Method Article

Ön Talamusun Çekirdek Derin Beyin Stimülasyon sonra Sıçan Hippocampus Gen İfade Değişim Analizi

DOI:

10.3791/52457

⸱

March 8th, 2015

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Derin Beyin Stimülasyonu (DBS) cerrahisinin terapötik etkilerinin altında yatan mekanizmanın araştırılması gerekiyor. Bu yazıda sunulan yöntemler, DBS cerrahisi sonrası nörojenezi kolaylaştırabilecek aday genlerin gen ekspresyon profilini analiz ederek DBS tarafından tetiklenen hücresel olayları incelemek için deneysel bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Derin beyin stimülasyonu (DBS) cerrahisi, örneğin bazal ganglionlar, talamus ve subtalamik bölgeler gibi beynin çeşitli bölgelerini hedefleyen, ilaca yanıt vermeyen birkaç hareket bozuklukları için etkili bir tedavidir. DBS cerrahisi alanında son gelişmeler morbid obezite, depresyon ve obsesif kompulsif bozukluk gibi çeşitli diğer koşullara bu cerrahi tekniğin uygulama genişletmek başladı. Bu genişleyen endikasyonlar rağmen, küçük DBS cerrahi yararlı etkilerini kolaylaştıran altta yatan fizyolojik mekanizmalar hakkında bilinmektedir. Bu sorunun bir yaklaşım, elektriksel stimülasyon almak nöronlarda gen ekspresyonu analiz etmektir. Daha önce yapılan çalışmalar, sıçan dentat girus bu nöron talamus 1 ön çekirdeğin hedef DBS ortaya olduğunu göstermiştir. ATN hedefleyen DBS cerrahi tedaviye dirençli epilepsi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle çok interes aitBizim için t elektriksel ATN uyararak bağlı transkripsiyonel değişiklikleri keşfetmek için. Bu yazıda, erişkin erkek Wistar sıçanlarda ATN hedefleyen stereotaksi-güdümlü DBS cerrahisi için metodolojileri tarif. Ayrıca gen ekspresyonu değişimlerinin ölçülmesi için doku diseksiyon, RNA izolasyonu cDNA hazırlanması ve nicel RT-PCR için takip eden adımları tartışır. Bu yöntem, uygulanan ve yaygın olarak klinik olarak hedef bazal gangliyonlar ve beynin diğer bölgelere uyarılması için modifiye edilebilir. Burada tarif edilen gen ifadesi çalışması DBS mekanizması yönetmenlik olabilir moleküler oyuncular keşfetmek için bir aday hedef gen yaklaşımı varsayar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

elektriksel beyin devrelerini uyarıcı olasılığı 2 araştırılmıştır zaman nöroşirürji tekniği olarak Derin Beyin Uyarım gelişiminin arkasındaki geçmişi 1870'lerin kadar uzanmaktadır. sinirsel bozuklukların tedavisi gibi kronik yüksek frekanslı stimülasyon kullanılması 1960'lı 3 başlamıştır. Daha sonra kronik implantasyonu DBS elektrotlar 4-6 gelişine 1990'larda, DBS tarafından tedavi edildi sinirsel bozuklukların sayısı artmaya devam etmiştir. Derin Beyin Stimülasyonu ilk esansiyel tremor 6 için bir tedavi olarak Amerika Birleşik Devletleri'nde kullanıldı. Bugün ameliyat halen farmakolojik müdahale ile tedavi edilemez olan nöronal bozuklukların tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. DBS anda, Parkinson hastalığı ve distoni 7-9 hareketi bozuklukları tedavi etmek için kullanılmıştır. Alzheimer tipi demans, Huntington hastalığı, epilepsi, ağrı ve nöropsikiyatrik hastalıklar, depresyon, obsesif kompulsif bozukluk, Tourette sendromu,7 sendromu ve bağımlılık DBS 10-12 ile tedaviye uygun koşullar bazılarıdır. DBS cerrahi FDA Parkinson hastalığı, distoni ve temel titreme tedavisi için onaylanmıştır birlikte, yukarıda sözü edilen diğer durumların tedavisi için DBS kullanılması, hastaların 13,14 çok umut vermektedir laboratuar çeşitli aşamalarında ve klinik çalışmalar bulunmaktadır.

Klinik, DBS cerrahi iki aşamada yapılır. Birinci aşama cerrahi radyolojik konumlandırma bir arada kullanarak hedeflenen anatomik konumda DBS elektrotlar konumlandırma içerir, CT, MRI yanı sıra gelişmiş hassasiyet için mikroelektrot okumaları. İkinci aşama, hastanın üst göğüste bir darbe jeneratörü implante içerir ve yükleme uzatma darbe jeneratör derisi açar. Nörolojik durumuna göre, darbe üreteci için birçok programlama düzenleri standardize edilmiş ve istenen gerilim teslim kullanılacaktır. Son volMinimal gerilimi 15 ile en iyi klinik yanıt alacak şekilde tage kademeli bir şekilde ulaşılır. Ancak, bizim çalışmalarda, kronik DBS implantların aksine basitlik uğruna, klinik olarak kullanılan, bizim hayvan modellerinde (1 saat), bir defalık yüksek frekanslı stimülasyon okuyan başvurdular.

Bizim grubun araştırma Parça tedaviye dirençli epilepsi için DBS cerrahisi kullanımını araştıran üzerinde duruluyor. Yüksek frekanslı stimülasyon ile Stereotaktik cerrahi yaklaşımlar epilepsi 10,16,17 tüm insidansı yaklaşık% 30'unu oluşturmaktadır medikal-dirençli epilepsi tedavisi için etkili bir seçenek olarak diğerleri tarafından incelenmiştir. Derin serebellar çekirdekler hem de kortikal yüzey hedefleme serebellar uyarım epilepsi 10,18,19 tedavisi için hedef olarak geçmişte kullanılmıştır. Buna ek olarak, hipokampus uyarımı da denedim ama karışık sonuçlar 20,21 ile olmuştur. Diğer Bazı incelenmiştirEpilepsi için DBS hedefleri serebral korteks, talamus, subtalamik nukleus ve vagus siniri 8 bulunmaktadır. Ancak, son birkaç yıl içinde çeşitli çalışmalar aşağıdaki sonuçları, ön talamik nükleus (ATN) epilepsi tedavisi 10,22 için en yaygın DBS hedef olarak ortaya çıkmıştır. Nöroanatomik devresi ve hayvan modellerinde elde edilen bulgular hakkında bilgilere dayanarak, çeşitli çalışmalar epilepsi 23-26 tedavisinde ATN derin beyin stimülasyonu tedavi edici etkisi üzerinde yoğunlaşmıştır. ATN limbik devrenin parçasıdır ve nöbet sıklığı etki beyin bölgesinde yer almaktadır. Tarafından Hamani ark. Çalışmalar, bir pilokarpin kaynaklı epilepsi modelinde ATN-DBS etkinliğini test edilmiş ve ikili ATN stimülasyon pilokarpin kaynaklı nöbetler ve status epileptikus 24 gecikmeleri uzamış bulduk. Ayrıca, ATN yüksek frekanslı stimülasyon ep bir Pentilentetrazol (PTZ) modelinde nöbet sıklığını azaltmak için bulunmuştur25,27-29 ilepsy. Lee ve ark., Geçmeyen kısmi epilepsi 30 iyileştirilmesinde ATN kronik derin beyin uyarımı üzerine yaklaşık% 75 nöbet sıklığında ortalama azalma bildirilmiştir.

Tedaviye dirençli epilepsi üzerine yeni bir klinik çalışmada ön talamik nükleus (ATN) 22 hedef DBS ameliyat sonrası umut verici sonuçlar göstermiştir. Tedaviye dirençli epilepsi (SANTE deneme) için ATN ikili DBS uygulanan 110 hasta ile bir çok merkezli randomize klinik çalışma yaklaşık% 40 31 kadar nöbet sıklığında bir düşüş göstermiştir. Bu çalışmanın sonuçları da 2-3 ay sonra ameliyat gözlenen gecikmiş optimum bir anti-epileptik etkisi ima etti. Toda ve arkadaşları tarafından ileri çalışmalar., Onlar hayvan modellerinde 1 bir sonraki zaman sonrası DBS (gün 3-5) oluyor nörogenezi gösterdi nerede bu bulgular ile doğrulanmıştır. Buna ek olarak, Encinas ve diğ., Hipokampal neurogene bildirmiştirATN 32 yüksek frekanslı stimülasyon sonra erişkin fare dentat girus sis. Önceki çalışmalar 33-35 gibi kronik temporal lob epilepsisi ve öğrenme açıkları ile bir dernek, hafıza bozukluğu ve spontan tekrarlayan nöbetler motorlu gibi bazı epileptik durumlarda hipokampal nöron düşüş bildirdi. Ayrıca, bu tür hayvan modelleri 33 kronik epileptik hipokampus FGF2 ve IGF-1 nöral kök hücre progenitör faktörleri bir azalma oldu. Bu göz önüne alındığında, dentat girus nöron bir büyüklüğe göstermek gibi DBS gibi girişimsel stratejileri araştırma için heyecan verici yollar vardır. Bu bulgular epilepsi mekanizması altında yatan nöron sonrası DBS tedaviye daha derinden keşfetmek için bizi teşvik etmiştir. Biz (temsilci sonuçlarında) (veri rapor değil) yanı sıra ikili hem tek taraflı ATN hedefli ve sıçan dentat girus görülen yüksek nörotrofın (BDNF) ifadesi var. Bizim ceçerli hipotezi BDNF ifadesi DBS cerrahi anti-epileptik etkisi çevirir nöron ile sonuçlanacak bir gen ifadesi zincirini başlatır olmasıdır. Bu yazıda, DBS faydalarını altında yatan mekanizma çalışmak için cazip bir yaklaşım olarak gen ifadesi analizi ile takip sıçanlarda ATN hedefleyen DBS ameliyat için bizim yöntemleri sunuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Etik Açıklama: Bu yazıda ele tüm işlemler (Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu için) Hayvan Araştırma NIH kurallarına uygun ve Harvard Tıp Fakültesi IACUC Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Ön cerrahi hazırlanması

  1. Tüm cerrahi aletler ya otoklav ile veya gerektiğinde antiseptik solüsyon ve / veya etanol ile temizlik sterilize emin olun. Mümkünse, bu tür neşter, iğne ve şırıngalar gibi steril tek kullanımlık ekipman kullanın.
  2. Cerrahi örtüler ile tezgah Kapak ve mevcut bir biyolojik tehlikeli atık bertaraf var olduğundan emin olun.
  3. Sıçan tartılır ve anestezi dozu hesaplamak. Fareler uyutmak için Ketamin / Ksilazin karışımı (Ketamin 75 mg / kg ve Xylazine 10 mg / kg) kullanın.
    Not: 200-250 gr stereotaktik çerçeve içinde hayvanın uygun sabitleme için hem de ATN tam bir hedeflemenin yapılması için en uygun ağırlık arasında. Isoflurane da anestezi maddesi olarak kullanılabilir.
  4. Dağı ve güvenli iki steril elektrotlar elektrot tutucu üzerine (otoklav veya etilen oksit ile sterilize) stereotaktik cerrahi çerçeve ve bir mikroskop (10-40X büyütme) yardımı ile (Şekil 2), düzgün için elektrodun ipuçları incelemek hizalama. İki elektrotlar arayla 3,0 mm sabitleyin.
    NOT: sert yüzeylere dokunarak elektrot ucu zarar vermemek için özen gösterin.

2. DBS Cerrahisi

  1. Ketamin / Xylazine hayvana intraperitoneal karıştırın ve hayvan (ayak-tutam refleks, solunum hızı ve derinliği ve solunum düzenliliği kontrol ederek) anestezi cerrahi uçağı ulaştığını teyit enjekte. Çizi edilecek kafa derisi bölgesinden saç çıkarın ve her Betadin ve alkol ya da steril serum fizyolojik ya 3 alternatif scrubs ile kafa derisi dezenfekte edin. Güvenli ve stereotaktik Fram üzerinde hayvan yerleştirinör.
  2. Optimal düzeyde hayvanın vücut ısısını korumak için dolaşan sıcak su yastıkları kullanın. Aşırı kurumasını korumak için hayvanın gözlerine göz yağlayıcı.
  3. Anterioposterior -1.6 mm, mediyolateral 1,5 mm ve 5,2 mm 1 dorsoventral aşağıdaki stereotaktik ATN (anterior talamik çekirdek) hedefleme için koordinat kullanın.
    NOT: stereotaktik koordinatlar Paxinos ve Watson (6 th edition) sıçan beyin atlas 36 dayanmaktadır.
  4. Kafa derisi bir kesi sagittally kafatasını ortaya olun. Retraktörler bir çift kazıma derisi güvenceye kullanma kafatası ortaya çıkarmak. Kesi temizlemek için steril tuzlu su kullanın. Kesi çok ıslak ise, kurumaya steril pamuklu bezlerden kullanın. Bregma bulun ve siyah marker ile işaretleyin. Coron sagital sütür ve 1,6 mm posterior mediolaterally her iki tarafta yaklaşık 1.5 mm iki işaretleri yapmak, çapak delik konumunu rehberlik etmekal sütür.
  5. Çapak delik yapmak için bir el matkabı kullanın. Çapak delik ucu etanol ile sterilize steril olduğundan emin olun. Delerken kafatası yüzeyine 45 ° yaklaşık bir açıyla matkap tutun. Sıkça herhangi bir çapak delik yerde aşırı ısı önlemek için iki çapak delik arasındaki geçiş.
  6. Dura maruz kadar sondaj devam edin. Ucu bükülmüş bir 'L' şeklini andıran bir iğne kullanarak, elektrot ekleme engel olur kemik herhangi bir kırık parçalarını çıkartın. Bükülmüş bir iğne kullanılarak kemik parçaları çıkarırken yatan dura ve / veya beyin dokusu zarar vermemek için özen gösterin.
    NOT: Bir körleşmiş iğne veya ince künt forseps kullanarak da bir seçenektir.
  7. Stereotaktik çerçeve dönen sapa çift elektrot düzeneğini Fix ve 90 ° açıyla kolu sabitleyin. Stereotaktik çerçeve ayarlamaları kullanarak, tam bregmadan yukarıda sol elektrot yerleştirin.
  8. Stereo kullanmataktik ayarlamalar mediyolateral konumlandırma için, tam şimdi mükemmel koronal sütür boyunca hizalanmış iki elektrot vardır ama bregmadan mediolaterally 1,5 mm aralıklı şekilde bregmadan sol tarafına sol elektroda 1.5 mm hareket.
  9. Anterioposterior stereotaktik ayarlamalar kullanarak, koronal sütür elektrotlar 1,6 mm posterior taşıyın.
  10. Çapak çapak delik delik kaba kenarları dokunmadan, elektrotlar kolaylıkla eklenebilir böyle doğru yerde yapılmış ise ilk onay için elektrotlar düşürmek için dorsoventral ayarlamaları kullanın. Bu durumda, kafatasının yüzeyine 5.2 mm derinliğe kadar elektrotlar yerleştirin.
  11. 130 Hz ayarlanmış bir uyarıcısı, 2.5 V ve 90 mikro saniye pulsewidth 1 açar aracılığıyla elektrotlar bağlayın.
  12. Bir saat süre ile yüksek frekans uyarımı teslim (veya deney sisteminde göre istenen bir zaman periyodu için). Stimülasyon sırasında, s sağlamak unutmayındüzenli bir ayak tutam yanıt olarak ayak çekilmesi yokluğu kontrol ederek roper anestezi derinliği. Anestezi ikna etmek için kullanılan yaklaşık yarısı ilk dozu ile anestezi Supplement. Anestezi derinliği kontrol ederken senin steril eldiven kirlenmesini önlemek ve gerekirse bunları değiştirin. Kişinin deneysel ihtiyaçlarına göre tek veya çift taraflı uyarımı gerçekleştirin. Gibi düşük frekanslı stimülasyon gibi kontrolleri (eg., 10 Hz) ve (sonradan stimülasyon ile elektrotlar yerleştirerek) uyarılmamış hayvanlar dahil.
  13. Stimülasyon yapıldıktan sonra, dikkatlice elektrotlar kaldırmak ve 3-0 dikiş ile veya steril cerrahi zımba ile kesi dikiş.
  14. Deri altına analjezi olarak buprenorfin (0.05 mg / kg) uygulayınız. Normal aktiviteye dönene kadar hayvan Monitör ve ardından konut tesisine geri.
  15. Deneysel tasarım dayalı zaman belirli bir süre sonra (örneğin, 0, 3, 6 veya 12 saat sonrası DBS cerrahisi), Anestezi doz aşımı ile hayvan euthanize. Vital bulguların yokluğu onayladıktan sonra, hayvan başını kesmek.
  16. İlk makas kullanılarak cilt kaldırarak beyin parçalara ayır. Diseksiyon makas kullanarak sagital sütür boyunca kemik kesti. Her iki yan tarafta kemik yoluyla iki kesiler (yaklaşık bir inç her) yapın. Forseps kullanarak, beyin maruz kafatasının üst kemik kısmen kopmuş parça kaldırın.
  17. Ince makas veya forseps kullanarak, kafatası beyni yerinden ve buz üzerinde soğuk PBS ile bir Petri kabı transfer.
    NOT: kemiğin içinden kesiler yaparken beyne zarar vermemek için özen gösterin.

3. Hippocampus İzolasyon

NOT: buz üzerinde bu bölümdeki tüm sonraki adımları uygulayın.

  1. Buz üzerinde önceden soğutulmuş bir akrilik beyin matrisi üzerinde beyin yerleştirin. Bir jilet kullanarak, ön-çoğu ed gelen koronal yaklaşık 7-8 mm beyin kesmekbeyin ge. Ilk kesme ikinci koronal kesme ve posterior yapmak şekilde yaklaşık 5 mm kalınlığında beyin kesiti çıkarılabilir.
  2. Buz soğukluğunda PBS ile bir petri tabağına beyin dilim aktarın. Jilet kullanarak, iki yarım küre bölümleri sever ve sırasıyla sol ve sağ taraflarına karşılık gelen hemisfer dikkat etmeye özen gösterin. Tek taraflı uyarılmalara yaparken bu özellikle önemlidir.
  3. Ince forseps ve makas kullanılarak dikkatli bir şekilde hipokampus çıkarın.
  4. Flaş sonraki RNA ekstraksiyon adımlar için hazır olana kadar -20 ° C derin dondurucuda kuru buz ve mağaza hipokampal doku dondurma.
    NOT: Uzun süreli depolama için, -80 ° C derin dondurucuda saklamak doku önerilir.

4. RNA Ekstraksiyon ve Kantitatif PCR

  1. Doku homojenizasyon için hazır olana kadar kuru buz dondurulmuş kalır emin olun.
  2. NOT: kaputu bu adımı gerçekleştirin.
    1. Hipp Tri reaktif 1 ml ekleyinDoku küçük parçalar halinde kırılır kadar 1,5 ml santrifüj tüpü içinde ocampal doku ve birinci pipetleme birden çok kez de homojen hale getirilir. Ayrıca görünür hiçbir kırılmamış doku kalmayıncaya kadar bir 25 G iğne ile bir şırınga geçerek doku homojenize. Buz üzerinde homojenleştirme adımları uygulayın.
    2. Doku homojenize edildikten sonra, hücre parçalanmasını sağlamak için hücre süspansiyonu, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
      NOT: Bu noktadan sonra, hücre süspansiyonu dondurulmuş ve daha sonra işlenene kadar -70 ° C'de saklanır hızlı olabilir.
  3. 0.2 mi kloroform eklenir ve 20 saniye boyunca vorteks ile karıştırın ve 15 dakika için oda sıcaklığında çözelti dinlendirin.
  4. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de örnekleri santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, görünür olacak üç ayrı katmanları bozmadan dikkatlice tüpleri çıkarın.
    NOT: Alt (kırmızı) faz proteinleri içeren, orta bulutlu faz DNA içerir ve üst berrak faz R içeriyorNA.
  5. Yeni bir 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpüne, berrak fazı (RNA) aktarın (tipik olarak faz ihtiva eden RNA, 500 ul elde edilir). Buna, 0.5 ml izopropanol ilave edildi ve vorteks yoluyla karıştırılır. Buna RNA için taşıyıcı olarak 2-3 ul glikojen (20 mg / ml) ilave edilmektedir. Örnek 10 dakika süreyle oda sıcaklığında masaya dinlenmeye bırakın.
  6. 4 ° C'de 1 saat süre ile 12,000 x g'de santrifüjleyin. RNA pelet tüpün alt kısmında görünür olduğundan emin olun.
  7. Süpernatantı atın ve% 75 etanol 1 ml ekleyerek RNA pelet yıkayın (nukleaz ücretsiz su ile yapılan). Topak, tüp altından boşaltır ve çözelti içinde yüzer kadar örneği, birden çok kez ters yüz edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12,000 x g'de çözeltisi santrifüjleyin.
    Not:% 75 etanol içinde topak daha başka aşamalar kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
  8. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca açık tüpler bırakarak kuru hava RNA pelet izin verir. Ove önlemek için önlem alınBu sonraki aşamada su içinde çözülmesini etkileyebilecek olarak Pelet kurutulduktan r.

5. RNA Hazırlık DNA Çıkarma

  1. RNA pelet nükleaz ücretsiz su 9 ul ekleyin ve pelet tüp hafifçe karıştırın geçmeden önce çözülür emin olun. Bu 10x Dnaz i Tampon 1 ul, 1 ul (DNase I kit) yeniden birleştirici DNase eklemek için, kısa bir süre için, hafifçe tüpler hafifçe vurarak karıştırın tüpleri spin ve 30 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C'de inkübe edin.
  2. Örnek (DNase I kit) 2 ul DNaz inaktivasyonu reaktif ilave edin ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tüp hafifçe iterek genellikle karıştırın. Yeni bir 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpüne, 10 dakika ve Üstte yüzen berrak madde içinde yaklaşık 10 ul transfer için 12,000 x g'de santrifüjleyin.
  3. Bir Nanodrop veya spektrofotometre kullanılarak RNA konsantrasyonu ölçün.

6. RNA'dan cDNA yapmak

  1. Gerekli hacim th ekleRNA 1 ug içerir ve nükleaz ücretsiz su ekleyerek 8 ul toplam hacmi getirmek de. Buna 1 ul 10 mM dNTP karışımı Superscrıpt içine First Strand Synthesis Kit rasgele heksamerlerin 1 ul ekle. Yavaşça karıştırın ve ya bir su banyosunda ya da bir önceden-programlanmış bir ısıl üzerinde 5 dakika boyunca 65 ° C sıcaklıkta inkübe edilir.
  2. 10x RT tampon maddesi, 25 uM MgCl2, 0.1 M DTT ve 2 ul RNaz OUT 1 ul (40 U / ul), 4 ul 2 ul: Aşağıdaki reaktifler içeren bir ön-karışım hazırlanması.
    NOT: Verilen Birimleri reaksiyon başına, kullanıcı kişinin deneysel ihtiyaçlarına göre büyütmek gerekir.
  3. 65 ° C ila örneğini içeren RNA çıkardıktan sonra, bir dakika süre ile, oda sıcaklığında tüp ayarlayın. 9 ul ön-karışım çözeltisi ilave edin ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Superscript II ters transkriptaz enzimi ve 1 ul (50 U / ul) ilave edilir ve daha sonra 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. 50 için 42 ° C'de inkübe edinen az bir ters transkripsiyon gerçekleşmesi için.
  5. 15 dakika reaksiyonu sona erdirmek için 70 ° C'de inkübe edin.
  6. Buz örnekleri kısaca yerleştirin ve 1 ul RNaseH (2 U / ml) ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  7. Kısaca yoğuşma sıvı aşağı dönmeye 3.000 xg'de tüpler santrifüj.
    NOT: Bu kantitatif PCR için kullanılacak cDNA'dır. cDNA kurulumu kadar -20 ° C'de derin dondurucuda saklanabilir. cDNA, PCR ile devam etmeden önce, nükleaz içermeyen su ile seyreltilebilir.

7. Kantitatif PCR

  1. Takip eden maddeler içeren bir ana karışım (verilen miktarlar reaksiyon başına olan) İmalat: 2x SYBR Yeşil Mix 6.3 ul ileri primer (10 uM), 0.6 ul ters Primer (10 uM), 0.6 ul Nükleaz serbest su, 0.5 ul .
    NOT: Primer tasarımı kullanılarak yapıldı ilgi geni için NCBI nükleotid dizisi sayfasında seçeneği 'Primer seçin'.
  2. 96 iyi-PCR plakanın her oyuğuna 10 ul Mastermix ekleyin. Daha önce de MasterMix içeren yapılan cDNA 2.5 ul ekleyin. Her bir numune için üç PCR reaksiyonları kurmak için emin olun.
  3. Master ve cDNA eklenmesi tamamladıktan sonra, kuyu mühür bir optik yapışkan sayfasını kullanarak PCR plaka kapsamaktadır. Kuyunun dibine tüm sıvı yerleşmek için bir masaüstü santrifüj 500 xg'de 5 dakika boyunca kısaca plaka Spin.
  4. Önceden programlanmış RT-PCR makine üzerine PCR plakasını yükleyin. Tablo 1'de verilmiştir PCR parametrelerini kullanın.
  5. Veri analizi: diğer hesaplamalar için qPCR çıkışından Cı t değerleri kullanın. İç kontrol genleri için PCR reaksiyonları ayarlanmış test geni ile birlikte, 18S rRNA ve β-aktin (negatif kontrol) (eşit giriş temin etmek üzere). ΔΔCt yöntemi 37 göre kat değişiklik hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1A ve 1B, kontrol geni β-aktin için BDNF ve GABRD izafi ifadesi olduğunu gösterir. BDNF, bir nörotrofinin genellikle birçok nöronal hastalıklar 38-41 nöroprotektif etkileri ile ilişkilidir. Epileptik hastalara terapötik fayda sağlar ATN uyarılmaya yanıt olarak BDNF tanımlama profili analiz etmek ilginçtir. Belirtilen zaman noktalarında BDNF gen ifadesi profilini gösterir Şekil 1A DBS stimülasyon sonrası, BDNF up-regülasyonu 3 saatte (uyarılmamış kat dah...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Benabid ark dönüm çalışmanın ardından. Parkinson hastalığı ve esansiyel tremor tedavisi için derin beyin stimülasyonu kullanarak, DBS cerrahi teknik, birçok nörolojik bozukluklar 6,10,43 tedavisinde son on yılda çok ilgi ile incelenmiştir. Beyin devrelerinin çeşitli nöro-anatomik bölgeleri hedefleyen DBS çalışmalar halen büyük bir sinirsel hastalıklar ele için birçok gruplar tarafından gerçekleştirilen ve klinik çalışmaların çeşitli aşamalarında içindedirler. Subtalamik çekirdek (STN) veya g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NREF vakfının desteği için minnettarız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Derin Beyin Stimülasyonu Cerrahisi
Stereotaktik çerçeveKopf Instruments Model900
Matkap Dremmel7700, 7.2 V
NeşterBD372610
KetaminPatterson Veteriner07-803-6637Çizelge III Kurumsal kurallara göre kontrollü madde, tedarik, kullanım ve depolama
XylazinePatterson Veteriner07-808-1947
BuprenorfinPatterson Veteriner07-850-2280Çizelge III Kurumsal kurallara göre kontrollü madde, tedarik, kullanım ve depolama
Cerrahi zımbalarConMed Corporation8035
Sütürler (3-0) Harvard Aparatı72-3333
Şırınga (1 ml, 29 1/2 G)BD329464Steril, intraperitoneal anestezi uygulaması için kullanın
Şırınga (3 ml, 25 G)BD309570Steril, deri altından Analjezi uygulaması için kullanın
İğnelerBD305761Steril, çapak deliklerinden kırık kemik parçalarını temizlemek için kullanın
EtanolBalıkçısı BilimselS25309BGenel sterilizasyon için kullanın 
Göz YağlayıcıFisher Scientific19-898-350
StimülatörMedtronicModel 3628
DBS elektrotlarRhodes Medical Instruments, CASNEX100x-100 mmElektrotlar platin, konsantrik ve bipolar
Betadin (Povidon-İyot) PDIS23125Tek kullanımlık swabsticks, insizyon yapmadan önce kafa derisini sterilize etmek için kullanın 
  Beyin Diseksiyonu ve Hipokampal doku izolasyonu
Akrilik Kemirgen Beyin Matrisi ElektronMikroskobu Bilimleri175-300www.emsdiasum.com
Tıraş BıçağıV W R55411-050
Giyotin MakasClauss18039Kafa kesme için bu makasların temiz ve çalışır durumda tutulduğundan emin olun
MakasCodman Klasik34-4098Beyni kafatasından çıkarmak için kullanın
ForsepsElektron Mikroskobu Bilimleri72957-06Beyni kafatasından çıkarmak ve diseksiyon sırasında kullanmak için kullanın
Fosfat Tamponlu Salin Boston Biyo ÜrünleriBM-220
  RNA Ekstraksiyonu ve cDNA Hazırlama
Tri ReaktifSigmaT9424Daima çeker ocakta kullanın ve kullanım sırasında koruyucu gözlük takın; cilt ile temasından kaçının
Şırınga (3 ml, 25 G)BD309570Doku homojenizasyonu için kullanın
KloroformFisher ScientificBP1145-1Daima çeker ocakta kullanın ve kullanırken koruyucu gözlük takın; ile temastan kaçının cilt
İzopropanolFisher ScientificA416-1
GlikojenThermo ScientificR0561
Dnase I KitiAmbionAM1906
Üst Simge İlk İplik Sentez KitiInvitrogen11904-018
Masaüstü MikrosantrifüjEppendorf5415D
ve nbsp; Kantitatif PCR                           
SYBR Yeşil PCR KitiQiagen204143
Özel OligosInvitrogen10668051
PCR Plakaları (96 kuyu)Denville ScientificC18080-10
Optik Yapışkan LevhalarThermo ScientificAB1170
Nükleaz içermeyen SuThermo ScientificSH30538-02
Gerçek Zaman PCRMakinesi Uygulamalı Biyosistemler7500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of. 108, 132-138 (2008).
  2. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual review of neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  3. Bergstrom, M. R., Johansson, G. G., Laitinen, L. V., Sipponen, P. Electrical stimulation of the thalamic and subthalamic area in cerebral palsy. Acta physiologica Scandinavica. 67, 208-213 (1966).
  4. Benabid, A. L., et al. Chronic electrical stimulation of the ventralis intermedius nucleus of the thalamus as a treatment of movement disorders. Journal of neurosurgery. 84, 203-214 (1996).
  5. Benabid, A. L., et al. Long-term electrical inhibition of deep brain targets in movement disorders. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 13, Suppl 3. 119-125 (1998).
  6. Benabid, A. L., et al. Long-term suppression of tremor by chronic stimulation of the ventral intermediate thalamic nucleus. Lancet. 337, 403-406 (1991).
  7. Tierney, T. S., Lozano, A. M. Surgical treatment for secondary dystonia. Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 27, 1598-1605 (2012).
  8. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta neurochirurgica. Supplement. 117, 87-92 (2013).
  9. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation emerging indications. Progress in brain research. 194, 83-95 (2011).
  10. Sankar, T., Tierney, T. S., Hamani, C. Novel applications of deep brain stimulation. Surgical neurology international. 3, S26-S33 (2012).
  11. Tierney, T. S., Vasudeva, V. S., Weir, S., Hayes, M. T. Neuromodulation for neurodegenerative conditions. Frontiers in bioscience. 5, 490-499 (2013).
  12. Mayberg, H. S., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Neuron. 45, 651-660 (2005).
  13. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic proceedings. 86, 662-672 (2011).
  14. Ch. 4. Rehabilitation in movement disorders. Lansek, R., Morris, M. E. , Cambridge University Press. 36-43 (2013).
  15. Goodwin, R., Tierney, T., Lenz, F., Anderson, W. Ch. 15. Single Neuron Studies of the Human Brain: Probing Cognition. Fried, I., Rutishauser, U., Cerf, M., Kreiman, G. 15, MIT Press. 275-293 (2014).
  16. Hauser, W. A. Epidemiology of epilepsy in children. Neurosurgery clinics of North America. 6, 419-429 (1995).
  17. Hauser, W. A. Recent developments in the epidemiology of epilepsy. Acta neurologica Scandinavica. Supplementum. 162, 17-21 (1995).
  18. Davis, R., Emmonds, S. E. Cerebellar stimulation for seizure control: 17-year study. Stereotactic and functional neurosurgery. 58, 200-208 (1992).
  19. Levy, L. F., Auchterlonie, W. C. Chronic cerebellar stimulation in the treatment of epilepsy. Epilepsia. 20, 235-245 (1979).
  20. Velasco, A. L., et al. Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia. 48, 1895-1903 (2007).
  21. Tellez-Zenteno, J. F., McLachlan, R. S., Parrent, A., Kubu, C. S., Wiebe, S. Hippocampal electrical stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Neurology. 66, 1490-1494 (2006).
  22. Kerrigan, J. F., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of the thalamus for the treatment of intractable epilepsy. Epilepsia. 45, 346-354 (2004).
  23. Hamani, C., et al. Deep brain stimulation of the anterior nucleus of the thalamus: effects of electrical stimulation on pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Epilepsy research. 78, 117-123 (2008).
  24. Hamani, C., et al. Bilateral anterior thalamic nucleus lesions and high-frequency stimulation are protective against pilocarpine-induced seizures and status epilepticus. Neurosurgery. 54, 191-195 (2004).
  25. Mirski, M. A., Rossell, L. A., Terry, J. B., Fisher, R. S. Anticonvulsant effect of anterior thalamic high frequency electrical stimulation in the rat. Epilepsy research. 28, 89-100 (1997).
  26. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the mammillothalamic tract prevents seizures in guinea pigs. Science. 226, 72-74 (1984).
  27. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamic mediation of generalized pentylenetetrazol seizures. Brain research. 399, 212-223 (1986).
  28. Mirski, M. A., Ferrendelli, J. A. Interruption of the connections of the mammillary bodies protects against generalized pentylenetetrazol seizures in guinea pigs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 7, 662-670 (1987).
  29. Mirski, M. A., McKeon, A. C., Ferrendelli, J. A. Anterior thalamus and substantia nigra: two distinct structures mediating experimental generalized seizures. Brain research. 397, 377-380 (1986).
  30. Lee, K. J., Jang, K. S., Shon, Y. M. Chronic deep brain stimulation of subthalamic and anterior thalamic nuclei for controlling refractory partial epilepsy. Acta neurochirurgica. Supplement. 99, 87-91 (2006).
  31. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
  32. Encinas, J. M., Hamani, C., Lozano, A. M., Enikolopov, G. Neurogenic hippocampal targets of deep brain stimulation. The Journal of comparative neurology. 519, 6-20 (2011).
  33. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of disease. 17, 473-490 (2004).
  34. Kuruba, R., Hattiangady, B., Shetty, A. K. Hippocampal neurogenesis and neural stem cells in temporal lobe epilepsy. Epilepsy & behavior : E&B. 14, Suppl 1. 65-73 (2009).
  35. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5. 26-41 (2008).
  36. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Elsevier Inc. (2007).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT Method. METHODS. 25, 402-408 (2001).
  38. Kells, A. P., et al. AAV-mediated gene delivery of BDNF or GDNF is neuroprotective in a model of Huntington disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 9, 682-688 (2004).
  39. Han, B. H., Holtzman, D. M. BDNF protects the neonatal brain from hypoxic-ischemic injury in vivo via the ERK pathway. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 20, 5775-5781 (2000).
  40. Hetman, M., Kanning, K., Cavanaugh, J. E., Xia, Z. Neuroprotection by brain-derived neurotrophic factor is mediated by extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase. The Journal of biological chemistry. 274, 22569-22580 (1999).
  41. Stadelmann, C., et al. BDNF and gp145trkB in multiple sclerosis brain lesions: neuroprotective interactions between immune and neuronal cells. Brain : a journal of neurology. 125, 75-85 (2002).
  42. Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42, Suppl 3. 8-12 (2001).
  43. Benabid, A. L., Pollak, P., Louveau, A., Henry, S., de Rougemont, J. Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease. Applied neurophysiology. 50, 344-346 (1987).
  44. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of. 68, 521-534 (2010).
  45. Tierney, T. S., Abd-El-Barr, M. M., Stanford, A. D., Foote, K. D., Okun, M. S. Deep brain stimulation and ablation for obsessive compulsive disorder: evolution of contemporary indications, targets and techniques. The International journal of neuroscience. 124, 394-402 (2014).
  46. Kennedy, S. H., et al. Deep brain stimulation for treatment-resistant depression: follow-up after 3 to 6 years. The American journal of psychiatry. 168, 502-510 (2011).
  47. Lozano, A. M., et al. Subcallosal cingulate gyrus deep brain stimulation for treatment-resistant depression. Biological psychiatry. 64, 461-467 (2008).
  48. Ackermans, L., et al. Double-blind clinical trial of thalamic stimulation in patients with Tourette syndrome. Brain : a journal of neurology. 134, 832-844 (2011).
  49. Houeto, J. L., et al. Tourette's syndrome and deep brain stimulation. Journal of neurology, neurosurgery, and psychiatry. 76, 992-995 (2005).
  50. Maciunas, R. J., et al. Prospective randomized double-blind trial of bilateral thalamic deep brain stimulation in adults with Tourette syndrome. Journal of neurosurgery. 107, 1004-1014 (2007).
  51. Koning, P. P., Figee, M., van den Munckhof, P., Schuurman, P. R., Denys, D. Current status of deep brain stimulation for obsessive-compulsive disorder: a clinical review of different targets. Current psychiatry reports. 13, 274-282 (2011).
  52. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular psychiatry. 15, 64-79 (2010).
  53. Muller, U. J., et al. Successful treatment of chronic resistant alcoholism by deep brain stimulation of nucleus accumbens: first experience with three cases. Pharmacopsychiatry. 42, 288-291 (2009).
  54. Zhou, H., Xu, J., Jiang, J. Deep brain stimulation of nucleus accumbens on heroin-seeking behaviors: a case report. Biological psychiatry. 69, e41-e42 (2011).
  55. Porta, M., et al. Thalamic deep brain stimulation for treatment-refractory Tourette syndrome: two-year outcome. Neurology. 73, 1375-1380 (2009).
  56. Younce, J. R., Albaugh, D. L., Shih, Y. Y. Deep brain stimulation with simultaneous FMRI in rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , e51271(2014).
  57. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature reviews. Genetics. 10, 669-680 (2009).
  58. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature methods. 5, 829-834 (2008).
  59. Fiore, R., Siegel, G., Schratt, G. MicroRNA function in neuronal development, plasticity and disease. Biochimica et biophysica acta. 1779, 471-478 (2008).
  60. Hebert, S. S., De Strooper, B. Alterations of the microRNA network cause neurodegenerative disease. Trends in neurosciences. 32, 199-206 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Deep Brain StimulationAnterior Thalamic NucleusGene ExpressionRat HippocampusStereotactic SurgeryRNA IsolationQuantitative RT PCRBDNF ExpressionGABA ReceptorNeuroprotection

Related Articles