toplanmıştır ve bir örnek seti özel kuyudan toplanmıştır. Her bir numune ile birlikte kullanıldığında tohum EMS değeri doğru bir şekilde bağlı belirlenemedi çünkü genel olarak, virüs veri hesaplama alınmadı bitkiler ve kuyu (bir bitki ve diğerinden numuneden iki numune ikisinden LFSM numuneleri kullanılarak belirlendi çoğaltmak şişeler arasında anormal CPE sonuçları) için. Yeraltı suyu örneklerinden polio kurtarma ortalama (Şekil 2) 16% 79 bir farklılaşma katsayısı ile% 58 ortalama. Hiçbir kültürlenebilir virüs yinelenen giremeyen yeraltı suyu alan örneklerinin hiçbirinde tespit edildi.

Yöntem performansı da LFB s kullanılarak ölçüldüamples iki farklı tohum seviyeleri kullanılarak modifiye. poliovirus 1000 MPN de performansını test etmek için kullanılan bir poliovirus 300 MPN A "düşük" titre USEPA Yöntem 1615 A ​​"yüksek" titre kullanılan "standart" 500 MPN LFB seviyesinden daha az seviyelerde performansını değerlendirmek için kullanıldı LFSM kontrol seviyesi. Bu kontroller,% 111 bir ortalama iyileşme ve% 100 bir farklılaşma katsayısı (Şekil 2) benzer şekilde yapılmıştır. Tüm LRB numuneler negatif ve tüm LFB örnekleri kabul aralığı (ek malzemeler Tablo S1) içinde gerçekleştirilir.

figure-results-1
Şekil 1. Filtre elüsyon. Kartuş filtre, yıkama için bir basınç kabı kullanılması için bir şematik gösterilmiştir. Pozitif hava basıncı kartuş yuvası con boyunca basınç kabında biftek ekstresi çözeltisi itmek için kullanılırelektropozitif kartuş filtre taining. pompanın giriş sığır özü çözeltinin bulunduğu kabın içine yerleştirilmeden bir peristaltik pompa, basınç kabı için ikame edilebilir.

figure-results-2
Ground gelen Şekil 2. Ortalama Poliovirüs Kurtarma (%) ve Reaktif-Grade su. Ortalama yüzde kurtarma yerden poliovirüs için gösterilir ( figure-results-3 ; n = 4) ve distile su ( figure-results-4 ; n = 12) örnekler. oniki reaktif dereceli su numuneleri altı poliovirus 1000 MPN ile tohumlanan 300 MPN ve altı ile seribaşı dahil. Hata çubukları standart hatasını temsil eder.

Tartışma

USEPA Yöntem 1615 Kontrolsüz Kirletici İzleme Yönetmelik üçüncü izleme döngüsü (UCMR3) 17 sırasında kullanılmak üzere geliştirilmiş ve öncelikle yeraltı virüs oluşumunu ölçmek için tasarlanmıştır. Bu Bilgi Toplama Kuralı (ICR) yöntemiyle, 15,18 ile ortak bir takım adımlar paylaşan ancak iki küçük farklılıklar vardır. Hem En Muhtemel Sayı (MPN) hesaplamalara dayalı olan kantitatif ile BGM hücre mono tabakaları üzerinde CPE üretmek virüs ölçmek için quantal tahliller kullanın. Yöntem 1615 çeşitli su matrisleri virüsü konsantre edilmesi için yeni bir elektropozitif filtrenin kullanımını sağlar ve hücre kültür testi kap sayısı 20 ile her iki küçük değişiklikler, genel yöntem maliyetlerini azaltmak 10. seyreltme başına replike azaltır. çoğaltır sayısındaki azalma emek azaltır, ancak biraz daha düşük bir belirleme sınırına yol açar. Yeraltı suları yüzey suları daha virüsün düşük konsantrasyonlarda olması beklenmekle birlikte, 19,20 incitahlil numunenin e miktarı farklılıkların kısmen telafi yüzey suyunun beş katıdır. Daha az çoğaltır kullanımı çoğu yüzey suları için yeterli olacaktır, ancak bazı örnek seyreltme gerektirir.

Yöntem 1615 pek çok kritik adımlar ve sınırlamaları vardır. Sığır ekstreler partiden partiye değişebilir. açıklanan ek malzemeler bölümü S2.3 olduğu gibi her yeri virüs elüsyon etkinliği ve ikincil konsantrasyon adımlarda virüs konsantrasyonu için kapasite için test edilmelidir. yöntem BGM hücre kültürleri üzerine aşılamak için ve virüs titreleri belirlemek için numune miktarını hesaplamak için kesin formüller kullanır. Bu formüller titizlikle takip edilmezse hatalı sonuçlar oluşacaktır. Uygun aseptik teknik hücre kültürlerinin bakımı için kullanılmalıdır. 14 günlük kuluçka döneminde sıkıntı göstermek bulaşmamış BGM hücre kültürü kontrolleri olasılıkla hücre kültürü bakımı ile ilgili sorunlar göstermektedir. Büyük bakım da ta olmalıken aşılanması ve çapraz bulaşmayı önlemek için hücre kültürü şişeleri orta eklenmesi ile ilgili adımları pipetle sırasında. Tamamlayıcı malzemeler Bölüm S2 açıklanan kalite kontrolleri titizlikle uyulmalıdır. Bölüm S2 de kalite sorunları için sorun giderme tavsiyelerde bulunur.

Filtreleri elektropozitif virüs adsorpsiyon birincil mekanizma filtre üzerinde pozitif bir yük gücü ve izoelektrik noktası ile ilgili virüsün 'negatif yük gücü ve 21 test edilen suyun pH'sı ile ilgili bir yük etkileşimdir. filtresi elüsyon ayrıca etkileşimlerin gücündeki etkilenir. onlar virüs türleri arasında ve hatta aynı tür içinde suşları arasında farklılık olduğundan, filtreler sağım tekdüze değildir. Bu, herhangi bir sonuç çevresel sularda bulunan virüsün gerçek düzeyini hafife anlamına gelir. Tek BGM hücre çizgisinin kullanımı da virüs oluşumunu göz ardı etmektedir. Menziltemel olarak poliovirüsler ve Enterovirüs B türlerinin serotipleri gibi bazı reovirüsler 14,15,22 sınırlıdır, bu hücre hattında CPE üretebilir enterik virüs. Diğer bulaşıcı virüs türleri tespit olmayacaktır.

Zemin ve reaktif dereceli sularından poliovirus kazanımları hem Performans Değerlendirme (PE için USEPA Yöntem 1615 performans kabul kriterlerini, yani, başlamadan önce analisti performansını değerlendirmek için kullanılan bir analist bilinmeyen titreleri ile ekildi reaktif dereceli su numuneleri bir çalışmada) ve LFB örneklerinde (ek malzemeler Tablo S1). Kültür prosedürü kullanılarak yeraltı suyundan% 58 geri kazanım musluk suyu 23,24 kullanarak başkaları tarafından bildirilen benzerdir. varyasyon katsayısı% 100 (CV) ile% 111 arasında LFB örneklerinden ortalama kurtarma ayrıca PE örneklerinde gözlenen daha yüksek olsa da yöntem performans kabul kriterlerini DURICR ing. ICR ortalama laboratuvarda kazanımları% 85 (; ICR PE veritabanından yayınlanmamış veriler özgeçmişler 58 131%) 36'dan farklılık ise laboratuarlar arası iyileşme% 92 varyasyon (CV) katsayısı ile% 56 idi. Daha yüksek geri kazanımlar yüksek tohum örneklerinin (122% 42 karşı) için daha düşük tohum LFB numuneler için bu çalışmada gözlenmiştir. ICR planlanan edildiğini zamanda, düşük tohum değerleri alan PE örnekleri bu yüksek tohum alma, alt kurtarma olurdu bekleniyordu. LFB örnekleri burada gözlenene benzer, ICR PE örnekleri için çocuk felci virüsü geri tohum değerleri için (CV% 100),% 54 (CV% 69) ve% 44 (CV% 71)% 71 ≤300 EMS, 300- sırasıyla 1.500 MPN ve> 1500 MPN.

Su örnekleri 25 bulaşıcı bir virüs ölçmek için bir çok yöntem vardır. Bu yöntem, standartlaştırma derecesi diğer yöntemlere göre önemlidir. standardizasyon, kalite ve performans denetimleri içerir sadeceaynı zamanda tüm analitik laboratuvarlar aynı yöntemi gerçekleştirmek sağlamak için tanımlanmış hacimleri ve formülleri kullanır. standardizasyon olmadan, o laboratuvarlar arasında sonuçlarını karşılaştırmak zordur ve çok sayıda analitik laboratuvarlarda büyük ölçekli çalışmalar yaparken, bu nedenle standardizasyon gereklidir. Yerleşik standardizasyon ile bu yöntem ek virüs türleri ve hücre çizgilerini içerecek şekilde gelecekte genişletilmesi gerekmektedir. Araştırma yönteme adenovirüs dahil edilmesi için veri sağlamak için devam etmektedir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışmada kullanılan Sabin poliovirüs serotip 3'ü sağladığı için ABD Tarım Bakanlığı, Marshfield, WI'dan Dr. Mark Borchardt'a teşekkür eder; Dynamac Corporation'dan Mary Jean See, Nancy Schable ve Jenifer Jones, BGM kültürlerinin hazırlanması için; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar ve Larry Wymer'e USEPA Metodu 1615'in genel değerlendirmesine katkıları için; Teknik yardım için Gretchen Sullivan; ve su örnekleri toplamamıza izin verdikleri için yerel özel kuyu sahipleri ve kamu hizmetleri. Bu çalışma USEPA tarafından gözden geçirilmiş ve yayınlanmak üzere onaylanmış olsa da, resmi Ajans politikasını yansıtmayabilir. Ticari isimlerin veya ticari ürünlerin belirtilmesi, kullanım için onay veya tavsiye teşkil etmez.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır özü, kurutulmuş tozBD Bacto211520
Kriyojenik tüplerThermo Fisher3775/945373
Hank' S Dengeli Tuz ÇözeltisiInvitrogen14170-112
Mekanik sallanan platformDaiggerEF4907G
Orbital çalkalayıcıThermo Fisher14-285-729
Ön filtreli sterilizasyon filtresiVWR28143-295
Sterilizasyon şırınga filtresiCorning431219
pH StandartlarıSigma-Aldrich33643, 33646, 33648
MEMSigma-AldrichM1018 veya M4642
Leibovitz L-15Sigma-AldrichL4386
Sodyum bikarbonat, %7.5Sigma-AldrichS8761
Fetal sığır serumuInvitrogen10082-139
Antibiyotik-AntimikotikYaşam Teknolojileri15240-062
Tripsin, EDTAİnvitrojen25200072

Kaynaklar

  1. Bradbury, K. R., et al. Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells. Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).
  2. Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters. J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).
  3. Begier, E. M., et al. An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico. Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).
  4. Anderson, A. D., et al. A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001. J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).
  5. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. Norovirus gastroenteritis. N.Engl.J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).
  6. Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. Enterovirus surveillance--United States. MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).
  7. Sawyer, M. H. Enterovirus infections: diagnosis and treatment. Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).
  8. Abzug, M. J. The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative. Hot Topics in Infection and Immunity in Children. Finn, A., Pollard, A. J. , Springer. (2008).
  9. Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).
  10. Ho, M., et al. An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan. New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).
  11. Bae, J., Schwab, K. J. Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater. Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).
  12. Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water. Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).
  13. Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus. Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).
  14. Dahling, D. R., Wright, B. A. Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment. Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).
  15. Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W. 3rd, Dahling, D. R., Stetler, R. E. EPA/600/R-95/178. ICR Microbial Laboratory Manual. , U.S. Environmental Protection Agency, I. (1996).
  16. Cashdollar, J. L., et al. Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water. Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).
  17. USEPA. 40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule. Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).
  18. USEPA. 40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule. Federal Register. 61 (94), 24353-24388 (1996).
  19. Shaw, S., Regli, S., Chen, J. Virus occurrence and health risks in drinking water . Information Collection Rule Data Analysis. McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. , AWWA Research Foundation and American Water Works Association. 437-462 (2002).
  20. Lieberman, R. J., et al. Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , American Water Works Association. Denver, CO. (2002).
  21. Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. Influence of salts on virus adsorption to microporous filters. Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).
  22. Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994. Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).
  23. Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).
  24. Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).
  25. Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:

These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2),

to:

These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).

The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:

The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR,

to:

The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

Etiketler

Enterovir s TespitiNorovir s TespitiVir s KonsantrasyonuElektropozitif FiltreS r Ekstresi El syonuOrganik Flok lasyonBuffalo Ye il Maymun H creleriSitopatik Etki AnaliziEn Olas SayVir s Geri Kazan m Analizi
Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Metot 1615 ölçülmesi. II. Toplam kültürlenebilir virüs Deneyi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.