Uyanık Sıçanlarda Intra-Oral tat yoğunluğu arttırıcı madde İdaresi Sırasında Hızlı Tarama Dönüşümlü Voltametri Rapid Dopamin Dynamics incelenmesi

Özet

Hücre dışı dopamindeki (DA) hızlı dalgalanmalar, memelilerde hem ödül işlemeye hem de motive edilmiş davranışa aracılık eder. Bu el yazması, tastantların uyanık, serbestçe hareket eden sıçanlarda hızlı dopamin salınımını nasıl değiştirdiğini belirlemek için hızlı taramalı döngüsel voltametri (FSCV) ve ağız içi tatır uygulamasının birlikte kullanımını açıklamaktadır.

Özet

Memeli beynindeki hızlı, fazik dopamin (DA) salınımı, ödül işleme, pekiştirmeli öğrenme ve motivasyonel kontrolde kritik bir rol oynar. Hızlı taramalı döngüsel voltametri (FSCV), çeşitli preparat türlerinde fazik DA salınımını incelemek için kullanılan, yüksek uzamsal ve zamansal (saniyenin altında) çözünürlüğe sahip bir elektrokimyasal tekniktir. Tek hücreli ve beyin dilimlerinde in vitro deneyler ve anestezi uygulanmış kemirgenlerde in vivo deneyler, normal koşullar altında ve hastalık modellerinde dopamin salınımına ve alımına aracılık eden mekanizmaları tanımlamak için kullanılmıştır. Son 20 yılda, uyanık, serbestçe hareket eden kemirgenlerde yapılan in vivo FSCV deneyleri, ödül işleme ve ödül öğrenmede dopaminerjik mekanizmalar hakkında da bilgi sağlamıştır. Uyanık, serbestçe hareket eden hazırlığın en büyük avantajlarından biri, belirli davranışsal olaylara veya ödül veya işaret sunumuna zaman kilitli hızlı DA dalgalanmalarını inceleme yeteneğidir. Bununla birlikte, birleşik davranış ve voltametri deneylerinin bir sınırlaması, birincil ödüllendirici veya caydırıcı uyaranlara özgü DA etkilerini, ödüle yönelik veya diğer motor davranışlara aracılık eden birlikte meydana gelen DA dalgalanmalarından ayırmanın zorluğudur. Burada, oral tatantlara DA yanıtlarını doğrudan araştırmak için uyanık bir sıçanda in vivo FSCV ve intra-oral infüzyon kullanan kombine bir yöntemi tarif ediyoruz. Bu deneylerde, oral tatlar doğrudan farenin damağına infüze edilir - ödüle yönelik davranış ve gönüllü içme davranışı atlanarak - tastant uyaranlara DA yanıtlarının doğrudan incelenmesine izin verir.

Giriş

Fazik DA salınımı, ödüle yönelik davranışa aracılık etmede önemli bir rol oynar ^[1-3]. Bununla birlikte, birincil bir ödülün fazik DA salınımını nasıl değiştirdiğini izole etmek ve incelemek, genellikle fazik DA salınımını da değiştirebilen birlikte ortaya çıkan davranışsal veya bilişsel süreçler tarafından karmaşıklaştırılır - örneğin ödülü elde etmek için karar verme süreçleri veya ödüle yönelik motor davranış gibi. Mevcut çalışmada, intraoral kanüller yoluyla tastant iletimi ile birlikte in vivo hızlı taramalı döngüsel voltametri (FSCV) kullanarak tatlara fazik DA yanıtlarını izole ediyoruz. Bu teknik, seçim ve eylemi atlar ve bir tastın bir sıçanın damağına doğrudan infüzyonu sırasında hücre dışı DA salınımını incelememize izin verir.

FSCV, saniyenin altında bir ölçekte (10 Hz çözünürlük) ayrı bir yerel alanda (yaklaşık 100 μm) DA salınımının ölçümlerine izin veren, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip bir elektrokimyasal tekniktir. Ağız içi doğum ve FSCV kombinasyonu, geleneksel mikrodiyaliz yöntemleri kullanılarak incelenemeyen bir tastant'a hızlı, 'gerçek zamanlı' DA yanıtlarını gözlemleme avantajı sağlar. Ayrıca, ödüllere veya ödülle ilişkili ipuçlarına yanıt olarak fazik DA salınımı, FSCV için 10-20 nM tespit eşiğinin üzerinde olan 20-100 nM arasındaki konsantrasyonlarda meydana gelir ^[4]. FSCV'nin yüksek uzamsal çözünürlüğü, nucleus accumbens core (NAc) gibi küçük beyin alanlarının alt bölgelerinden de kayıt yapılmasına izin verir. Bu nedenle, FSCV, ağız içi tatt infüzyonları ile birleştirildiğinde, tastantların veya diğer uyaranların uyanık, davranan bir hayvanda fazik DA salınımını nasıl değiştirdiğini incelemek için ideal bir modeldir. Gerçekten de, bu teknikler, ödüllendirici ve caydırıcı tatların hücre dışı DA salınımını nasıl değiştirdiğini araştıran deneylere izin vermiştir ^[5].

Son on yılda, FSCV analizleri, uyuşturucu bağımlılığı modellerinde fazik DA mekanizmalarının rolünü belirlemek için intravenöz ilaç dağıtımı ^[6] ve sıçan kendi kendine uygulama paradigmaları ^{[7, 8]} ile başarılı bir şekilde birleştirilmiştir. Ek olarak, kokain mevcudiyeti ile eşleştirilmiş tastant ipuçlarının fazik DA salınımını ve duygusal etkiyi yansıtan davranışsal tepkileri nasıl modüle ettiğini incelemek için FSCV ile kombine ağız içi doğum kullanılmıştır ^[3]. Bu kombine ağız içi ve FSCV metodolojisi, sigaralara ve çözünebilir tütün ürünlerine eklenen mentol ve oral tatlandırıcılar gibi tatlandırıcılara fazik DA tepkilerini incelemek için de güçlü bir şekilde kullanılabilir ^[9-11]. Tütün ürünlerine eklenen tatlandırıcıların çoğu iştah açıcı olmasına rağmen ^[9-11], bu tatlandırıcıların ödüllendirici bir hedonik değerlik ile tutarlı bir şekilde fazik DA salınımını artırıp artırmadığı bilinmemektedir. Gerçekten de, sigaraya ve çözünebilir tütün ürünlerine eklenen tatlandırıcılar, DA ödül sistemi üzerinde doğrudan etkilere sahip olabilir ve sigara ve diğer tütün ürünlerinin ödüllendirici değerini etkilemek için dopaminerjik mekanizmalar yoluyla hareket edebilir. Bu nedenle, FSCV ile birlikte ağız içi uygulama, tatlandırıcıların hızlı DA salınımını nasıl modüle ettiği konusunda yeni bir anlayış sağlayabilir. Kombine ağız içi ve in vivo FSCV metodolojisinin kullanılması ve bu tür çalışmalardan elde edilen veriler, aroma vericilerin ve nikotinin DA sinyalini değiştirmek ve nikotin takviyesini potansiyel olarak modüle etmek için nasıl etkileşime girdiğini belirlemek için gelecekteki çalışmaları da kolaylaştırabilir. Ayrıca, bu tür çalışmalardan elde edilen veriler, tütün ürünü aromaları hakkında düzenleyici kararları bilgilendirmek için kullanılabilir.

Protokol

Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık (NIH) Rehberi National Institutes göre yapılmıştır ve Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1) ameliyat öncesi Hazırlık

1. Oral Çözelti Hazırlanması
   1. % 10 sakroz ve deiyonize su içinde% 0.005 L-mentol (pH 7.4) çözüm oluşturur. Oda sıcaklığında, kapalı kaplarda bu çözümleri saklayın ve bozulmasını önlemek için, her 2 haftada bir yeniden.
2. Elektrot kalibrasyon çözümleri
   1. Kalibrasyon öncesinde herhangi bir zamanda Tris tamponu (pH 7.4) sağlayın. Çözelti 12.0 mM Tris-HCI, 140 mM NaCI, 3.25 mM KCI, 1.20 mM CaCl2, 1.25 mM NaH2PO4, 1.20 mM _MgCl2, 2.00 mM Na ₂ SO ₄ oluşmaktadır.
   2. 0.1 M perklorik asit içinde, 10 mM dopamin (dopamin hidroklorür DA) içindeki bir stok çözeltisi oluşturur. perklorik asit dopamin oksidasyonunu önlere. -20 ° C'de bu stok çözelti depolamak ve en fazla 6 ay için kullanımı. Sadece bir kez, her kısım kullanımı depolama için DA stok çözeltisi, birkaç seferde sağlayın.
   3. 10 mM DA bir stoğundan alınan, 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM, ve 31.25 nM konsantrasyonlarda Tris tamponu içinde seyreltik çözeltiler.
   4. PH kalibrasyonu için, Tris çözeltileri 7.2, 7.3, 7.5 ve 7.6 pH'a sahip tampon hazırlanması. Bu in vivo deney sırasında oluşabilecek pH değişimleri taklit çözümleri sunacak.
3. Elektrot imalatı
   1. Vakum emiş ile, (çap 0.4 mm iç, uzunluğu 10 mm, dış çap: 0.6 mm) bir borosilikat cam boru içine, bir T-650 C-fiber (7 um çapında) aspire.
   2. Dikey elektrot çektirmesi içine karbon fiber ile dolu cam kapiller yerleştirin. İlk parametreler için, 55,0 ile ısıtıcı ayarlamak ve mıknatıs kapatın. Isıtıcı ve manyetik ayarları hem fr değişir Ancak, daha fazla optimizasyon gerekli olabilirlaboratuvara om laboratuarı.
      Not: Elektrot kolayca mikromanipülatör içine sığabilecek ve sıçan beyninde dura altında en az 6.9 mm eklenir, böylece (konik dahil olmak üzere), en az 5.5 cm uzunluğunda olmalıdır. Elektrot çok kısaysa, nukleus akkumbenlere ventral kısmından kayıtları elde olmayacaktır. Öte yandan, toplam elektrot uzunluğu mikromanipülatör sığmayacak kadar uzun olacak, aksi takdirde 6.5 cm'yi aşmamalıdır.
   3. Camın bitiminden sonra 75-100 mikron uzanır, böylece ışık mikroskobu kullanarak, maruz karbon fiber-kesti. Elektrot sonraki kayıt sırasında minimum gürültü üretecek cam elektrot ve karbon fiber, arasında çok sıkı, ancak ayırt, mühür olduğunu doğrulayın. Fakir mühür göstergesidir cam ya da mühür gevşek olup olmadığını herhangi bir fark çatlaklar, varsa elektrodu atın. Daha ayrıntılı talimatlar [12] ve [13] bakınız.
4. Mikrofon içine elektrod Montajromanipulator
   1. Tel yarım uzunluğu boyunca izole edilmiş bir 3 üzere 30G tel elde edilir ve gümüş ince bir tabaka tel doğrudan boya uygulamak için küçük bir fırça kullanılır. Hemen gümüş boya uygulandıktan sonra, karbon fiber bir fiziksel ve elektriksel bağlantı sağlamak için elektrot üstündeki deliğe tel yerleştirin. Mikroskop altında, gümüş tel, karbon fiber ile temas edinceye emin olun.
   2. Isı shrink kullanarak mikromanipülatör gümüş tel ve elektrot sabitleyin.
   3. Elektrot yüzeyini temizlemek için ve dopamin sonraki duyarlılığını artırmak için en az 10 dakika süre ile arıtılmış, izopropil alkol (IPA) içinde hazırlanan, karbon lifi elektrot yerleştirin. IPA iliklerine sonra, IPA kaldırmak için musluk suyu ile karbon fiber durulayın.
5. Referans elektrot imalat
   1. , Yaklaşık 6 mm Ag / Ag Cl örgü (yalnız 7 mm gümüş tel, 6 mm örgü, 0,4 mm çap) içeren 13 mm gümüş tel alınAşağı yaklaşık yarısı orijinal uzunluğunun gümüş kısmını kesip altın pin tel gümüş kısmını lehim.
   2. Pim üzerine lehim üzerine epoksi uygulayın.
   3. Ag Dip / Ag Cl% 5 politetrafluoroetilen ve bir kopolimere ucunu örgü perfloro-3,6-dioksa-4-metil-7octene-sülfonik, her daldırma arasında 30 dakika hava kurutma süreleri ile asit 5 kez.
   4. Kaplanmış Ag / Ag Cl hava kuru O / N örgü izin verin.
   5. 1 saat 120 ºC fırında Cure.

2) Kombine İntraoral Cerrahisi ve İntrakranial Kanülasyon Cerrahisi (yaklaşık 75 dk)

1. Ağız kateter imalat
   1. Oral kateter yapın ve en az 10 gün önce ameliyat, etilen oksit sterilizasyon sterilize edilir.
   2. 6 cm uzunluğunda bölümler halinde PE 100 boru kesin.
   3. Lehim kullanılarak, PE hortumun bir ucunu eriyik hemen PE boru soğumaya katı bir yüzeye karşı baskı. Sonuç oluşturmanız gerekirküçük, düz PE boru, bir ucunda bir disk ve flanşlı olmamalıdır. Bir iğne (18 G) kullanın veya bu diskin ortasında bir delik oluşturmak için pin itin.
   4. PE boru diğer ucunda, rahatça tüp içine 18 G iğne künt ucunu.
   5. Standart kağıt delgeç kullanılarak, politetrafluoroetilen çamaşır oluşturmak için (3.18 mm kalınlığında, 6 mm çapında), bir politetrafluoroetilen tabakanın birkaç dairesel parça zımba.
   6. Yıkama merkezinde bir delik oluşturur. PE boru takılı iğne alın ve çamaşır makinesi ile tamamen itin. İğne geçer kez yıkayıcı aynı hizada olacak şekilde, PE boru altına rondela kaydırın.
2. Ağız cerrahisi
   1. (Sterilizasyondan önce kaide altına 2.5 mm kesilmiş), cerrahi aletler, kanül ve referans elektrotu sterilizasyon sonra Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile sıçan anestezisi.
      1. After 5 dakika, anestezi seviyesini değerlendirmek için bir zararlı uyaran testi (ayak veya kuyruk tutam) uygulanır. Konu zararlı uyaran testine herhangi bir fiziksel bir tepki gösteriyorsa, (solunum veya kalp hızında yanıtı, artış korkmak) orijinal dozun% 15'e% 10 ketamin destek yönetmek ve yukarıdaki zararlı uyaran protokolünü tekrarlayın.
   2. Sıçan tamamen anestezi ve zararlı uyaran testi herhangi bir tepki gösterir sonra, kulakların arkasında yaklaşık 2 mm gözlerden sıçan kürk tıraş hayvan kılı makası kullanın. Daha sonra cerrahi sırasında vücut ısısını korumak için ince bir su devridaim ısıtma yastığı sıçan yerleştirin. Göz yağlayıcı. Önceden herhangi bir insizyon gerçekleştirmeden önceki ağız içi kanüllerin yerleştirilmesinden intraperitonal enjeksiyon ile steroidal olmayan anti-enflamatuvar (NSAID) bir ilaç, karprofen (5 mg / kg), uygulayın. Her zaman steril tekniği kullanın.
   3. Cildi temizlemek için% 70 etanol ile takip betadin uygulayın. 3 kez tekrarlayın.
   4. Plasırtında sıçan ce ve steril bir pamuklu çubuk kullanarak ağzını açın. İlk üst molar bulun.
   5. İğne hemen arkasında çıkana kadar yanak ve ilk üst azı arasındaki doku içine iğne takın ve kulaklara medial.
   6. Pierce PE boru kadar deri yoluyla iğne cildi çıkar ve erişilebilir.
   7. (Kanül kendisi değil iğne ile sürükleyici) kanül üzerinde yukarı çekin ve kateter yerinde kalır ve böylece azı dişleri içine politetrafluoroetilen pulu sabitleyin.
      Not: kolay bu adımı kılan bir yamuk şekline yıkayıcı Kesme ve yanak bakacak düz tarafı azı dişleri karşı güvence.
   8. Başka bir politetrafluoroetilen pulu alın ve plastik boru aşağı maruz iğne üzerine kaydırın ve kesi karşı Abut.
   9. Yıkayıcı yukarı kaydırın kalmaması üçgen "bayrak" oluşturmak için sterilize bandı kullanın, politetrafluoroetilen pulu güvenliğini sağlamak için. Yıkama GüvenliSıçan deri ve sterilize bant karşı er.
   10. Boru 2-4 cm sıçan başının üzerine maruz kalmasına izin maruz kateter kesilir.
   11. Tekrarlayın ağız diğer tarafında için 2.2.10 ile 2.2.1 adımları.
3. Voltammetri intrakranial cerrahi
   1. (3 döngü tekrarı ile gerçekleştirmek,% 70 etanol fırçalayın ardından betadin fırçalayın) stereotaksik çerçeve içinde sıçan yerleştirin ve iki aşamalı fırçalayın kullanarak hayvanın derisini temizleyin.
   2. Kafa derisi doku 15 x 15 mm bölümünü kesip sterilize iğne burun cımbız ve cerrahi makas kullanın.
   3. Yavaşça steril pamuk uçlu aplikatörler kullanılarak kafatasının yüzeyini temizlemek. Bundan başka% 3 hidrojen peroksit 2-3 damla tatbik kafatası temizleyin.
   4. Referans Elektronik için vidaların sonraki girişi için kafatası içinde 3 küçük (1 mm çapında) delikler, kılavuz kanül 1 delik, uyarıcı elektrot için 1 delik ve 1 delik açmak için bir stereotaksik matkap kullanınbindi.
   5. NAC çekirdek kayıtları için, 1,2 mm anterior kılavuz kanül yerleştirin ve 1.4 mm bregma lateral. Plastik taban kafatası ile aynı hizaya gelinceye kadar kanül aparatı indirin.
   6. Kılavuz kanül yarımkürede Kontrlateral sterilize referans elektrot yerleştirin. Referansı dura altında yaklaşık 2 mm indirin.
   7. 5,2 mm posterior ve bregmaya 1,0 mm yanal uyarıcı elektrot yerleştirin ve ventral tegmental alanı (VTA) hedef dura altında 8.0 mm alçaltılmış.
   8. Kafatasına vidaları sabitlemek için steril bir küçük cerrahi bir tornavida kullanın. Ardından, elektrot uyarıcı, referans elektrot yerleştirin ve kanül kılavuz. Son olarak, cranioplastic çimento kullanarak tüm bileşenleri sabitleyin.
   9. Ameliyat sonrası bakım, ilk 48 saat için, deri altına enjeksiyon (5 mg / kg) ile steroidal olmayan anti-inflamatuar ilaç (NSAID), karprofen uygulayın. Önce voltam yapmadan tam cerrahi iyileşme için en az 1 hafta izin vermetry kaydı.
      1. Post-operatif bakım sırasında, günlük su ile yıkayın sözlü kateterler. Çiğneme ve yeme hayvan yardım etmek için 2 gün su içinde doymuş yiyecek sağlamak. (Nedeniyle hafif enfeksiyon ya da dehidratasyon) ağrı stres potansiyel belirtileri için günlük izleme sağlamak ve gerekli uygun müdahaleleri sağlamak (sıvı idaresi, antiseptikler topikal dahil ve ya NSAID Carprofen yönetiminin 5 mg / kg).

3) Awake içinde Voltametrik Kayıtlar Serbestçe Hareketli Fare

1. Elektrot düşürülmesi ve DA eğitim seti elde.
   1. Deney günü, suyun 200 ul kaynaştırmak ve orofasyal yanıtları gözlemleyerek sözlü kanül açıklığını kontrol edin (sıçan su tatma doğrulamak için).
   2. Bipolar uyarıcı elektrot cannu içine (headstage üzerine) uyarıcı elektrot yerleştirerek sıçan FSCV headstage takınla (sıçan). Böylece, headstage (akım-to-gerilimine çevirici minyatürize) bipolar uyarıcı elektrot doğrudan bağlanır.
   3. Kanül cihazından kukla kanül kaldırın ve kanül içine% 50 heparin solüsyonu iki damla uygulayın. Sonra yavaşça sonradan deney sırasında eklenecektir karbon fiber elektrotları kıracak meydana gelmiş herhangi bir kan pıhtısı veya glial skar, temizlemek için (daha önce kaldırıldı kukla kanül o biraz daha uzun) bir kukla kanül yerleştirin. (En az 2 mm kayıt sitesi üzerinde) kafatası altındaki pıhtıları 3-4 mm temizlenmesi için kullanılan kanül uzatın.
   4. Kılavuz kanül içine elektrotla, mikromanipülatör yerleştirin ve bir "kilitli" konumuna omega halkasını yerleştirin.
   5. Uygun pin headstage referans elektrot teli bağlayın. Sonra headstage uygun kabloya mikromanipülatör çalışan elektrot teli bağlayın.
   6. ELEC indirinkafatası altında yaklaşık 4-4,5 mm Trode.
   7. Bir üçgen dalga formu (400 V / s, -0.4 ile +1.3 V) uygulamak için bir potansiyostatı kullanın. Daha sonraki deneysel kayıtları için 10 Hz dalga uygulaması sıklığını değiştirmek, en az 10 dakika süreyle 60 Hz elektroda dalga biçimini uygulayın.
      Not: 60 Hz dalga uygulaması adımı kararlı bir karbon fiber yüzeyi oluşturur ve elektrik sürüklenme önlemeye yardımcı olur
   8. DA serbest bırakılması ve pH farklı konsantrasyonlarda uyandırmak için, her 2 ms / fazının bir darbe genişliği VTA, çeşitli frekansların pulsları (10-30 darbe) ve akımların (50-150 uA) (10 60 Hz) ile elektrik uyarımı uygulanır vardiya. DA salınımı en az 5 farklı konsantrasyonları ve 5 farklı pH vardiya edinin. Veziküler dolumda [14] sağlamak için uyarılara arasında - (3 dakika minimum 2) bekleyin.
      Not: müteakip sırasında tahsil edilecektir bütün yelpazesinde DA konsantrasyonları uyarılmalara elde etmek önemlidirOnlar Temel Bileşenler Analizi (bakınız bölüm 5.1) için bir eğitim seti olarak kullanılacaktır beri deneme.
   9. NAC çekirdek (dura 6.3 mm ventral) içine elektrot indirin. Geçici DA salma etkinlik dakika başına en azından 1 frekanslarda görülen kadar sonra NAC çekirdek içinde 100 um adımlarla elektrot düşürmektedir.
   10. Bir şırınga pompası bağlanmış bir 20 ml şırınganın hortumu (iç çapı 1/32 ", dış çapı 3/32") bağlanır. Tüpün diğer ucunda, sıçan kanül tüp bağlamak için eğimli 23 G iğne kullanın. Boru istenilen tat yoğunluğu arttırıcı madde ile tamamen dolu olduğundan emin olun ve hiçbir kabarcıklar tüp bulunduğunu doğrulayın.
       Not: Genellikle, kayıttan önce ilk infüzyon tam infüzyon miktarı olup Boru içinde kalan herhangi su veya hava vermesini sağlamak için kayıt için sıçanın ağzına tat yoğunluğu arttırıcı madde bir miktar tatbik. Dahası, bu, bazı önceden deneyimi zekâ var hayvanı veriyorh yeni tat yoğunluğu arttırıcı beri tat yoğunluğu arttırıcı, hatta appetitive olanlar nedeniyle yenilik başlangıçta caydırıcı olabilir.
   11. Veri toplama için, tat yoğunluğu arttırıcı madde 200 ul (6.5 bir pompa kullanılarak sn ve daha önce açıklanan boru) demlenmeye. Tat yoğunluğu arttırıcı her 1-3 dakikada infüze. Tat yoğunluğu arttırıcı madde başına 25 kez toplam infüze. Her bir infüzyon çözeltisinin 200 ul sunar.
   12. Birden tat yoğunluğu arttırıcı tek bir deneyde teslim ediliyor ise, bir tat yoğunluğu arttırıcı madde için veri toplama sonra su ile ağız kateter yıkayın ve yeni tat yoğunluğu arttırıcı beslerken önce en az 20 dakika bekleyin.
   13. DA kayıt seansından sonra, kayıt yerinde küçük bir lezyon oluşturarak histolojik doğrulama için hazırlamak. Sonraki kalibrasyon için karbon fiber elektrot korumak için, ilk olarak elektrodu geri çekin ve mikromanipülatör çıkarın. Sonra orijinal karbon f olarak (dura altında) aynı derinlikte bir cam mikroelektrot ve (cam ucu ötesinde 100 mikron uzanan) tungsten tel ile yeni bir mikromanipülatör kullanıniber mikroelektrot.
   14. 10 V ayar elde edilinceye kadar histolojik doğrulama için, tungsten telinin 3 V uygulanması ve 1 V artışlarla gerilimi artırarak her 10 saniyede bir küçük lezyon oluşturur.
   15. Bir standart konsantrasyon eğrisi zaten birden fazla karbon fiber elektrotlar kullanılarak oluşturulmuş ise, doğrudan potansiyel karbon fiber elektrot uygulayarak (3.1.14) Yukarıdaki lezyon adımı gerçekleştirmek.
       Not: Bu lezyon yöntemi karbon fiber zarar ve bu özel elektrot ile sonraki kalibrasyon önleyecektir.
   16. Öldürücü püskürtme pentobarbital (150 mg / kg, ip) kullanılarak hayvan Euthanize.
   17. Başlık sistemi doğrudan yukarı çekerek pense ile kanül ile başlık sistemi yerinden. Bu beyne gereksiz hasara neden olabilir ve bu zorlu histoloji sırasında elektrodun konumunu belirlemek için yapacak çünkü başlık sistemi bükmeyin.
       1. % 30 su ve ardından 3 gün boyunca% 4 formalin beyin ve yer çıkarın1 hafta crose. Bir Kriyostat kullanarak 30 mikron dilim oluşturun karbon fiber veya tungsten lezyonun yerini belirlemek için bir ışık mikroskobu altında dilimleri kapak fişleri monte ve inceleyin.
          Not: Perfüzyon 3.1.17 için isteğe bağlıdır.

4) Elektrot Kalibrasyon

1. Bir akım konsantrasyon dönüşüm faktörü oluşturmak için akış hücresi kullanılarak.
   1. Elektrot duyarlılığını tespit etmek için, bir akış "T-hücresi" aparatı kullanılarak, her deney sonrasında elektrotlar kalibre edin. Tris tamponu, pH çözeltiler ya da DA çözeltiler (2 ml / dk bir oranda) elektrod yüzeyi üzerinde yıkanır ise "T-hücresi" olarak elektrot indirin. Tamponu ve pH veya DA çözeltisi arasında ileri ve geri geçiş yapmak için altı pozisyon hava selenoid çalıştırıcıyı kullanın.
   2. Her bir kalibrasyon için, 20 sn, ardından pH DA çözeltisi 5 saniye uygulama, ardından Tris tamponu (taban çizgisi) ve 5 saniye uygulama sırasında voltametrik veri toplamakTris tamponu (30 sn toplam dosyası) pplication. Her standardın farklı konsantrasyonları arasındaki dengelemek, her kalibrasyon standart konsantrasyonu için her zamanında 3 kez tekrarlayın.
   3. Her örnek toplanması için, zirveye DA veya pH uyarılmış akım ölçer. Pik akım ilişki karşı bir konsantrasyon elde etmek için her deneme boyunca tepe akımını ortalama. Daha ayrıntılı talimatlar [12] ve [13] bakınız.

5) Veri Analizi

1. Temel bileşenler analizinde belirlenen bir eğitim Kullanma (PCA)
   Not: voltametri deney sırasında, çıkış dopamin oksidasyon ve indirgeme, pH vardiya, ve elektrokimyasal gürültü sonucu olan, mevcut olarak üretilir. Biri istenen bileşenleri (DA ve pH) izole etmek ve istenen sinyalleri deforme olabilecek ek bileşenleri kaldırmak böylece PCA (daha ayrıntılı bilgi için, ^{15, 16} bakınız) Bu faktörlerin ayırımını sağlar.
   1. Inci bir kalibrasyon faktörü atamaE çıkış akımı PCA sonra (yaklaşık 5-10 nA / uM) analitlerin konsantrasyonu değerlerinin tespit edilmesi için izin vermek.
   2. "Tren" PCA modeli DA, pH ve diğer faktörleri ayırmak için bir deney sırasında elde eğitim setini kullanın. PCA halkalı voltamogramları set eğitim (bölüm 3.1.8 toplanan) alır ve voltogramda temel özellikleri in vivo voltametri kayıtları sırasında toplanan her analit tanımlamak için kullanılabilecek belirler.
   3. Tutmak için temel bileşen sayısını belirlemek için, bir Malinowski F-testi kullanın. Tipik olarak, normalde verilerde varyansın yaklaşık 95-99% açıklamak sadece 2 ya da 3 temel bileşenleri tutmak. Malinowski F-testi uygulanmasına ilişkin ayrıntılı bir tartışma için, bakınız ^17.
      Not: bileşenlerin sayısı belirlendikten sonra, PCA analizi etkin bir DA ölçülen voltamogramları proje olacak ve pH eğitimi muhafaza edilmiştir temel bileşenler üzerine ayarlar.Sonuç (beklenen çıkış için Temsilcisi Sonuçları gör) Sadece DA (veya pH) verileri kalır ve DA benzer veya pH değil artık veriler kaldırılır böylece süzülmüş edilmiş bir veri kümesidir. Voltametrik analizler için PCA kullanarak adım öğretim daha ayrıntılı bir açıklama ve adım için Malzemeler levha ve ^{16, 17} bkz.

Sonuçlar

Intraoral kateter implantasyonu ile birlikte FSCV nasıl sakaroz, İştah açıcı tat yoğunluğu arttırıcı incelemek için kullanılan, NAC çekirdek fazik DA salınımını düzenler. Tat yoğunluğu arttırıcı madde infüzyon, elektriksel stimülasyon öncesinde., VTA (150 uA, 60 Hz, 24 bakliyat, kırmızı çubuk ile gösterilir) Şekil 1 NAC (Şekil 1) fazik DA sürümde sağlam artışlar üreten potansiyeli olan bir renk grafiğini göstermektedir z ekseni y-ekseni, x-ekseni üzerinde zaman ve geçerli (yanlış renk o...

Tartışma

FSCV ile birlikte intraoral tat yoğunluğu arttırıcı madde teslim sözlü çeşni verici maddeler için "gerçek zamanlı" DA yanıtları analiz edilmesini sağlar. Başarılı DA ölçümleri için gerekli olan protokolde üç kritik adımlar vardır. İlk olarak, diş kateterin uygun bir implantasyon çeşni verici maddeler verilmesi için kritik önem taşır. Kateter birinci molar arkasında takılı ve yerine sıkışmış sağlamak açıklığı kaybetme kateter önler ve hayvan tarafından yanlışlıkla kaldırılmasını önler. Iyileşme sonrası ilk birk...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Uyarıcı elektrot	PlasticsOne	MS303/2-A/SPC	sipariş verirken, kaidenin altında 22 mm'lik bir kesim talep edin
Elektrot için kanül	Biyoanalitik Sistemler	MD-2251
Cam kılcal	A-M sistemleri	624503
Karbon fiber	Thornel	T650
Elektrot çektirmesi	Narishige Uluslararası	PE-22
Nörolog uyaran izolatörü	Digitimer Ltd.	DS4
Isıyla daralan	3M	FP-301
Elektrotlar için yalıtımlı teller	Squires elektronik	Özel	L 3.000 x 1.000s x 1.000s UL1423 30/1 BLU
Mikromanipülatör	Univ. Illinois at Chicago, Mühendislik Makine Atölyesi
Epoksi	ITW Devcon	14250	"5 dakika epoksi"
Perfloro-3,6-dioksa-4-metil-7okten-sülfonik asit ve tetrafloroetilen	İyon Gücü	kopolimeri LQ-1105	yani, < / em> Nafion
Gümüş boya	GC Elektronik	22-023
Güç kaynağı	BK Hassas	9110
Boru Ağız içi kateterler	Intramedic	427426	PE 100, İç Çap = 0.86 mm; OD = 1.52 mm
Ağız içi infüzyon için boru	Fischer Scientific	02-587-1A	KIMLIK 1/32"; OD 3/32 "
Akış hücresi için şırınga pompası	Pompa Sistemleri A.Ş.	NE 1000
Cerrahi çimento	Dentsply Kalafat	675571 ve 675572
Hava aktüatörü	VICI	A60	6 konumlu dijital
valf arayüzü Dijital valf arayüzü	VICI	DVI	230 VAC
Dörtlü sahne	N. Carolina Üniversitesi, Elektronik Tesisi
UEI güç kaynağı	N. Carolina Üniversitesi, Elektronik Tesis
UEI koparma kutusu	N. Carolina Üniversitesi, Elektronik Tesis
Tastant şırınga pompası için güç kaynağı	Med Associates	SG-504
Tastant şırınga pompası	Med Associates	PHM-107
Tungsten mikroelektrot	MicroProbes	WE30030.5A3
ile gümüş tel referansı	Metrik	E255A
Sükroz	Sigma	80497
Magnezyum klorür	Sigma	M8266
Sodyum chlroide		Sigma S7653
Perklorik asit	Sigma	244252
Hidroklorik asit (4 M)	Sigma	54435
Soidum hidroksit	Sigma	306576
Hidrojen peroksit	Sigma	H1009
Dopamin hidroklorür	Sigma	H8502
TarHeel HDCV Yazılımı	Kuzey Carolina Üniversitesi-Chapel Hill		Yazılım talep edilmelidir: yazılım talep sayfasına bağlantı için buraya tıklayın