Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Sırasıyla bir hedef proteine ​​(S. cerevisiae ¹ Smt3 SUMO) yayılmasını ve sumoylation ubikitin ve küçük Ubikuitin benzeri değiştirici konjügasyonunu sağlar. Kinetochore proteinlerinin PTMS sadık kromozom segregasyonu sağlamak için farklı bir hücre döngüsü aşamaları sırasında hücresel düzeyleri ve protein-protein etkileşimlerini etkiler. Örneğin, Cse4 / CENP-A ve dış kinetochore proteini Dsn1 hücresel düzeyleri genom stabilitesini ^2-5 sağlanması için ubikuitin-aracılı proteolizi ile düzenlenir. Yanlış kinetochore-mikrotübül ekleri destabilizasyonu doğrudan mikrotübül ^6-8 ile etkileşim Dam1 ve Ndc80 kompleksleri fosforile Ipl1 / Aurora B kinaz gerektirir. Yetmiş üzerinde kinetochore proteinlerin belirlenmesi rağmen, PTMS, örneğin ubikitin ve SUMO ile bu proteinlerin değişiklikler araştırmak çok az sayıda çalışma vardır. Büyük bir sınırlama PTM korumak için yeteneğisaflaştırma ve sumoylation, fosforilasyon, metilasyon, ve diğerleri gibi PTMS tespiti için özel antikorların yetersizliği s üzerine çıkar. Sumoylated kinetochore proteinlerin karakterizasyonu Ndc10, Cep3, Bir1 ve Ndc80 özel bir antikor ⁹ kullanılmaktadır. Buna ek olarak, Ndc10 ubikitinasyon ^10, bir alt-tabaka olarak dahil edilmiştir. İnsan Hec1 (S. cerevisiae'deki Ndc80), APC / Cı-hCdh1 E3 ligaz ¹¹ düzenlenir, ubikitinasyon için maddedir. Bu nedenle, Ndc10 ve Ndc80 S. sumoylation ve ubikitinasyona hem algılamak için protokol optimizasyonu için iyi adaylardır cerevisiae.

Sumoylation belirlenmesini kolaylaştırmak için, HF-Smt3 ve Myc etiketli Ndc10 veya Ndc80 ifade eden suşları inşa. epitop etiketleri (HF: His6-Bayrak) kullanılması nedeniyle sık, bir aday proteine ​​karşı poliklonal serum içinde gözlenir çapraz reaktivite arka en aza indirir. Biz afinite bir protokol geliştirdiHF-Smt3 birleşikleri saflaştırılması ve daha sonra saf hale Smt3 hazırlanmasında sumolyated Ndc10 ve Ndc80 varlığını tespit etmek için, ticari bir anti-Flag ve anti-myc antikoru kullanılır. Ubikitinasyon sağlamak için, Myc-etiketli kinetochore proteinlerinin dağılmasını koruyan bir tadil edilmiş immüno protokolü tasarlanmış ve Ndc10 ve Ndc80 ubikitinasyonuna tespit etmek için ticari bir anti-Ub antikoru ile Western Blot analizi gerçekleştirilmiştir.

Maya Hücreleri 1. Büyüme

1. Küçük bir kap içinde YPD (Tablo 1) 30 ml maya hücreleri inoküle. Çalkalama ile 30 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
2. YPD 50 ml, 600 nm (OD ₆₀₀ = 0.2) ile 0.2 'lik bir optik yoğunluğa kadar hücreleri seyreltilir ve çalkalanarak 30 ° C'de inkübe edin.
3. 600 nm (OD ₆₀₀ = 1.0), 1.0'lik bir optik yoğunluğa kadar kültür büyütün.
4. Santrifüj hücreleri 2,000 xg'de 5 dakika boyunca ve supernatant atın.
5. Hücreleri yıkamak için 2000 x g'de 5 dakika boyunca 40 ml steril su ve santrifüj hücre pelletini. Süpernatant atılır ve -20 ° C 'de hücre pelletini saklayın.

Proteinlerin 2. Ekstraksiyon

1. Ya da Ni-NTA Superflow boncuklar kullanılarak açılır deneyi için buzla soğutulmuş guanidin tamponu (Tablo 1) 0.5 ml olarak yeniden süspanse hücreleri, immüno-çökeltme için (Tablo 1) tampon maddesi. Her zaman buz üzerinde tüpler tutun.
2. 2 m transferl vidalı kapaklı tüp.
3. Cam boncuklar aynı hacimde (Malzeme Tablo) ekleyin.
4. Daha sonra 2-3 dakika süreyle buz koyun, oda sıcaklığında 2 dakika süreyle mini boncuk çırpıcı hücreleri (Malzeme Tablo) Boncuk yendi. Bu üç kez tekrarlayın.
5. 30-60 dakika boyunca 4 ° C 'de yüksek hızda vorteksleyin. Hücreler lize sağlamak için mikroskop altında görselleştirme hücreleri kontrol edin.
   Not: Liz olmuş hücreler gibi karanlık hayaletler görünür ve bir sınır veya tanımlanmış şekli yoksun olacak. En uygun olarak, hücrelerin en azından% 80 lize edilmelidir.
6. 15 ml konik tüp (vidalı kapak gevşek olmalıdır) bir koleksiyonda bir itme pimi ve yer kullanarak tüpün dibinde bir delik delmek.
7. Lizat toplamak için 1 dakika için 1000 x g'de santrifüjleyin.
8. Bir mikro santrifüj tüpüne lizat aktarın.
9. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 15,000 x g'de santrifüjleyin ekstre proteinleri toplamak.
10. Protein assa kullanılarak ekstre proteinlerin konsantrasyonu ölçüny kiti (Malzeme Tablo) ve tüm özler normale protein aynı miktarda içermesi. Uygun bir tampon ile 1 ml toplam hacmi getirmek.
    Not: toplam proteinin yaklaşık 5 ila 50 mg OD ₆₀₀ hücrelerinden elde edilir.
11. Bütün hücre ekstresi (WCE) halinde (adım 2.10 çıkarılan toplam protein, 5 mg olduğunda, 250 ug protein), 50 ul kaydedin. 2x Laemmli numune tampon maddesi (Tablo 1) 50 ul ilave edin ve 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C de inkübe edilir. Yük Western Blot analizi (Bölüm 5: Western blot analizi) bir SDS-PAGE jel içinde her numune için 10 ul.

HF-Smt3 Konjugatlarının 3. saflaştırılması

1. Deney 1 dakika boyunca düşük hızda santrifüj leme (800-1,500 xg) (örnek başına boncuk 100 ul) için gerekli olan Ni-NTA Superflow boncuk (Malzemelerin Tablo) elde edilir. Süpernatantı.
2. Yıkama boncuk PBS (Malzeme Tablosu) 1 ml 5 kat: Invert üst aşırıboncuklar yeniden süspanse kadar alt düşük hızda santrifüj boncuk toplamak ve süpernatant kaldırmak.
3. Guanidin tamponu (Tablo 1) 1 ml boncuk askıya alma ve işlenecek olan örneklere karşılık gelen boruların sayısı içine kısım. Düşük hızda santrifüj ile boncuk toplayın ve süpernatant kaldırmak. Üst-over tersini alt tarafından iyi boncuk karıştırın.
   Not: Üst-over altını ters çevirerek iyice boncuk karıştırın.
4. Ni-NTA Superflow boncuk 100 ul: her bir numune için, (protein çıkarması Aşama 2.11) geri kalan BOA'da 950 ul ilave edin.
5. En az 4 saat veya gece boyunca 4 ° C 'de, bir sallanan platform üzerinde inkübe edin.
6. 4 ° C'de 1 dakika için 800-1,500 xg'de santrifüj.
7. Süpernatant (SUP) olarak 50 ul kaydedin. 2x Laemmli numune tampon maddesi 50 ul ilave edin ve 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C de inkübe edilir. Yük Western Blot Analizi (Kısım 5 için bir SDS-PAGE jel içinde her numune için 10 ul: Batı benek AnalYsis).
8. Sallanan bir platform üzerinde bir kez 5-10 dakika süreyle guanidin tampon maddesi içinde 1 ml yıkama boncuk.
9. Yıkama boncuklar sallanan bir platform üzerinde 5-10 dakika süreyle tampon maddesi (Tablo 1) kırılması için 1 ml 5 kat.
10. 2x Laemmli numune tampon maddesi 90 ul içinde süspanse boncuklar.
11. 1 M imidazol, 10 ul ekle.
    Not: İmidazol bağlı imidazol ve halkalar arasında rekabet etkileşim Ni-NTA boncuklardan His-etiketli proteini ayırmak için yardımcı olur.
12. 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C'de inkübe edilir.
13. Girdap, daha sonra 30 saniye boyunca 13,000 x g'de santrifüjlenir. Yeni bir tüp süpernatant aktarın.
14. (: Western blot analizi Bölüm 5) Western blot analizi için bir SDS-PAGE jel içinde her bir numunenin yük 10-20 ul.
    Not: BOA'da 5 mg kullanıldığı takdirde, 10-20 ul, giriş 0.5-1.0 mg karşılık gelir.

Myc-etiketli Kinetokor Proteinlerin 4. immünopresipitasyonu

1. Anti-c-myc agaroz afinite jel, bir elde edilirtibody (Malzeme Tablo) düşük hızda santrifüj (800-1,500 xg) deneylerinde (örnek başına reçine 25 ul) için gerekli. Süpernatantı.
2. Tampon A ile 1 ml 'si ile yıkayınız reçinesi 5x: Reçine yeniden süspansiyon haline kadar ters çevirin en fazla alt düşük hızlı santrifüjleme ile reçine toplamak ve supernatant çıkarın.
3. Tampon A içinde 1 ml bir reçine askıya alma ve işlenecek olan örneklere karşılık gelen boruların sayısı içine kısım. Düşük hızlı santrifüjleme ile reçine toplamak ve supernatant çıkarın.
   Not: Üst-over-bottom tersini de reçineyi karıştırın.
4. Reçine 25 ul (protein ekstraksiyonu Aşama 2.11) geri kalan BOA'da 950 ul ekle.
5. Gece boyunca 4 ° C 'de, bir sallanan platform üzerinde inkübe edin.
6. 4 ° C'de 1 dakika için 800-1,500 xg'de santrifüj.
7. Süpernatant (SUP) olarak 50 ul kaydedin. 2x Laemmli numune tampon maddesi 50 ul ilave edin ve 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C de inkübe edilir. BakReklam Western blot analizi için bir SDS-PAGE jel (Bölüm 5: Western blot analizi) 'de her bir numune için 10 ul.
8. Tampon A ile 1 ml 'si ile yıkayınız reçinesi 5x: Reçine yeniden süspansiyon haline kadar ters çevirin en fazla alt düşük hızlı santrifüjleme ile reçine toplamak ve supernatant çıkarın.
9. SUMEB numune tamponu (Tablo 1), 100 ul reçine yeniden süspanse edin.
   Not: SUMEB örnek tamponu 8 M üre ve% 1 SDS (güçlü denatüre koşul) içerir.
10. 3-5 dakika için bir ısı blokta 100 ° C'de inkübe edilir.
11. Girdap, daha sonra 30 saniye boyunca 13,000 x g'de santrifüjlenir. Yeni bir tüp süpernatant aktarın.
12. (: Western blot analizi Bölüm 5) Western blot analizi için bir SDS-PAGE jel içinde her bir numunenin yük 10-20 ul.
    Not: BOA'da 5 mg kullanıldığı takdirde, 10-20 ul, giriş 0.5-1.0 mg karşılık gelir.

5. Western Blot Analizi

1. % 4-12 Bis-Tris jelleri (Malzeme Tablo) ve perf üzerinde protein özleri yükleyinorm Elektroforez 90 dakika boyunca 120 V (tampon Running: Malzemelerin Tablosu).
2. 90 dakika boyunca (: Malzemelerin Tablo transfer tampon maddesi) 30 V bir transfer aparatı kullanılarak bir nitroselüloz zar (Malzemelerin Tablo) jelden proteinleri aktarın.
3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 süt / TBST 1x (Tablo 1) membran bloke eder.
4. % 5 süt / TBST 1x gece boyunca 4 ° C birincil antikor (Malzeme Tablo) ile membran inkübe edin. 1000 (anti-Flag ve anti-Ub antikorlar) ya da 1: 5000 (anti-myc antikoru), birincil antikor, bir 1 seyreltme kullanın.
5. 1x TBST ile 10 dakika her biri için membran 3x yıkayın.
6. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 süt / TBST içinde 1 x sekonder antikor (Malzemelerin Tablo) ile membran inkübe edin. Sekonder antikor 5,000 seyreltme: 1 kullanın.
7. 1x TBST ile 10 dakika her biri için membran 3x yıkayın.
8. ECL worki ile membran inkübeng çözeltisi (Malzeme Tablo) 5 dakika.
9. Mavi duyarlı X-Ray film membranı (Malzeme Tablo) Açığa ve otomatik geliştirici (Malzeme Tablosu) kullanarak geliştirmek.

Daha önce tarif edildiği gibi 9,12 kinetochore proteinleri Ndc80 ve Ndc10 bölgesinin sumoylation tespit etmek için, HF-Smt3 ve Myc-etiketli kinetochore proteinleri (Ndc80 veya Ndc10) suşlar, (Tablo 2) yapılmıştır. HF-Smt3 konjugatları afinite Ni-NTA boncuklar kullanılarak saflaştırılmıştır. HF-Smt3 (Şekil 1A ve 1B, sol panel) içermeyen kontrol suşu yoktu SUMO substratların sumoylated formları, bir anti-Bayrak antikor izin algılama ile arıtılmış, HF-Smt3 Western blot analizi. Beklendiği gibi, SUMO substratlann birden fazla form HF Smt3 suşu tespit edilmiştir. Ndc80 ve Ndc10 bir anti-myc antikoru kullanılarak Western blot analizi yaparak saflaştınldı HF-Smt3 birleşmişi 'nin mevcut ise Bir sonraki tespit edilmiştir. Ndc80 ya Ndc10 daha yüksek molekül ağırlığına sahip olan çok sayıdaki bant, açık bir şekilde (Şekil 1A ve 1B, sağ panel) tespit edilmiştir. Ayrıca, Ndc80 ve Ndc10 hem de birden fazla şeritlernokodazol muamele edilmiş hücreler (Şekil 1C ve 1D) içinde indirgenmiştir. Bu sonuçlar, daha önce 9 tarif edildiği gibi protein saflaştırma ve western blot analizi, burada açıklanan Ndc80 ve Ndc10 arasında sumoylation saptanmasına olanak göstermektedir.

Ndc80 ve Ndc10, ubikitinasyonuna algılamak için Ndc80 ya Ndc10 (ip) immüno-çökeltildi Myc-etiketli ve western lekeleme analizi, anti-Myc ve anti-Ub antikorları (Şekil 2) ile gerçekleştirildi. Bütün hücre ekstreleri (WCE) ve süpernatan (sup) analizi, Ndc80-Myc ve Ndc10-Myc (Şekil 2A) ekspresyonunu doğruladı. BOA'da ilgili daha düşük molekül ağırlıklı bozunma ürünlerini grupları temsil edebilir. Anti-mik ile problanmıştır IP örnekleri Ndc80 ve Ndc10 PTMS içerdiğini gösterir, birden fazla yüksek moleküler ağırlıklı bant gösterdi. Anti-Ub antikoru ile problanmış bir IP numune laddering desen Ndc80 ve Ndc10 ubikitinlenmiş olduğunu göstermiştir (Şekil 2A, α-Ub). Ndc80 ve Ndc10 bölgesinin laddering model ayrıca, bu bantlar, poli-ubiqutination temsil onaylayan, proteazom önleyicisi (MG132) (Şekil 2B, α-Ub) ile muamele etmek suretiyle geliştirilmiştir. temsilcisi sonuçları Ndc80 ve Ndc10 hem S. sumoylation ve ubikitinasyon için substratlar olduğunu ortaya koymaktadır S. cerevisiae ve tarif edilen protein saflaştırma yöntemleri, sumoylation ubikuinasyon olarak PTMS tespiti için faydalı olduklarını göstermiştir. Bizim bilgilerimize göre, bu S. Ndc80 ilk rapor insan homoloğunun Hec1 ubiquitin aracılı proteolizi, daha önce 11 yayınlanmış olsa da cerevisiae ubikitinasyon için bir alt-tabakadır.

Şekil 1: sumolyated yüzeylerde saflaştırılması SUMO substrat olarak kinetochore proteinleri Ndc80 ve Ndc10 belirlenmesini sağlar Pr.oteins ekstre edildi ve HF-Smt3 konjügatları SDS-PAGE ayrıldıktan sonra hazırlanmış ve Western blot analizi ile analiz edilmiştir. (A ve B) Ndc80 ve Ndc10 sumoylated edilir. Proteinler YPD logaritmik olarak büyüyen hücrelerden ekstrakte edildi. Sol panel: Toplam SUMO substratlar, bir anti-Bayrak antikor ile tespit edilmiştir. Sağ panel: bir anti-myc antikoru ile problanmış olduğunda Sumoylated Ndc80 ya Ndc10 HF-Smt3 konjugatları saptandı. Ndc80 ve Ndc10 (C ve D) Sumoylation nokodazol tedavi edilen hücrelerde azaltılır. (-) Logaritmik YPD içinde büyüyen hücreler, DMSO ile tedavi edilen ya da DMSO + / ml nokodazol (+), 30 ° C'de 2 saat süre ile 20 ug. HF-Smt3 konjügatları, anti-myc antikoru kullanılarak Batı benek analizi ile analiz edilmiştir. Kullanılan izogenik maya cinsleri (A ve C) YPH1800 (Ndc80-myc), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-myc) ile (B ve D) YPH1734 (Ndc10-myc), YMB7867 (His-Fl olanAG-SMT3 Ndc10-myc).

Şekil 2:. Protokolde tarif edildiği gibi kinetochore proteinleri Ndc80 protein ve immüno-çökeltme ve Ndc10 Ekstraksiyon Ubikitinasyon yapıldı. (A) Ndc80 ve Ndc10 ubikitinlenmiş edilir. Proteinler YPD logaritmik olarak büyüyen hücrelerden ekstrakte edildi. Tam hücre özü (WCE), süpernatan (SUP) ve imüno (İP) fraksiyonlar, SDS-PAGE tabi tutulmuştur. Western blot, sırasıyla, anti-Myc ve anti-Ub antikorları ile-myc isim levhası ve ubikitinlenmiş proteinleri tespit etmek için kullanıldı. Ndc80 ve Ndc10 (B) Ubikitinasyon proteazom önleyicisi MG132 ile muamele edilen hücreler daha da geliştirilmiştir. (-) YPD logaritmik olarak büyüyen hücreler, DMSO ile tedavi edilen ya da DMSO, daha önce tarif edilen 13, 30 ° C 'de 3 saat süre ile SDS% 0.003 varlığında + 50 uM MG132 (+) olarak

Tablo 1: Çözümler.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.