Yöntem makalesi

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

DOI:

10.3791/52482

⸱

3 Mayıs 2015

 ,  , 
1Genetics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institute of Health

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda çiçek mayası Saccharomyces cerevisiae içinde, sumoylation ve kinetochore proteinleri, Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna bağlanmasını anlatır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon, ubikitinasyon ve sumoylation gibi post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS), pek çok protein, hücresel fonksiyonu düzenleyen. Sentromerik DNA ile ilişkilendirmek kinetochore proteinlerin PTMS genom istikrarı korumak için sadık kromozom tecrit aracılık eder. Bu tür kütle spektrometrisi ve western blot analizi gibi biyokimyasal yaklaşımlar en yaygın PTMS tanımlanması için kullanılır. Burada, bir protein saflaştırma yöntemi Saccharomyces cerevisiae'de kinetochore proteinler, Ndc10 ve Ndc80, bir sumoylation ubikuinasyon hem saptanmasına izin veren tarif edilmektedir. Ndc10 Myc-etiketli ya Ndc80 inşa ve çalışmaları için kullanılmıştır ifade polihistidin-Flag-işaretli Smt3 (HF-Smt3) ve A suşu. Sumoylation saptanması için, nikel boncuklar kullanılarak His ile etiketlenmiş sumoylated proteinleri saflaştırmak için bir protokol geliştirilmiştir ve sumoylated Ndc10 a tespit etmek için bir anti-myc antikor ile Western blot analizi kullanılannd Ndc80. Ubikitinasyon saptanması için, Myc-etiketli proteinlerin immüno için bir protokol geliştirilmiştir ve Ndc10 ve Ndc80 ubikitinlenmiş olduğunu göstermek için anti-Ub antikor ile Western blot analizi kullanılmıştır. Bizim sonuçlarımız His-Bayrak ilgi epitop etiketli protein Smt3 suşu birden PTMS tespitini kolaylaştırır etiketlenmiş olduğunu göstermektedir. Gelecekteki çalışmalar bu tekniğin sömürü belirli bir PTM bağımlı protein etkileşimleri belirlemek ve tanımlamak için izin vermelidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sırasıyla bir hedef proteine ​​(S. cerevisiae 1 Smt3 SUMO) yayılmasını ve sumoylation ubikitin ve küçük Ubikuitin benzeri değiştirici konjügasyonunu sağlar. Kinetochore proteinlerinin PTMS sadık kromozom segregasyonu sağlamak için farklı bir hücre döngüsü aşamaları sırasında hücresel düzeyleri ve protein-protein etkileşimlerini etkiler. Örneğin, Cse4 / CENP-A ve dış kinetochore proteini Dsn1 hücresel düzeyleri genom stabilitesini 2-5 sağlanması için ubikuitin-aracılı proteolizi ile düzenlenir. Yanlış kinetochore-mikrotübül ekleri destabilizasyonu doğrudan mikrotübül 6-8 ile etkileşim Dam1 ve Ndc80 kompleksleri fosforile Ipl1 / Aurora B kinaz gerektirir. Yetmiş üzerinde kinetochore proteinlerin belirlenmesi rağmen, PTMS, örneğin ubikitin ve SUMO ile bu proteinlerin değişiklikler araştırmak çok az sayıda çalışma vardır. Büyük bir sınırlama PTM korumak için yeteneğisaflaştırma ve sumoylation, fosforilasyon, metilasyon, ve diğerleri gibi PTMS tespiti için özel antikorların yetersizliği s üzerine çıkar. Sumoylated kinetochore proteinlerin karakterizasyonu Ndc10, Cep3, Bir1 ve Ndc80 özel bir antikor 9 kullanılmaktadır. Buna ek olarak, Ndc10 ubikitinasyon 10, bir alt-tabaka olarak dahil edilmiştir. İnsan Hec1 (S. cerevisiae'deki Ndc80), APC / Cı-hCdh1 E3 ligaz 11 düzenlenir, ubikitinasyon için maddedir. Bu nedenle, Ndc10 ve Ndc80 S. sumoylation ve ubikitinasyona hem algılamak için protokol optimizasyonu için iyi adaylardır cerevisiae.

Sumoylation belirlenmesini kolaylaştırmak için, HF-Smt3 ve Myc etiketli Ndc10 veya Ndc80 ifade eden suşları inşa. epitop etiketleri (HF: His6-Bayrak) kullanılması nedeniyle sık, bir aday proteine ​​karşı poliklonal serum içinde gözlenir çapraz reaktivite arka en aza indirir. Biz afinite bir protokol geliştirdiHF-Smt3 birleşikleri saflaştırılması ve daha sonra saf hale Smt3 hazırlanmasında sumolyated Ndc10 ve Ndc80 varlığını tespit etmek için, ticari bir anti-Flag ve anti-myc antikoru kullanılır. Ubikitinasyon sağlamak için, Myc-etiketli kinetochore proteinlerinin dağılmasını koruyan bir tadil edilmiş immüno protokolü tasarlanmış ve Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna tespit etmek için ticari bir anti-Ub antikoru ile Western Blot analizi gerçekleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maya Hücreleri 1. Büyüme

  1. Küçük bir kap içinde YPD (Tablo 1) 30 ml maya hücreleri inoküle. Çalkalama ile 30 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
  2. YPD 50 ml, 600 nm (OD 600 = 0.2) ile 0.2 'lik bir optik yoğunluğa kadar hücreleri seyreltilir ve çalkalanarak 30 ° C'de inkübe edin.
  3. 600 nm (OD 600 = 1.0), 1.0'lik bir optik yoğunluğa kadar kültür büyütün.
  4. Santrifüj hücreleri 2,000 xg'de 5 dakika boyunca ve supernatant atın.
  5. Hücreleri yıkamak için 2000 x g'de 5 dakika boyunca 40 ml steril su ve santrifüj hücre pelletini. Süpernatant atılır ve -20 ° C 'de hücre pelletini saklayın.

Proteinlerin 2. Ekstraksiyon

  1. Ya da Ni-NTA Superflow boncuklar kullanılarak açılır deneyi için buzla soğutulmuş guanidin tamponu (Tablo 1) 0.5 ml olarak yeniden süspanse hücreleri, immüno-çökeltme için (Tablo 1) tampon maddesi. Her zaman buz üzerinde tüpler tutun.
  2. 2 m transferl vidalı kapaklı tüp.
  3. Cam boncuklar aynı hacimde (Malzeme Tablo) ekleyin.
  4. Daha sonra 2-3 dakika süreyle buz koyun, oda sıcaklığında 2 dakika süreyle mini boncuk çırpıcı hücreleri (Malzeme Tablo) Boncuk yendi. Bu üç kez tekrarlayın.
  5. 30-60 dakika boyunca 4 ° C 'de yüksek hızda vorteksleyin. Hücreler lize sağlamak için mikroskop altında görselleştirme hücreleri kontrol edin.
    Not: Liz olmuş hücreler gibi karanlık hayaletler görünür ve bir sınır veya tanımlanmış şekli yoksun olacak. En uygun olarak, hücrelerin en azından% 80 lize edilmelidir.
  6. 15 ml konik tüp (vidalı kapak gevşek olmalıdır) bir koleksiyonda bir itme pimi ve yer kullanarak tüpün dibinde bir delik delmek.
  7. Lizat toplamak için 1 dakika için 1000 x g'de santrifüjleyin.
  8. Bir mikro santrifüj tüpüne lizat aktarın.
  9. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin ekstre proteinleri toplamak.
  10. Protein assa kullanılarak ekstre proteinlerin konsantrasyonu ölçüny kiti (Malzeme Tablo) ve tüm özler normale protein aynı miktarda içermesi. Uygun bir tampon ile 1 ml toplam hacmi getirmek.
    Not: toplam proteinin yaklaşık 5 ila 50 mg OD 600 hücrelerinden elde edilir.
  11. Bütün hücre ekstresi (WCE) halinde (adım 2.10 çıkarılan toplam protein, 5 mg olduğunda, 250 ug protein), 50 ul kaydedin. 2x Laemmli numune tampon maddesi (Tablo 1) 50 ul ilave edin ve 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C de inkübe edilir. Yük Western Blot analizi (Bölüm 5: Western blot analizi) bir SDS-PAGE jel içinde her numune için 10 ul.

HF-Smt3 Konjugatlarının 3. saflaştırılması

  1. Deney 1 dakika boyunca düşük hızda santrifüj leme (800-1,500 xg) (örnek başına boncuk 100 ul) için gerekli olan Ni-NTA Superflow boncuk (Malzemelerin Tablo) elde edilir. Süpernatantı.
  2. Yıkama boncuk PBS (Malzeme Tablosu) 1 ml 5 kat: Invert üst aşırıboncuklar yeniden süspanse kadar alt düşük hızda santrifüj boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak.
  3. Guanidin tamponu (Tablo 1) 1 ml boncuk askıya alma ve işlenecek olan örneklere karşılık gelen boruların sayısı içine kısım. Düşük hızda santrifüj ile boncuk toplayın ve süpernatant kaldırmak. Üst-over tersini alt tarafından iyi boncuk karıştırın.
    Not: Üst-over altını ters çevirerek iyice boncuk karıştırın.
  4. Ni-NTA Superflow boncuk 100 ul: her bir numune için, (protein çıkarması Aşama 2.11) geri kalan BOA'da 950 ul ilave edin.
  5. En az 4 saat veya gece boyunca 4 ° C 'de, bir sallanan platform üzerinde inkübe edin.
  6. 4 ° C'de 1 dakika için 800-1,500 xg'de santrifüj.
  7. Süpernatant (SUP) olarak 50 ul kaydedin. 2x Laemmli numune tampon maddesi 50 ul ilave edin ve 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C de inkübe edilir. Yük Western Blot Analizi (Kısım 5 için bir SDS-PAGE jel içinde her numune için 10 ul: Batı benek AnalYsis).
  8. Sallanan bir platform üzerinde bir kez 5-10 dakika süreyle guanidin tampon maddesi içinde 1 ml yıkama boncuk.
  9. Yıkama boncuklar sallanan bir platform üzerinde 5-10 dakika süreyle tampon maddesi (Tablo 1) kırılması için 1 ml 5 kat.
  10. 2x Laemmli numune tampon maddesi 90 ul içinde süspanse boncuklar.
  11. 1 M imidazol, 10 ul ekle.
    Not: İmidazol bağlı imidazol ve halkalar arasında rekabet etkileşim Ni-NTA boncuklardan His-etiketli proteini ayırmak için yardımcı olur.
  12. 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C'de inkübe edilir.
  13. Girdap, daha sonra 30 saniye boyunca 13,000 x g'de santrifüjlenir. Yeni bir tüp süpernatant aktarın.
  14. (: Western blot analizi Bölüm 5) Western blot analizi için bir SDS-PAGE jel içinde her bir numunenin yük 10-20 ul.
    Not: BOA'da 5 mg kullanıldığı takdirde, 10-20 ul, giriş 0.5-1.0 mg karşılık gelir.

Myc-etiketli Kinetokor Proteinlerin 4. immünopresipitasyonu

  1. Anti-c-myc agaroz afinite jel, bir elde edilirtibody (Malzeme Tablo) düşük hızda santrifüj (800-1,500 xg) deneylerinde (örnek başına reçine 25 ul) için gerekli. Süpernatantı.
  2. Tampon A ile 1 ml 'si ile yıkayınız reçinesi 5x: Reçine yeniden süspansiyon haline kadar ters çevirin en fazla alt düşük hızlı santrifüjleme ile reçine toplamak ve supernatant çıkarın.
  3. Tampon A içinde 1 ml bir reçine askıya alma ve işlenecek olan örneklere karşılık gelen boruların sayısı içine kısım. Düşük hızlı santrifüjleme ile reçine toplamak ve supernatant çıkarın.
    Not: Üst-over-bottom tersini de reçineyi karıştırın.
  4. Reçine 25 ul (protein ekstraksiyonu Aşama 2.11) geri kalan BOA'da 950 ul ekle.
  5. Gece boyunca 4 ° C 'de, bir sallanan platform üzerinde inkübe edin.
  6. 4 ° C'de 1 dakika için 800-1,500 xg'de santrifüj.
  7. Süpernatant (SUP) olarak 50 ul kaydedin. 2x Laemmli numune tampon maddesi 50 ul ilave edin ve 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C de inkübe edilir. BakReklam Western blot analizi için bir SDS-PAGE jel (Bölüm 5: Western blot analizi) 'de her bir numune için 10 ul.
  8. Tampon A ile 1 ml 'si ile yıkayınız reçinesi 5x: Reçine yeniden süspansiyon haline kadar ters çevirin en fazla alt düşük hızlı santrifüjleme ile reçine toplamak ve supernatant çıkarın.
  9. SUMEB numune tamponu (Tablo 1), 100 ul reçine yeniden süspanse edin.
    Not: SUMEB örnek tamponu 8 M üre ve% 1 SDS (güçlü denatüre koşul) içerir.
  10. 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C'de inkübe edilir.
  11. Girdap, daha sonra 30 saniye boyunca 13,000 x g'de santrifüjlenir. Yeni bir tüp süpernatant aktarın.
  12. (: Western blot analizi Bölüm 5) Western blot analizi için bir SDS-PAGE jel içinde her bir numunenin yük 10-20 ul.
    Not: BOA'da 5 mg kullanıldığı takdirde, 10-20 ul, giriş 0.5-1.0 mg karşılık gelir.

5. Western Blot Analizi

  1. % 4-12 Bis-Tris jelleri (Malzeme Tablo) ve perf üzerinde protein özleri yükleyinorm Elektroforez 90 dakika boyunca 120 V (tampon Running: Malzemelerin Tablosu).
  2. 90 dakika boyunca (: Malzemelerin Tablo transfer tampon maddesi) 30 V bir transfer aparatı kullanılarak bir nitroselüloz zar (Malzemelerin Tablo) jelden proteinleri aktarın.
  3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 süt / TBST 1x (Tablo 1) membran bloke eder.
  4. % 5 süt / TBST 1x gece boyunca 4 ° C birincil antikor (Malzeme Tablo) ile membran inkübe edin. 1000 (anti-Flag ve anti-Ub antikorlar) ya da 1: 5000 (anti-myc antikoru), birincil antikor, bir 1 seyreltme kullanın.
  5. 1x TBST ile 10 dakika her biri için membran 3x yıkayın.
  6. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 süt / TBST içinde 1 x sekonder antikor (Malzemelerin Tablo) ile membran inkübe edin. Sekonder antikor 5,000 seyreltme: 1 kullanın.
  7. 1x TBST ile 10 dakika her biri için membran 3x yıkayın.
  8. ECL worki ile membran inkübeng çözeltisi (Malzeme Tablo) 5 dakika.
  9. Mavi duyarlı X-Ray film membranı (Malzeme Tablo) Açığa ve otomatik geliştirici (Malzeme Tablosu) kullanarak geliştirmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Daha önce tarif edildiği gibi 9,12 kinetochore proteinleri Ndc80 ve Ndc10 bölgesinin sumoylation tespit etmek için, HF-Smt3 ve Myc-etiketli kinetochore proteinleri (Ndc80 veya Ndc10) suşlar, (Tablo 2) yapılmıştır. HF-Smt3 konjugatları afinite Ni-NTA boncuklar kullanılarak saflaştırılmıştır. HF-Smt3 (Şekil 1A ve 1B, sol panel) içermeyen kontrol suşu yoktu SUMO substratların sumoylated formları, bir anti-Bayrak antikor izin algılama ile arıtılmış, HF-Smt3 Weste...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HA, Myc, Bayrak ve GST edildiği gibi epitop işareti yaygın proteinlerin biyokimyasal analizi için kullanılmıştır. HF-Smt3 ve Ndc10 ve Ndc80 Myc-etiketli kinetochore proteinler ile suşların inşaatı, örneğin sumoylation ubikuinasyon olarak PTMS tespitini kolaylaştırır. HF-Smt3 tahlil aşağı çekme sumoylated kinetochore proteinler, Ndc10 ve Ndc80 (Şekil 1) algılanmasını sağlar. Anti-Flag antikor kullanılarak afınite saflaştırma protokolü ve western lekeleme analizi, HF-Smt3 ve hedef proteinler arasındaki et...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Destek ve tavsiyeleri için Dr. Oliver Kerscher'e ve makale hakkındaki destekleri ve yorumları için Basrai laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Okul İçi Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cam boncuklarBioSpec Ürünleri110791050,5 mm çap
Mini boncuk çırpıcıBioSpec Ürünler#6938 hücre bozucu
Ni-NTA süper akışQiagen30430100 ml
Proteaz inhibitörü kokteyliSigma-AldrichP8215Tavşan
Sigma-Aldrich'teAnti-c-Myc agaroz afinite jel karıncaA7470Fare
Sigma-Aldrich'teMonoklonal anti-Flag M2 antikoruF1804Birincil antikor, seyreltme 1:1.000
c-Myc antikoru (A-14)Santa Cruz Biotechnologysc-789Birincil antikor, seyreltme 1:5.000
Saflaştırılmış fare antikoru monoklonal 9E10CovanceMMS-150PBirincil antikor, seyreltme 1:5.000
Ubiquitin (P4G7) monoklonal antikorCovanceMMS-258RBirincil antikor, seyreltme 1:1.000
ECL Tavşan IgG, HRP'ye bağlı bütün AbGE Healthcare Yaşam BilimleriNA934Vİkincil antikor, seyreltme 1:5.000
ECL Fare IgG, HRP'ye Bağlı Tam AbGE Healthcare Yaşam BilimleriNA931Vİkincil antikor, seyreltme 1:5.000
DC protein testiBio-Rad500-0116
Nitroselüloz membranNovexLC20010,45 mm gözenek boyutu
NuPAGE %4-12 Bis-Tris Protein JelleriNovexNP0321BOX1.0 mm, 10 kuyulu
NuPAGE MES SDS Çalıştırma TamponuNovexNP000220x
NuPAGE Aktarım TamponuNovexNP0006-120x
SuperSignal West Pico Kemilüminesan YüzeyThermo Scientific34078
10x PBS pH7.4GIBCO70011-044
Maviye duyarlı X-Ray filmiDbioDBOF30003
Otomatik geliştiriciKodakM35AX-OMAT
NokodazolSigma-AldrichM140450 mg
MG-132Selleck KimyasallarıS261925 mg
üretilen 1 ml üretilen 1 ml

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216(2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158(2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Sumilasyon TespitiUbikitinasyon TespitiNdc10 Ndc80Nikel Boncuk Purifikasyonumm nopresipitasyon Y ntemiWestern Blot AnaliziSaccharomyces cerevisiaeEpitop Etiketleme

İlgili makaleler