Method Article

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

DOI:

10.3791/52452

⸱

April 14th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeşil floresan protein geninin keşfinden bu yana, floresan proteinler moleküler hücre biyolojisini etkilemiştir. Bu protokol, genetik mühendisliği yoluyla farklı floresan proteinlerin ekspresyonunun, tek tek hücreleri barkodlamak için nasıl kullanıldığını açıklar. Prosedür, çoğullanmış uygulamalar için ideal olan bir hücre karışımındaki farklı popülasyonların izlenmesini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan proteinler, floresan boyalar ve genel olarak floroforlar moleküler hücre biyolojisi alanında devrim yaratmıştır. Özellikle, floresan proteinlerin ve genlerinin keşfi, lokalizasyon için protein füzyonlarının mühendisliğini, transkripsiyonel aktivasyonun analizini ve ilgilenilen proteinlerin translasyonunu veya tek tek hücrelerin ve hücre popülasyonlarının genel olarak izlenmesini sağlamıştır. Floresan protein genlerinin retroviral teknoloji ile birlikte kullanılması, bu proteinlerin memeli hücrelerinde kararlı ve güvenilir bir şekilde ekspresyonuna izin vermiştir. Burada, bu genlerin, bir hücre popülasyonu içindeki hücrelere kendi biyo-imzalarını vermek için nasıl kullanılabileceği gösterilmektedir. Retroviral teknoloji ile biyoimza elde edildiğinden, hücreler 'süresiz' olarak barkodlanır. Bu nedenle, barkodlu hücrelerin bir karışımı içinde ayrı ayrı izlenebilir ve daha karmaşık biyolojik uygulamalarda kullanılabilirler. Bir hücre karışımındaki farklı popülasyonların izlenmesi, çok sayıda hedefe karşı ilaçların keşfi veya farklı promotörlerin aktivasyon profili gibi çoğullanmış uygulamalar için idealdir. Protokol, farklı genetik floresan belirteçlere sahip barkodlu memeli hücrelerinin nasıl zarif bir şekilde geliştirileceğini ve çoğaltılacağını ve aynı anda birkaç işaretleyicinin veya farklı yoğunluklarda bir işaretleyicinin nasıl kullanılacağını açıklar. Son olarak, protokol, çoğullama yoluyla analiz gücünü artırmak için hücrelerin hücre bazlı tahlillerle birlikte nasıl daha fazla kullanılabileceğini açıklar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böyle floresan spektroskopisi, floresan mikroskopi ve akım sitometri gibi teknolojiler, tüm floresan güveniyor, bir özellik yaygın, biyokimyasal biyomedikal ve kimya uygulamalarında kullandı. Floresan, içsel veya etiketleme yoluyla protein ekspresyonu ve profilleri, hücre kaderi, protein etkileşimleri ve biyolojik fonksiyonların 1-9 analizi için istismar ve olup olmadığını biyomolekülün etkileşimleri ve yapısal değişikliklerin tespiti için floresan / Förster rezonans enerji transferi yoluyla 10-13. Aequorea victoria yeşil flüoresan protein (GFP) 14 izolasyonu yana, diğer cnidarians, özellikle mercanlar ek doğal olarak oluşan floresan proteinlerin keşif, büyük ölçüde ayırt uyarma / emisyon spektrumları ile mevcut floresan proteinleri sayısı arttı. Bunlar, birlikte genlerinde 15-19 mutasyonların tanıtımıyla, have daha da araştırmaları için sitometri ve diğer floresan-tabanlı teknolojileri akış, mikroskopi istismar bilim adamları mevcut floresan proteinlerin gerçek bir palet elde, olanakları genişletti.

Buna paralel olarak, bağımsız olsa da, retroviral teknolojinin gelişmesi büyük ölçüde memeli hücrelerinde 20-23 ektopik genetik bilginin istikrarlı ifadesini kolaylaştırmıştır. Bu teknolojinin, hücre tipi ve dokusunda 24-28 geniş bir dizi halinde ya da transgenik hayvanların 29-31 üretimi için floresan protein gen transferi için kullanılmış olması şaşırtıcı değildir. Retrovirüslerin doğası sonra, dış floresan protein genetik bilgi hücrenin 32 genomu içinde ilave edilir ve hücre ever' `için floresan olur. Bu özellik, hücre kader izleme izin veya hücrelerin bir nüfus içinde tek bir hücrenin etti. Şimdi floresan hücre böylece acqui vardırkendi biosignature kırmızı ve barkodlanmaktadır olarak tanımlanabilir. Eşsiz biosignature diğer hücrelerden tanımlar, ve daha da önemlisi, genetik olarak ayırt emme / yayma spektrumlarının farklı floresan proteinleri ifade etmek için manipüle edilmiş hücrelerden ayıran. Bu tür pluripotensin 33 doğru yeniden programlama faktörleri izleme gibi biyolojik uygulamaları çekirdekçik lokalizasyonu 34 açıklanması için çekirdek içi faktörlerin analizi, transkripsiyonel çalışmaları 35 veya nöronal ağ mimarisi 36 çalışma için nöronların genetik etiketlemesi için flüoresan raportör plasmidlerin yapımı Aynı deney düzeneği için farklı floresan protein genleri istismar var birçok sadece dört örnekleridir.

Sitometrisi geniş olarak gen ekspresyonu, hücre döngüsü, apoptoz gibi tek hücre düzeyinde biyolojik süreçlerin analizi için kullanılmıştır ve fosforil yoluyla sinyal edilmiş debiMemeli hücrelerinde floresan protein genlerinin tirme 37-43 .The stabil ekspresyon ayrıca hücre analizi 38,44 ve ligand-reseptör etkileşimleri 45 için akış sitometrisi kullanımını artırmıştır. Gelişmiş yetenekleri sitometri yüksek verimli ve yüksek içeriği 46 taranması için yaygın kullanılan metodoloji haline akışını sağladı. Çift plaka okuyucu sistemleri, görüntüleme ve sitometri akabilir Fluorometreler ve robotik teknolojileri artık genişletilmiş sayısına rağmen, istismar ve bu gelişmiş teknolojik yetenekleri sığabilecek deney tasarımında bir eksiklik var gibi görünüyor.

Hızlı, güvenilir, basit ve sağlam hücre bazlı yöntemler büyük ölçüde daha yüksek verimli kapasitesini artırmak çoğaltılmış çok katlı uygulamalarda ihtiyaç vardır. Çoklanmış biçimde mühendislik hücre bazlı deneyler, yüksek verimli tarama 39,47-50 gücünü artırabilir burada ilaç keşfi alanında özellikle doğrudur . O bir örnekte eş zamanlı analizler veriyor gibi Çoklama, daha yüksek verimli yetenekleri 51-54 artırır. Floresan genetik barkodlama zarif çoğullamanın sağlar, fakat aynı zamanda, bir kere mühendislik, zaman alıcı protokollerin gereğini circumvents, antikorlar, boncuk ve lekeleri 39,52,55 eşliğinde maliyetlerini azaltır, ve yüksek için gerekli ekranların sayısını azaltabilir sadece hacimli uygulamalar. Son zamanlarda biyolojik uygulamalarda, daha önce farklı klinik yaygın varyantları 58 ile HIV-1 proteaz aktivitesi 56,57 izlemek için geliştirilen bir analiz ile ifade floresan genetik barkod ile çoğullama geliştirmek nasıl retroviral teknoloji tarif etmişlerdir. metodoloji seçmek ve genetik floresan barkodlu hücreleri yükseltmek ve farklı floresan proteinleri ve / veya farklı floresan intensit ifade klonal popülasyonlarının panelleri üretmek için nasıl nasıl odaklanan bir daha açıklayıcı bir şekilde izah edilirler. Fluoresan özelliklerine göre ayırt hücre popülasyonlarının paneller ayrıca farklı biyolojik soruları ele hücre bazlı tahlillerde ile kombinasyon halinde yararlanılabilir multiplekslenmiş yetenekleri geliştirmek. protokolü de, örneğin 59 gibi, daha önce laboratuar içinde geliştirilen hücre bazlı tahlillerde birini taşıyan Barkodlanan hücrelerin bir panelini mühendislik açıklamaktadır. Bu protokol, böylece genetik transferi için köklü retroviral / lentiviral teknoloji, floresan proteinlerin değeri veya 60,48 flow sitometri uygulamaları göstermek için tasarlanmamıştır değil çoğaltılmış uygulamalar için üç birleştirerek artırıcı gücünü göstermek için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli Hücre, Genetik barkodlama için Viral Üretim ve İletim 1. Hazırlık

  1. Bir 10 sm'lik plaka içinde Plaka, 2.5 x 10 6 yapışan hücreler (veya yaklaşık% 50-60 konflüans) Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında% 10 fetal dana serumu (FCS) (FCS) içinde, transfeksiyondan önce bir gün. Böyle Phoenix-GP (Gary Nolan, Stanford Üniversitesi bir tür hediye) olarak tercih retroviral üretim kullanımlık ambalajlar hücre hattı için.
    Not: Ambalajlama hücre soyu, trans-retroviral partikül oluşumu için gag ve pol proteinlerini ifade eder. Emin hücreler transfeksiyondan önce, sağlıklı ve bir tek tabaka plakaya uyulması emin olun.
  2. 24 saat sonra, DNA, bir transfeksiyon karışımı hazırlandı.
    1. Serumsuz DMEM 125 ul 3 ug Veziküler Stomatit Virüsü Zarf glikoprotein vektörü (pCI-VSVg) ve ilgili floresan protein genini taşıyan transfer vektörü 3 ug ekleyin. 2 mg / ml (Mix ve polyethylimine 15 ul ekleyin).
    2. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı ve damla damla hücrelere ilave edin.
      Not: Polyethylimine polyplexes oluşumu için, transfeksiyon tepkin maddesi olarak homojen bir DNA karışımına ilave edilir. Farklı floresan protein işaretlerini taşıyan, viral parçacıklar elde etmek için, tercih edilen bir işaretleyici ile bağımsız bir şekilde her transfeksiyon gerçekleştirin. Retroviral transfer vektörü uzunluğu yaklaşık 7 kb ve eğer 10 kb üzerinde paketlenmiş olamaz unutmayın.
  3. 37 ° C'de inkübe edin. Bunun yerine, 30 ° C ya da 32 ° C 'de viral üretim yeri plakaları arttırmak için.
    NOT: 24 saat sonra, transfeksiyon ortamı, taze ortam 7 ml ile ikame edilmiş olabilir, ve bu hücre sağlığını geliştirmek de, bu yüzer viral yükü azaltabilir.
  4. 48 saat sonra, transfeksiyon, 0.45 uM politetrafluoroetilen filtresi ile yüzer içeren viral parçacıklar ve filtre toplar. Transdüksiyonu için yeni toplanmış virüs süpernatant kullanın. Diğhalde, -80 ° C 'de parçalar halinde süpernatan tutmak ve donma-çözülme kaçının. Viral titre her donma-çözülme döngüsü muhtemelen 50% azalacak unutmayın.
  5. Önce seçim 24 saat Levha hücre hattı iletimine yapışık ise, ya da hemen iletimi yapışmaz ise önce. 2.0 x 10 5-3,0 (burada Huh 7.5.1 ve HEK 293T) x 10 5 yapışık hücre veya 5.0 x 10 5 Tohum 1 x 10 6 yapışmayan hücreler (burada SupT1) oyuk başına bir 6-yuvalı plaka.
    Not: hücreler transdüksiyon zamanında yaklaşık% 60 bir katışma elde böylece hücrelerin sayısı, özellikle yapışan hücreler için, bu yüzden, transdüksiyonun öncesine tohumlanır üzere kalibre emin olun.
  6. Tohumlanır hücrelere 5 ug / ml polibren (hexadimethrene bromür) ilave edin ve daha sonra yaklaşık% 20-40, enfeksiyon (burada 2 mi) elde etmek üzere, daha önce toplanmış virüs süpernatant ekleyin.
    NOT: tasnif herhangi subpopulat yükseltmek için izin verecek gibi İçişleri Bakanlığı ya da enfeksiyon yüzdesi, çoğunlukla keyfihücrelerin iyon. Açıkçası, enfeksiyon daha yüksek bir oran kolaylaştırır ve büyütme sürecini hızlandırır.
  7. 32 ° C'de 120 dakika boyunca 1500 x g'de asılı kepçeli rotor içinde santrifüj ile hücreleri nakletmek. Inkübasyondan önce, taze ortam ile yıkanarak yapışmayan hücreler tekrar süspansiyon. Yapışık hücreler için, taze medya 24 saat sonrası transdüksiyon ile değiştirin.
    NOT: Bu üzerinde dökülmesini önlemek için parafilm ile santrifüje önce plakaları mühür tavsiye edilir. Genetik Barkodlanan hücre çeşitliliğini arttırmak için, (aşama 1.4 de elde edilmiş) farklı floresan proteinleri taşıyan viral partikül hücreleri nakletmek. Floresan belirteçler seçerken, onlar enstrümantasyon ile uyumlu olduğundan emin olun ve ayırt floresan parametreler var.

Genetik barkodlu Hücre 2. Seçme ve Amplifikasyon

  1. Transdüksiyon yüzdesi oranını ölçmek için akım sitometri en az 72 saat sonrası transdüksiyon transduced memeli hücrelerini analiz. Negatif kontrol olarak, kıyaslanabilir transduse hücre çizgisi kullanın.
    Not: sıralama, tek tek Barkodlanan hücre popülasyonları, ilk iletimi yüksek bir yüzde oranı da saflaştırmak için kullanılabilir edileceği gibi, gerekli olmasa da, amplifikasyon işlemi hızlandırmak gerekir.
  2. İlgili proteini eksprese eden hücreler elde etmek için seçilen hücre sıralayıcı kullanmaktadır.
    1. Bu amaçla, kapıları düzgün sağ kanallar ayarlanır sağlamak.
      1. Böylece negatif kontrol ile aynı naif hücre hattını kullanmak ve negatif nüfus her floresan eksende 10 3 değerinin altında olacak şekilde parametre / Kanal voltajını ayarlamak yapmak için. Her floresan kanal için negatif kontrol yukarıda görünen olaylar gibi pozitif floresan için yolluk belirleyin.
    2. Her enstrüman değişebilir farkında olun ve yolluk belirlenmesi için doğru gerilim her exp zorunlu pozitif ve negatif kontroller yaparak, buna göre ayarlanmalıdırerimental kurulum.
      1. Bu deneysel kurulum floresan tespiti için td Domates için eGFP için FITC kanalı (502 uzun geçiş filtresi ile devam 530/30 bant geçiren filtre), PE kanalı (bir 556 uzun geçiş filtresi ile devam 585/42 bant geçiren filtre) kullanın E2 Crimson için, ve APC kanalı (660/20 bant geçiren filtre).
        NOT: E2 Crimson 633 nm lazer ile heyecan ise 488 nm lazer eGFP ve td Domates heyecanlandırıyor.
  3. % 100 FCS 1 ml sırala içine 15 ml konik tüpler.
    NOT: biri doğrudan bireysel klonlar (aşağıya bakınız) sıralama ile devam edebilirsiniz gibi floresan hücre popülasyonlarının sıralama süreci zorunlu değildir. Seçilen floresan dayalı sıkı popülasyonları sıralama bireysel klonların gelecekteki seçimi için bir yedekleme nüfusu sağlar. Tek tek hücreler bazen hücrelerin büyük bir nüfus kolaylıkla dondurulmuş ve çözülmüş sonra ve bir sonraki aşamada amplifiye edilebilir ise büyümeye zor olduğunu aklınızda bulundurun.
  4. Sp5 dakika boyunca 32 ° C'de 524 g asılı kepçeli rotor santrifüj sıralanmış popülasyonlarının aşağı hücrelerini pellet haline getirmek. Taze ortam 1 ml yeniden askıya ve bu hücre birleşmesi, en az iki gün boyunca büyümesini ve bölünmesini sağlamak için% 60'ın altında olduğu, böylece hücreler plaka yeniden.
    1. Örneğin, 6-çukurlu plaka içinde gözenek başına ortam 2 ml yaklaşık 3 x 10 5 hücre ve 6 cm plaka ortam, 2 ml, 2 x 10 6 hücre plaka yapışan hücreler. Yapışmayan hücreler için yapışkan hücreleri ve RPMI için DMEM kullanarak (veya herhangi bir belirli bir ortamda gerekirse). Büyümesine olanak sağlamak için bir kaç gün boyunca 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde kaplama hücreleri yerleştirin.

3. Farklı şiddetler de Genetiği barkodlu Hücreleri ile klonal popülasyonları elde

  1. Başlangıçta transdüse hücrelerden klonal popülasyonları elde (1.7 adım) veya sıralı nüfustan (adım 2.3).
    Not: Bu, tüm hücrenin arasında floresan protein ifade eşit veya benzer seviyede sağlayacaknüfus içinde in (% 40 ortalama floresan yoğunluğunda küçük CV ile sıkı bir nüfus).
    1. Bu amaçla, bir otomatik hücre yerleştirme birimi (ACDU) ile 96-çukurlu plakalara tür tek hücre. Ilgi nüfusa göre sıralama için kapıları ayarlayın. Emin olun kapıları farklı floresan yoğunluklarda hücreleri seçerken ayırt popülasyonları elde etmek dışında en az bir günlük ölçekli ayarlanır. Burada gösterilen prosedür için, adım 2.2 tarif biri olarak kurmak deneysel sitometri aynı akışını kullanın.
  2. En az 2 hafta boyunca 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde tek tek klonlar yükseltin. Amplifikasyon işlemi ile artan nüfus birden fazla tek tek hücrelerden kaynaklanan olup sağlamak için mikroskop altında hücre analiz eder.
    NOT: sıralayıcı ortalama kuyu başına bir hücre yerleştirir, ve bazı kuyular hiç bir hücreyi olmayabilir iken, diğerleri birden fazla olabileceğini unutmayın.
    1. Bir po sağlamakpulation sadece plaka ile son derece nazik olun ve pipetleme kuyu rahatsız asla bir hücreden doğar. Mikroskop altında, iyi tarafından da, plaka gözlemleyin.
      NOT: tek tek hücreler bazen onlar kolayca tanınabilir olacaktır bölen başladığınızda, tespit etmek zor olsa da.
    2. Kenarları boyunca sık sık hücrelerin yığın 'farkında olun. Birden klonal popülasyonları görülebilir bu kuyuları atın ve bir sıkı nüfusa sahip olanlar tutmak.
      Not: Bu, büyütme için büyük plakalar halinde olan transfer tavsiye edilir.
  3. Flow sitometri ile analiz ederek varsayılan klonal popülasyonları Ekran. Deney düzeneği sitometri aynı akışını kullanan bir negatif kontrol onları karşılaştırın.
    1. Numunenin sadece bir yüzdesini analiz ve yedekleme gibi geri kalanı tutmak. Ortalama yoğunluğu ve nüfus gerginlik dayalı en belirgin ayrı popülasyonları seçin. Bunları gerektiği gibi yükseltmek veya hisse senetleri dondurmadaha uzun bir süre veya sıvı azot kısa bir süre için, -80 ° C'de% 20 gliserol ile ortam dondurulması.
      NOT: Bir 'gerçek' klonal nüfus çok sıkı bir floresan desen olması gerektiğini unutmayın.

4. (HTS) Yüksek Verimli Tarama için Çoklama Yetenekler olun

  1. Bundan başka, bir çok katlı bir biçimde kullanılabileceği gerektiği kadar farklı klonal popülasyonları birleştirin. Ayırt absorpsiyon / emisyon spektrumları ve / veya farklı şiddetlerde ile klonlar seçin. 96 kuyucuklu plak format HTS için uygun olan, kullanılırsa, 200 ul içinde 50,000 hücre tohum ile sabitleştirilir.
    NOT: hücrelerin sayısı sadece bir tahmindir ve hücre tipi bağlı olarak değişebilir ve yapışık olup olmadığını unutmayın.
  2. Bağımsız kurulan floresan hücre çizgilerinin her biri birbirinden ayırt edilebilir sağlamak için akış sitometrisi ile analiz edin. Analizden önce negatif hazırlamakve tek renk kontrolleri parametre ve tazminat değerlerini ayarlamak için.
    NOT: açıkça sağlayacak karışık popülasyonları ayırt etmek parametrelerinin ayarlanması ayrıca bir çoğaltılmış biçimde kullanılmak üzere.

5. Seçim Biyolojik Uygulama Genetiği Barkodlu Hücre Hatları Uyum

  1. Stolp ve diğ., 2013, 59 burada tarif edildiği gibi tercih edilen deney öğeleri içeren virüs partikülleri ile oluşturulan genetik barkodlanmaktadır hücre hatları, transdüksiyonu. Tercih edilen deney, ayrı ve ayırt floresan kanal yer alması gerektiği unutmayın ve bu nedenle, uygun Barkodlanan hücre hattına transfer edilmelidir.
    NOT: Her barkodlu hücre çizgisi farklı bir tahlil taşıyabilir.
  2. Tahlil unsurları içeren olanlar için Sıralama genetik floresan barkodlu hücreler.
    Not: Deney elemanları F (bir füzyon olarak ya da dahili ribozom giriş bölgesi ile), bir etiket ya da fluoresan proteine ​​bağlanmış mühendisliği ile elde edilebilirya da basit bir tespiti, Western blot yoluyla sitometrisi veya mikroskopi akar. Bu protokolde kullanılan sistem tek başına HA epitop yüzey ifadesi dayanır, ya da ek FLAG epitop ifadesi.
    1. HA ve APC-floresan akuple antikorlar ile tahlil içeren klonal popülasyonları Leke. Sonra, anti-FLAG ve FITC-konjuge antikor boyama ile klonal popülasyonları analiz.
    2. Tahlil geri izlemek için, analiz veya 'kod çözme' farklı genetik barkodlu hücre hatları ayırt edilebilir uygun kanalda popülasyonları. Burada, td Domates tespiti için PE kanalında analiz alt tabakanın doğasını çözmek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğullama floresan genetik bireysel klonal popülasyonları üretilmiş olan sadece bir kere elde edilebilir biyolojik uygulamalarda amacıyla hücreler barkodlanmaktadır. Barkodlu popülasyonlar az spektral örtüşme net farklı floresan özelliklere sahip olduğunda Çoğullama en etkilidir. Memeli SupT1 hücrelerinin klonal popülasyonları, Şekil 1 'de gösterilen örnek mCherry ve siyano floresan proteini (CFP) ile Barkodlanan hücreleri kolayca bireysel floresan özelliklerini kaybetmeden eş zamanlı olarak analiz edil...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşte iki köklü prosedürler kombine edilmiş; retroviral teknoloji ve flow sitometri kullanılarak floresan proteinlerin tespiti yoluyla genetik mühendisliği. Benzersiz hücre çizgilerinin üretimi için floresan protein bazlı bir genetik barkod çok katlı uygulamalar için sağlam ve basit bir yol sağlar. Retroviral teknoloji ile genetiği barkodlu hücreleri üreten, başlangıçta uzun bir süreçtir, ama bir kez, hücre malzeme güvenilir ve istikrarlı bir kaynak kurulan elde etmesini sağlar. Bu teknolojinin doğası sürekli kendi gerçe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz retroviral partiküllerin üretimi için Phoenix GP ambalaj hücre hattı sağlamak için Stanford Üniversitesi'nden Dr. Garry Nolan teşekkür etmek istiyorum. Biz td Domates sağlamak için Kaliforniya San Diego Üniversitesi'nden Dr. Roger Tsien teşekkür ederim. Biz de onların hizmet ve yardım için San Diego Devlet Üniversitesi Sitometrisi Çekirdek Tesisi teşekkür etmek istiyorum.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 ml şırıngaBD309604virüsü 0.45 ve mikro filtrelemek için kullanılır
; Virüsü filtrelemek için kullanılan m ploytetrafloroetilen filtrePall Corporation4219
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)HEK 293T hücreleri içinCorning45000-304
PEI (Polietilamin)poli bilimler23966-22 mg / ml konsantrasyon kullanılır
Asılı kova santrifüjü (soğutulmuş)Eppendorf5805 000.017kullanılır spin enfeksiyonu
PBS (fosfat tamponlu salin)Hücrelerin yıkanması için kullanılanCorning21-040-CV
Polibren (heksadimethreen bromür)Sigma-Aldrich107689Viral enfeksiyon etkinliğini artırmak için kullanılır. 5 & mikro'da kullanılır; g / ml konsantrasyonu.
Hücre popülasyonlarını sıralamak için kullanılanFACSAriaBD Biosciences
cihazı Hücre analizi için kullanılanFACSCantoBD Biosciences
Phoenix-GPGary Nolan'danretroviral partiküller üretmek için kullanılan hücre hattı
Fetal buzağı serumuMediatechMT35015CVhücre büyümesi ve SupT1 hücrelerinin sıralanması için kullanılır
ATCCCRL-1942İnsan T lenfoblastları
HEK 293T hücreleriATCCCRL-11268SupT1 hücreleri için SV40 büyük T-antijeni RPMI
1640Corning10-040-CVhücre büyüme ortamını
hücre büyüme ortamı için cihazı hediye da içeren İnsan Embriyonik Böbrek hücreleri

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
  3. Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
  4. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  5. Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
  6. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  7. Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
  8. Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
  9. Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
  10. Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
  11. He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
  12. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  13. Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
  14. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  15. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  16. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  17. Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
  18. Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. Biochemistry. 47 (16), 4666-4673 (2008).
  19. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
  20. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  21. Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
  22. Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
  23. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
  24. Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
  25. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
  26. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
  27. Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
  28. Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
  29. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  30. Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
  31. Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
  32. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  33. Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
  34. Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
  35. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  36. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  37. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  38. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
  39. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  40. Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
  41. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
  42. Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
  43. Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
  44. Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
  45. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. Biochemistry. 30 (20), 5066-5075 (1991).
  46. Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
  47. Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
  48. Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
  49. Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
  50. Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
  51. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
  52. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
  53. Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
  54. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015(2013).
  55. Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
  56. Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940(2010).
  57. Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
  58. Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
  59. Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway - Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835(2013).
  60. Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescent ProteinsRetroviral TechnologyFlow CytometryFluorescent Activated Cell SortingGenetic BarcodingMultiplexed ApplicationsCell Based AssaysFluorescent MarkersClonal PopulationsViral Transduction

Related Articles