Na fonksiyonel karakterizasyonu + / H + Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Özet

Bu makalenin ilk bölümü, plazma zarlarında veziküler Na⁺/H⁺ değiştiricileri eksprese eden mutant hücre hatlarının nasıl seçileceğini gösterir. İkinci bölüm, bu değiştiricilerin iyon seçiciliğini ve kinetik parametrelerini belirlemek için kullanılan hücre içi pH ölçümlerine ve hızlı iyon alımına dayalı protokoller sağlar.

Özet

Endozomal asidifikasyonu gibi sinaptik vesiküller protein geri dönüşüm ve bozulma, reseptör duyarsızlaştırma ve nöro-yükleme gibi işlemler, geniş bir aralığı için önemlidir. Bu asitlenme CIC klorür nakliyecilere birleştiğinde proton ATPazların, aracılık tarif edilmektedir. Elektro-proton taşıyıcıları yüksek ölçüde muhafaza edilmiş, Na ⁺ / H ⁺ değiştiriciler (NHE) 6, 7 ve 9, bu bölmelerin olarak ifade edilmiştir. Genlerindeki mutasyonlar, insan bilişsel ve nörodejeneratif hastalıklar ile bağlantılı olmuştur. Onların hücre içi lokalizasyonu detaylı fonksiyonel karakterizasyonu engelledi gibi Paradoksal, rolleri, zor kalır. Bu yazının bu sorunu çözmek için bir yöntemi gösterir. Bu plazma membranında hücre içi NHEs tutma akut sitosolik asitlenme kalan kapasitesine sahip mutant hücre hatlarının seçimi oluşur. Daha sonra iyon seçiciliği ve aktivitesini ölçmek için iki tamamlayıcı protokol göstermektedir(i) bir floresan görüntü mikroskopi kullanılarak hücre içi pH ölçümleri göre, ve (ii) bir lityum alımının hızlı kinetik göre: Bu değiştirici. Bu tür protokoller olmayan diğer Elektrojenik taşıyıcıları ölçmek için çıkarım olabilir. Ayrıca, burada sunulan seçim prosedürü bir hücre içi tutma arızalı fenotip hücreleri üretir. Bu nedenle, bu hücreler de plazma zarı diğer veziküler membran proteinleri ifade edecektir. Burada tasvir edilen deneysel strateji, bu nedenle daha sonra veziküler ⁺ / H ⁺ seçimi için kullanılan değiştiriciler, Na ile birlikte, plazma membranında ifade edilecektir diğer hücre içi proteinleri incelemek için potansiyel olarak güçlü bir araç olarak kullanılabilmektedir.

Giriş

Çoğu hücre içi bölmeleri olgunlaşması, insan ticareti, proteinler veya hormonlar ve yükleme nörotransmitterlerin geri dönüşümü için önemli bir parametredir asidik lümen pH görüntüler. Bu sitosol ve vesiküler içeriği arasındaki pH gradyanı veziküler CIC klorür taşıyıcılar ² bağlanmış, vaküoler H ⁺ ATPazların ¹ ile elde edildiği gösterilmiştir. Her iki knock-out (KO) farelerde ve insan hastalarda, bu taşıyıcıları önemi onların genlerinde ^3-6 mutasyonlar neden ağır fenotip tarafından vurgulanmıştır.

Sodyum-hidrojen değiştirici SLC9A ailesinin üyeleri, aynı zamanda, Na ⁺ / H ⁺ değiştirici NHEs olarak adlandırılan hücre-içi pH ve hücre hacmi düzenlenmesinde anahtar etkileyiciler yanı sıra epitelden asit-baz eşdeğerleri vektör taşıma olduğu gösterilmiştir . Plazma zarı NHEs yanı sıra, üç yüksek ⁺ / H ⁺ değiştiriciler, NHE-6, 7, Na korunmuşve 9, trans-Golgi ağı ve erken endozomlarda ⁷ olarak ifade edilmiştir. Onların genlerinde mutasyonlar Angelman benzeri veya Christianson sendromları ^8-9, aile temelli otizm ¹⁰ ve Dikkat Eksikliği Hiperaktivite Bozukluğu ^11-12 ile bağlantılı olmuştur. Bu dönüştürücüler ayrıca Alzheimer hastalığı yatkınlık ¹³ ve X-bağlantılı mental retardasyon bitişik genler gibi nörodejeneratif sorunlara ¹⁴ sendromları dahil edilmiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar beyin gelişimi ve / veya fonksiyon bu hücre içi NHEs önemini vurgulamak.

Bu eşanjörleri hücre içi lokalizasyonu doğru onların iyon seçicilik ölçümleri, ulaşım yönü, kinetik parametreleri, ve düzenleme önler. Hücre içi bölümlerinde ifade tüm nakliyeciler için olduğu gibi, onların biyokimyasal faaliyetlerini değerlendirmek ve dolayısıyla tam olarak fizyolojik rolleri ve Mechan anlamak son derece zorizm kendi patolojik etkileri altında yatan. Yüksek sitozolik K ⁺ konsantrasyonu dayanarak, en çok yaygın kabul gören hipotez onlar K ⁺ birleştiğinde proton akış taşıyıcıları olarak görev olmasıydı. Bu değer sabit bir veziküler pH'sını muhafaza etmek için V-ATPazların proton pompalama telafi edilebilir bir proton sızıntı olması, hipotez edilmiştir. Bu görsel maddenin amacı, plazma membranında veziküler taşıyıcıları ifade, ve (ii) bu nakil fonksiyonlarını ölçmek için, bağımsız iki yaklaşım göstermek için hücre çizgilerinin genetik olarak seçilmesi ile sağlayan bir yöntemi göstermek için, (i) 'dir.

Üç yıl önce, Pouysségur ve Franchi NHE ailesinin ¹⁵ üyesi moleküler klonlama ve karakterizasyonu etkin bir genetik yaklaşım öncülük etmiştir. Bu tarama yöntemi olarak hücre içi proton toksisite dayanıyordu. İlk adım hücre hatları eksik elde etmek olduHerhangi bir Na ⁺ / H ⁺ değişimi bu taşıyıcı geri döndürülme oranı kullanılarak, plazma membranında ifade edilmiştir. Fibroblastlar (CCL39 hücre çizgisi), Na ⁺ ya da Li ⁺ önceden yüklenmiş ve daha sonra 2 saat süre ile bir asidik hücre dışı ortam (pH 6.5) içine yerleştirildi. Bu fonksiyonel, Na ⁺ / H ⁺ değişimi ifade eden hücrelerin ölümüne ve damar sertliği-yetersizliğine sahip hücrelerin (PS120 hücre çizgisi) ¹⁶ seçimine yol açmıştır. Bikarbonat içermeyen bir ortam içinde kültive edilince, bu hücreleri, akut hücre içi asitlenme çok hassastır. Bu tür hücreleri, akut hücre içi acidifications sunulur Sonuç olarak, eğer plazma membranında herhangi bir işlevsel proton akış mekanizması sentezleme pozitif (bakınız ¹⁷⁾ seçilir. Bu gibi asitleştirme teknikler plazma membranında WT hücre içi NHEs zorla ifade sağlayan kusurları trafiğe sahip hücre çizgileri izole etmek için kullanılabilir.

Ökaryotik, Na ⁺ / H deEşanjörleri elektro ^+, onlar kanalları ölçmek için büyük bir başarı ile kullanılmaktadır elektrofizyolojik yaklaşımlarla ölçülebilir değildir. Bu yazıda, bu nedenle hücre içi pH ölçümleri ve lityum alımının hızlı kinetik bu değiştirici aktivitesini ölçmek için nasıl gösterir. Temel kavramlar aynı gibi, bu seçim bölümü için geliştirilmiş süreçlerin birçok fonksiyonel ölçümler için doğrudan kullanılan olduğunu fark etmek ilginçtir.

İlginç bir şekilde, bu metinde tarif edilen yaklaşımı kullanılarak seçilmiş hücre çizgileri mevcut trafik kusur veziküler potasyum kanalı TWIK1 ¹⁸ olarak plazma zarının diğer veziküler proteinlerin daha büyük bir ifadesine neden olduğu gözlenmiştir. Bu veziküler transmembran proteinler için genel bir tutma kusur mekanizmasının seçimi doğru işaret. Dolayısıyla bu seçim prosedürü ve Mayıs üretir hücrelerihücre içi bölmelerin zar proteinleri üzerinde çalışanlar için ümit veren bir araç oluşturmaktadır. Yanı sıra burada sunulan ölçüm teknikleri olmayan diğer Elektrojenik taşıyıcıları çalışmak için geçerli olabilir.

Protokol

1. H ⁺ Killing Seçim

1. Hücre çizgileri
   1. Kararlı olarak NHE-eksikli hücrelerin transfekte (örneğin, CCL39 türetilmiş PS120 hücre çizgisi ¹⁶⁾ bir fibroblast hücre çizgisinde etkili transfeksiyon verimi ve seçim üretecek memeli ifade vektörü ve transfeksiyon yöntemi herhangi bir kombinasyonu kullanılmıştır.
      NOT: Yıllarca Kalsiyum Fosfat yağış ¹⁹ iyi transfeksiyon verimi ile kullanılmıştır. Bu, Lipofectamine2000 gibi ticari reaktifler ile daha yakın değiştirilmiştir, transfeksiyonlar imalatçının talimatlarına uygun olarak yerine getirilmektedir.
2. Çözümler
   1. Aşağıda tarif edilen üç steril çözeltiler hazırlayın. Filtrasyon (0.22 mikron) tarafından bu çözümleri sterilize edin.
      1. 50 mM _NH4CI, 70 mM kolin klorid, 5 mM KCI, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCI2, 5 mM gl içeren bir _NH4 ⁺ Yükleme çözeltisi hazırlayın (pH 7.4)ucose ve pH 7.4'te 15 mM MOPS.
      2. 120 mM kolin klorür, 5 mM KCI, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCI2, 5 mM glukoz, pH 7.0, 15 mM HEPES içeren bir durulama çözeltisi (pH 7.0) hazırlayın.
      3. PH 7.4'te 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES içeren bir kurtarma çözeltisi (pH 7.4) içinde hazırlayın.
3. _CO2 bozabilir bu tamponlama neden olur 5% 'si olarak, - seçim başlamadan önce, ("serbest" kuluçka _CO2 olarak adlandırılır) dış tanktan ek _CO2 ile 37 ° C' de kullanılabilen bir hücre kültürü kuluçka elde asidifikasyon. Ile yaklaşık 2 x 10 ⁸ hücreleri (tipik olarak yaklaşık 20 konfluent 100 mm plakalar) için ilgi NHE sentezleyen hücre soyu yükseltin.
4. H prosedürü öldürme ^+:
   1. 3 de, yükleme Çözüm, 1 saat için ilgi hücre NHE-ifade eden hücreleri inkübeCO ₂ -ücretsiz inkübatör 7 ° C.
   2. Yükleme çözeltisi aspire ve daha sonra, yukarıda tarif edilen, durulama çözeltisi içinde iki kez yıkayın. Asitlenmesini üretecek bir dik NH ₄ ⁺ gradyan oluşturulmasını zedeleyecek artık dışı NH ₄ Cl ortadan kaldırmak için verimli bu adımı gerçekleştirin.
   3. Aspirasyon ile durulama ortamı ortadan kaldırmak ve _CO2 serbest inkübatör içinde 37 ° C'de tekrar geri kazanım çözeltisi içinde bir saat için kuluçkalayın.
   4. Normal kültür ortamında (% 7.5 FCS, tipik olarak DMEM) ile kurtarma ortamı yerine ve (% 5 _CO2 ve% 95 hava içeren nemli bir atmosferde 37 ° C), standart kültür koşullarında hücreler büyür.
5. Stabil klonlar ortaya kadar haftada iki kez seçim bu döngüyü tekrarlayın.
   NOT: Hücre kültürü ve seçim koşulları konusunda özel dikkat. Iş Ay o daha eğilimli herhangi bir kontaminasyon tarafından harap olabilirkültür ve tekrarlanan hücre manipülasyonlar uzun bir süre sonra CCur.
   1. Burada, klonlar yükseltmek ve bireysel olarak daha bölümlerde 2-3 açıklanan onları karakterize, ya karakterizasyon önce hücresel nüfus oluşturmak için onları bir araya havuz seçebilirsiniz.
6. Sayaç-seçilmesi ebeveyn asit duyarlı fenotip (Şekil 1B) döndürülür olabileceği olanlar tarafından asitlenme dirençli hücreleri korumak için zaman zaman seçim (yaklaşık iki haftada) uygulayın.

2. Hücre içi pH Ölçümleri

2.1) Floresans pH Görüntüleme

1. 490 nm'de uyarıldığında, pH'a duyarlı ve üretici protokollerine göre bir 445 mil izosbetik noktası sahip rasyometrik pH'a duyarlı fluoresan boya BCECF / AM kullanın.
   1. Seçenek olarak ise, üreticinin protokollerine aşağıdaki diğer pH'a duyarlı prob kullanılır.
2. Bir görüntüleme set con kullanınyüksek hassasiyet video kamera bağlanmış bir ters mikroskop sisting. 450 nm ve uyarma için uygun kuvars nötr yoğunluk filtreleri ile eşleştirilmiş 490 nm dar bant girişim filtreleri ile bu seti donatın.
   1. Mümkünse oranı da hem λ1 ve / veya λ2 için, ya doyurarak veya çok düşük ayarlanmış bazal floresan değerlerini önlemek 1. yaklaşır, böylece λ1 ve λ2 kurulum karşılaştırılabilir floresan değerlerine filtreler ve aydınlatma koşulları uygun seti kullanın. Bu hücre içi pH değişiyor olsa oranı tespit edilmiş olmayabilir gibi o önemli eserler verebilir.
      NOT: Bu sistem uygun emisyon dalga boyunda (BCECF için 535 nm) hızlı perfüzyon, zaman atlamalı, yukarıda zikredilen iki dalga boylarında uyarım ve satın izin gerekir. Yazılım otomatik veri toplama ve depolama sağlayan sistemi donatın.

NHE İleri Faaliyet 2.2) Ölçüm (eldesiSitosolden protonlar)

1. _NH4 ⁺ Yükleme çözeltisi içinde 1 saat süren kuluçkalamadan hücreleri asitleştirin _CO2 yokluğunda (adım 1.4).
2. Son beş dakika boyunca solüsyon ile BCECF-AM (5 uM nihai konsantrasyon) ilave edilir ve daha sonra hücre dışı prob ortadan kaldırmak için NH ₄ ⁺ yükleme çözeltisi durulayın.
3. Mikroskop hücreleri monte ve istikrarlı bir temel kaydetmek için birkaç fotoğraf çekmek. Durulama çözeltisi (yukarıya bakın) serpmek. Bu asitleştirme tekabül eden floresans bir düşüşüne yol açar.
4. PH stabilize sonra, Li ⁺ / H ^+, Na ⁺ / H ⁺ veya K ⁺ / H ⁺ değişimi aracılığı ile pH yükselmesinin oranını ölçmek için aşağıdaki çözümlerden herhangi serpmek. Her bir çözelti bir potansiyel birleştirme katyon H ⁺ değişimi için test edilecek olan içerir. Bunlardan biri taşınıyorsa, bu değerden uygun olacak 495 nm'de bir floresan artışı ile sonuçlanırond hücre içi pH zam için:
   PH 7.4'de 120 mM LiCİ, 5 mM KCI, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES
   PH 7.4 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES
   PH 7.4'de 125 mM KCI, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glükoz ve 15 mM HEPES

NHE Ters Faaliyet 2.3) ölçümü

NOT: Burada ilke transmembran iyonik eğimleri ters etmektir.

1. Ölçümden önce, ilgi konusu hücre içi katyon ile yük hücreleri (aşağı bakınız).
2. BCECF / AM (bkz: adım 2.2.2) ile 5 dakika boyunca onları inkübe; , yıkayın video mikroskobu onları monte edin.
3. Yükleme çözüm serpmek ve istikrarlı bir temel kaydetmek için birkaç fotoğraf çekmek.
4. Bazal istikrar, görüntü hücreleri bir hücre dışı asidik ortam 120 m içeren perfüze olan pH değişimleri sonraE kolinklorid, 5 mM KCI, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glükoz ve pH değeri 6.5 olan 15 mM MES,.
5. LiCİ yüklemesi için, pH 7.4 ile 120 mM LiCİ, 5 mM KCI, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES oluşan bir çözelti içinde, 2 saat boyunca kuluçkalayın. Atom emme spektroskopisi ile ölçülen hücre içi lityum yaklaşık 60 mM arasında bir değer elde edilir.
6. ^Na yüklemesi için, 1mM ouabain varlığında pH 7.4'te 120 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCI2, 5 mM glukoz ve 15 mM HEPES oluşan bir çözeltiye, iki saat süreyle kuluçkalayın Na / K ATPaz engellemek için. Bu koşullar altında, hücre içi ^Na konsantrasyonu, 40 mM arasındadır.
   Not: sitosolik K ⁺ konsantrasyonu 140 mM aralığında ve bir dışarı doğru yönlendirilmiş K + gradyanı elde etmek için, bu nedenle kolay olduğu gibi K ⁺ yükleme gerekli değildir.

2.4) Veri Tedavi ve Kalibrasyon:

Not: Bu adım ileri ve geri ölçümler için de geçerlidir.

1. Her bir deneyin sonunda, 6.5 ile 7.4 arasında pH değerlerine ayarlanmış 140 mM KCI, 20 mM HEPES ve 5 uM nigerisin eden bir çözelti ile hücreleri serpmek.
2. Metin biçiminde altındaki görüntüleri floresan ölçümleri gibi verileri (gri düzeyleri yoğunluk seviyelerini temsil eden) ve ihracat toplayın ve bir elektronik tablo programı kullanarak aşağıda açıklanmıştır davranırım.
3. Her bir hücre ya da aşağıdaki denklem kullanılarak ilgili bölge için hücre içi pH değerini hesaplayın:
   pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R _max R)) x F _{dk (λ2)} / F _{max (λ2)}
4. F _{min (λ2)} / K _{ma x (λ2),} deneyler boyunca 450 nm floresansta bir azalma ile sonuçlanır sistemi ağartıcı veya kaçak var ise, bu oran kullanın. Ancak bu, çok nadiren des kullanılan koşullarda gözlenenaçıklanan şekilde deneyleri.
5. Kalibrasyon verileri her pH ölçümü sonunda mevcut gibi gelen hesaplanan değerler kalibrasyon için kullanılan pH değerleri farklı olup olmadığını kontrol edin. Bu durumda, aşağıdaki yordamı kullanarak kalibrasyon tüm deneysel belirlenen pH değerleri ayarlayın:
   1. Aşağıdaki katsayısı (Q, kalibrasyon değerleri arasında ölçülen değerler / Fark arasındaki fark) hesaplayın. Hesaplanan değerler karşılık gelen kalibrasyon değerlerini eşit olacak şekilde Q ile bütün veri kümesi ilave veya çıkarma ile son ayarlamayı yapın çarpın.

Hızlı Li ⁺ Alımına tarafından NHE7 başlangıç ​​Oranları 3. Ölçümler

1. Çok yuvalı plakalar üzerinde Tohum hücreleri (6 yanı sıra 24) üzerinde ya da ²⁰ de tarif edilen alternatif olarak nigericin / sığır serum albümini (BSA) asitlendirme tarif _NH4 ⁺ yükleme tekniği kullanarak bunları asitleştirmek.
2. Durulama Plakalar iki kez hızla yukarıda tarif edilen durulama çözeltisi kullanılarak ve daha sonra arzu edilen miktarda (hafif, Km değerlerinde altında) 1-10 mM lityum içeren alım Çözeltilerin hücreleri ve katyon istenen konsantrasyonlar ve / veya ilgi duyulan inhibitörleri inkübe zaman.
3. Bu taşıma başlangıç ​​oranları koşullarda faaliyet sağlamak için kısa ve tutarlı alım süreleri (genellikle bir dakika veya altında) koruyun. Ayrıca alımı için kullanılan tüm çözümler izotonik olduğundan emin olun.
4. Alım süresi sonunda, dikkatli bir şekilde alımı ortamı ortadan kaldırmak ve buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hücreler dört kez yıkayın. (Dördü ideal için az 10 sn) lityum akışını önlemek için mümkün olduğunca hızlı bu yıkar gerçekleştirin.
5. Lyse% 25 Nitrik asit hücreler. % 25 nitrik asit, oyuk başına 250 ul uygulanır ve daha sonra pipet ucu ile her bir oyuğa hurda ve yeni mil bütün iyi süspansiyonu transfer, en az 1 saat bekletincrocentrifuge tüp.
6. Selüler artığın ayrılması için 15,000 x g'de (oda sıcaklığı), 5 dakika boyunca, onları santrifüj, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine lizat aktarın.
7. Atomik absorpsiyon spektroskopisi ²¹ ile süpernatanların lityum içeriğini ölçün.
   NOT: Farklı şirketler Lityum oyuk katot lambası ile donatılmış gereken atomik absorpsiyon spektrometre sağlamak. Bu makineler çok hassas ama aynı zamanda oldukça hassas olarak üreticinin talimatlarını izleyin.

Sonuçlar

Seçim:

Şekil 1A'da görüldüğü gibi, lH ⁺ öldürme seçimi, amonyum zayıf bir baz difüzyon dayanmaktadır. zayıf bazlar ve hücre içi pH üzerindeki asitler difüzyon etkisi Walter Bor ve işbirlikçileri ²² öncülük edilmiştir. Zarif bir fikir pozitif genetik seçimi için ölümcül bir asitlenme sonra Jacques Pouysségur ¹⁷ tarafından geliştirilen üretmek için bu olguyu kullanmak için. Böyle bir protokol kapsamında, hücre içi pH değeri yaklaşık 5.5 durulam...

Tartışma

Bu protokol, mevkiye-yönelik mutagenez ile birincil dizisini değiştirmeden, plazma membranında, hücre içi, Na ⁺ / H ⁺ değiştiriciler ifade eden hücreleri seçin açıklamaktadır. Bu değiştirici hemen karakterize edilebilir.

Bu yöntem, plazma membranında veziküler, Na ⁺ / H ⁺ değiştiricileri ifade edecek hücre hatları seçmek için hücre içi proton hücresel zehirlilik dayanmaktadır. Bu örneğin, Li ^+, K ^+, veya Cs ⁺ olarak...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Standart hücre kültürü ekipmanı			Farklı katalog numaralarına sahip birçok cihazdan oluşan H+ öldürme seçimi için kullanılır
CO2	Sanyo	MCO15A
ile inkübatör, CO2	Heraeus cihazı	BB6220
PSM1200NF Fisher
DMEM orta	sigma	D5796
FBS altın	GE Sağlık	A15-151
Penisilin / streptomisin	PAA	P11-010
Tripsin 10x	PAA	L11-003
Zeeman fırın sistemli Atomik Absorpsiyon spektrometresi	Thermo Scientific	ICE 3500 GFZ
LiCl	sigma	L4408
Nitrik Asit	sigma	438073
Floresan video mikroskopi seti	Leica		Farklı katalog numaralarına sahip birçok cihazdan oluşur
Ters otomatik mikroskop	Leica	DMI6000B
		11888911
		11888377
olay floresan	leica	11888901
		11504166
motor braketi	leica	11888379
		11505234
		11521505
		11522106
LED iletim ışığı & nbsp;	Leica	8097321
		8102034
		11521580
motorlu plaka	leica	11522068
		11521734
		11521719
		11888423
kamera çıkışı	Leica	11888373
		11507807
		11888393
		11888259
		11888258
		11541510
görüntü toplama/analiz yazılımı	Leica	11888375
optik	leica	11506507
		11506243 11506203
floresan Xenon lamba	leica	DMI6000
kamera	hamamatsu	8100601
metafluor / Mmfluor yazılımı		11640905
pH'a duyarlı prob, BCECF-	yaşam teknolojileri	B1170
Nijerin	Sigma	N7143