Yöntem makalesi

Tavan Kültürlerde Olgun adipositlerinde ve dediferansiyonunu ile İnsan adipoz Kök Hücre Üretimi

11.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/52485

⸱

7 Mart 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1IUCPQ Research Center, 2CHU de Québec Research Center, 3Laval University

Bu makalede

Özet

Olgun adipositler, homojen bir fibroblast benzeri hücre popülasyonuna yol açan farklılaşma yoluyla bol miktarda kök hücre kaynağını temsil edebilir. Kollajenaz sindirimi, olgun adipositleri insan yağından izole etmek için kullanılır. Protokolümüzün amacı, insan olgun adipositlerinden multipotent, farklılaşmış yağ hücreleri elde etmektir.

Özet

Olgun adipositlerin, tavan kültürü adı verilen bir teknikle in vitro olarak fenotiplerini fibroblast benzeri hücrelere çevirdiği gösterilmiştir. Olgun adipositler, fonksiyonlarının ve metabolik özelliklerinin depoya özgü karakterizasyonu için taze yağ dokusundan da izole edilebilir. Burada, kollajenaz sindirimi kullanarak olgun adipositleri yağ dokularından izole etmek için iyi bilinen bir protokolü ve tavan kültürlerini gerçekleştirmek için sonraki adımları açıklıyoruz. Kısaca yağ dokuları, doku matrisini bozmak için kollajenaz içeren bir Krebs-Ringer-Henseleit tamponunda inkübe edilir. Yüzen olgun adipositler tamponun üst yüzeyinde toplanır. Olgun hücreler, tamamen ortamla doldurulmuş bir T25 şişesine kaplanır ve bir hafta boyunca baş aşağı inkübe edilir. Alternatif bir 6 oyuklu plaka kültürü yaklaşımı, farklılaşmaya uğrayan adipositlerin karakterizasyonuna izin verir. Adiposit morfolojisi, kültürün zaman içinde büyük ölçüde değişir. İmmünofloresan, FABP4 immünofloresan boyama ile gösterildiği gibi 6 oyuklu plakalarda yetiştirilen slaytlar üzerinde kolayca gerçekleştirilebilir. FABP4 proteini olgun adipositlerde bulunur, ancak yağ hücrelerinin farklılaşması yoluyla aşağı regüle edilir. Olgun adiposit farklılaşması, hücre tedavisi ve doku mühendisliği için yeni bir yol olabilir.

Giriş

Olgun adipositlerin in vitro farklılaşması, tavan kültürü1 adı verilen bir teknikle sağlanır. Sulu çözeltilerde yüzmeye yönelik doğal eğilimleri nedeniyle, izole edilmiş olgun adipositler, tamamen kültür ortamı ile doldurulmuş ters çevrilmiş bir şişenin yüzeyine yapışır. Birkaç gün içinde, hücreler küresel morfolojilerini değiştirir ve fibroblast benzeri hücreler haline gelir. Farklılaşmış yağ (DFAT) hücreleri olarak adlandırılan ortaya çıkan hücreler multipotent2'dir. Adiposit farklılaşması, özellikle insan hücreleri üzerinde yapılan araştırma makaleleri sınırlıdır. Bununla birlikte, DFAT hücrelerinin2 çoklu potansiyeli, hücre fenotipi ve replikatif kapasitesi hakkında zaten ilginç bilgiler sağladılar. İnsan viseral ve subkutan yağ dokularından kaynaklananlar da dahil olmak üzere çeşitli yağ kompartmanlarından köken alan matür adipositler başarılı bir şekilde ayırt edilmiştir2-4. Bu depolara ek olarak, Kishimoto ve işbirlikçileri, bukkal yağ yastıkçıklarından ve farklılaşmış adipositlerden DFAT hücrelerine yağ dokusu örneklediler5. Matsumoto ve işbirlikçileri, geniş bir yaş aralığını kapsayan hastalardan başarılı bir şekilde deri altı DFAT hücreleri ürettiler ve hücrelerin çoğu, kültür2'deki 10 geçişten sonra bile yüksek bir proliferatif orana ve yaşlanmanın% 6'sından daha azına sahipti.

DFAT hücreleri, adipfojenik, osteojenik, kondrojenik ve nörojenik soylar2,3,6 dahil olmak üzere çeşitli soylara başarıyla yeniden farklılaştırılmıştır. Bu hücreler, Nanog ve tanımlanmış dört pluripotent faktör Oct4, c-myc, Klf4 ve Sox23 gibi birkaç embriyonik kök hücre belirtecini eksprese eder. Ayrıca üç mikrop katmanının her birine özgü belirteçleri de ifade ederler7. Ek olarak, DFAT hücreleri, epigenetik imzalarına dayanarak Kemik İliğinden türetilmiş Mezenkimal Kök Hücrelere (BM'den türetilmiş MSC) benzer3. DFAT hücrelerinin kök hücre kapasitesinden yararlanan birçok grup, çeşitli hastalıkları tedavi etme veya iyileştirme potansiyellerini araştırmıştır8,9. Enfraktür kalp dokusu, omurilik yaralanması ve üretral sfinkter disfonksiyonu gibi patolojik durumların iyileşmesi,hastalık 10-12'nin sıçan modellerinde DFAT hücre enjeksiyonları ile gözlenmiştir.

DFAT hücrelerinin kök hücre özelliklerine ek olarak, adiposit fizyolojisi çalışmaları için yeni bir hücresel modeli temsil edebilirler. 3T3-L1 hücre hattı genellikle bu amaç için kullanılır, çünkü bu hücreler adipojenik stimülasyon altında yapışan, lipit depolayan adipositlere farklılaşır13. Ancak bu hücreler fare embriyo dokusundan köken alır13. Ayrıca, depo özgüllüğü bu model ile araştırılamaz ve insan adiposit fizyolojisini tam olarak yansıtmayabilir14. Diğer laboratuvarlar, murin yağ depolarından izole edilmiş yağ hücreleri ile çalışır, ancak farelerde yağ dağılımı dimorfik değildir ve kemirgenin karın boşluğunun anatomik konfigürasyonu, doğrudan insanlara ekstrapolasyon yapılmasını önler15. Adipositleri insan obezitesinin fizyopatolojisi bağlamında incelemek için, vücut yağ dağılımının ve yağ deposuna özgü farklılıkların dikkate alınması önemli hale gelmiştir16. Primer preadiposit kültürlerinde, adipoz doku biyopsi örneklerinden elde edilen hücre miktarları ve kültürde birkaç pasajdan sonra yaşlanmaları da dahil olmak üzere bazı sınırlamalar, alternatif modellere ihtiyaç duyulmasına neden olmuştur. Perrini ve işbirlikçileri, viseral ve subkutan yağdan kaynaklanan DFAT hücrelerinin gen ekspresyonunda depo özgüllüğünü araştırdılar ve bunları aynı yağ deposundan alınan adipoz kaynaklı kök hücrelerle (ASC) karşılaştırdılar. Gen ekspresyonu ve işlevindeki farklılıkların, hücre tipleri arasında olduğundan ziyade depolar arasında bulunduğunu gösterdiler, bu da DFAT hücrelerinin aynı depodan ASC'ye fizyolojik olarak yakın olduğunu düşündürdü. DFAT hücreleri, insan obezitesinin patofizyolojisinde yağ dağılımı üzerine yapılan çalışmalar için mevcut modellere ilginç bir alternatif sunabilir. Ayrıca, tavan kültürü, doku mühendisliği amaçları için yetişkin kök hücrelerin elde edilmesinde umut verici bir yöntemdir.

Burada, olgun adipositleri deri altı ve/veya viseral yağ örneklerinden17 izole etmek için yaygın olarak kullanılan bir teknik olan kollajenaz sindirimini ve tavan kültürünü gerçekleştirmek ve bu hücreleri multipotent, fibroblast benzeri hücrelere ayırmak için sonraki adımları açıklıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik deyimi: Proje öncesinde hasta alımına IUCPQ Araştırma Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Bu haber / video amaçla, 2 hastada dokuların elde: 1) 57 kg BMI ile 50,7 kg / m 2 ve 2) 35 yaşındaki kadın hasta bir BMI ile 62 yaşındaki erkek hasta, / 2 m. Deneyler hem yağ bölmeleri ile yapılabilir, ancak bu videonun amacı için bir yağ bölmeye sınırlı kalmıştır. Videonun teknik özellikleri, hastanın 1 ile yapıldı ve FABP4 immünofloresan hasta 2 dediferansiye hücreleri ile gerçekleştirildi.

1. Örnek İşleme

  1. Laparoskopik obezite cerrahisi sırasında omentum ve deri altı yağ bölmelerden yağ dokusu toplamak için cerrahlara isteyin.
  2. Çabuk oda sıcaklığında laboratuvara yağ numuneleri getirmek ve hemen işleme.
  3. Steril olmayan bir atmosferde, laboratuarda sindirim yapın.hücreler daha sonra kültür odasına aktarılır ve, steril koşullar altında kültive edilir. Kontaminasyonu önlemek için, sindirim önce distile ve filtre su ile KRH tampon hazırlamak ve bir filtrasyon (0.22 um filtresi) ile izleyin. Şişeye ve plaka hazırlanması için hücre kültürü kaputu etanol önce transferi ile iyice temizleyin tüpler.
  4. Önceden ağırlıklı çanak ve kayıt ağırlığı yağ dokusu yerleştirin. Parafine önce en az 24 saat boyunca oda sıcaklığında% 10 formalin tamponu içinde her bir doku numunesi (yaklaşık 1 cm2), bir parça düzeltildi. Immünohistokimyası deneyler için bu gömülü örneği (gösterilmemiştir tekniği) kullanın.
  5. (- Teknik gösterilmemiştir örneğin, gen ekspresyonu) bütün yağ dokuları üzerinde ileri çalışmalar için -80 ° C'de depolamadan önce sıvı azot içinde bir 50 ml tüp ve flash dondurularak başka bir parça yerleştirin.

2. kollajenaz sindirimi

  1. 50 ml'lik tu kalan yağ dokusu parçası yerleştirinsindirim için olabilir.
  2. Sindirme tüpü numunenin gramı başına kolajenaz (350 U / ml) ile takviye edilmiş KRH-WB 4 ml ilave edilir.
  3. Makasla yağ dokusu kıyma.
  4. 45 dakikalık bir kuluçka süresinin (en fazla 1 saat), bir çalkalayıcıda olmak üzere 37 ° C, 90 rpm, en fazla, kıyılmış adipoz doku süspansiyonu yerleştirin.

Adipositlerinde ve preadipositlerin 3. saflaştırılması

  1. Bir plastik geniş şişenin içine örgü 400 uM naylondan yağ birkaç parçaları ile saydam çözelti dökülür.
  2. Cımbız ile, naylon örgü hücre hazırlama ovmak ve KRH-WB 5 ml suyla yıkayın.
  3. Incelikle içinde plastik boru ve boru ucunda bağlı bir 60cc şırınga ile bir 50 ml tüp içine süzüldü hücre süspansiyonu aktarın.
  4. Olgun adipositlerle süspansiyon hücreleri yüzdürme ile tampon üst ulaşmasını sağlayan, yaklaşık 10 dakika bekletin.
  5. Yavaş yavaş 60cc enjektörler kullanılarak tüpün altındaki tampon aspirege emme.
  6. KRH-WB 20 ml yıkama ekleyin. 2 ek yıkama için adım 3.4 tekrarlayın.
  7. Hücre miktarına bağlı olarak, 5 ya da 10 ml'lik bir son hacme adiposit süspansiyon getirmek için tampon toplayın. 5. bölümünde adımlarla takibi.
  8. Arzu edildiği takdirde ayrıca, birinci hücre kültürü santrifüj ile 60cc şırınga (3000 rpm, RT, 5 dk) ile toplanmış tampon stromal vasküler kısmını kurtarma (tekniği gösterilmemiştir).

4. Olgun Adiposit Hücre Sayısı

  1. Yük bir sayım odasında (hemositometre) hafifçe sarsıldı adiposit süspansiyonu 10 ul. Dört nüsha olarak hücre sayısını yapın.
  2. Izole olgun hücrelerin sayısını hesaplayın.

T-25 şişesi içine 5. Olgun Adiposit farksızlaşma

  1. DMEM / F12-20% buzağı serumu ile hacminin ¾ 25 cm 2 doku kültürü şişesi doldurun.
  2. Hücre sayımı göre, balona 500.000 olgun hücreleri dökün.
  3. Tam ortam ile 50 ml tüp kullanarak balon doldurun ve mümkün olduğu kadar çok kabarcıklarını çıkarmak.
  4. Şişenin üzerindeki unvented kapağı vidalayın.
  5. Kontaminasyonu önlemek için inkübasyon öncesinde etanol ile şişeyi temizleyin.
  6. Hücresel yapışmayı bozabilir kültür hareketi önlemek için dokunmadan baş aşağı bir hafta boyunca şişeyi inkübe.
  7. Ters kültür 7 gün balon tersine önce, hafifçe ani hareketlerinden kaçınmak, şişeyi işlemek ve aspirasyon şişeye tüm orta kaldırmak.
  8. DMEM-F12-20% buzağı serumu 12 ml ekleyin ve standart tekniklerle hücreleri yetiştirmek. Filtre edilmiş, havalandırmalı kapak şişeye ilave edilebilir.

6 yuvalı plaka içine 6. Olgun Adiposit farksızlaşma

  1. 6 gözlü bir plakanın her bir alt kısmında bir lamel yerleştirin
  2. Her lamel üstüne ½ "plastik burcu ekleyin.
  3. % 20 dana serumu-DMEM ortamı 8 ml ile kuyu doldurun.
  4. Her plastik burç üzerinde bir lamel koyun.
  5. Slayt ve slayt altında hücresinin enjekte edilmesi için bir tüp (oyuk başına 50,000 hücre) ile pipet ucu yerleştirin.
  6. Bir hafta boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de bir standart hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
  7. Her bir göze% 20 dana serumu ile takviye edilmiş bir ortam 2 ml ihtiva eden ve takip kültüre ilişik hücrelerle Arka lamel.
  8. Hücreler immunfloresan dahil olmak üzere birçok amaçlar için dediferansiyonunu geçiren ile lamel kullanın (tekniği gösterilmemiştir).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Başlıca morfolojik değişimler dediferansiyasyon (Şekil 1) sırasında adipositleri olgun oluşur. Şekil 2'de gösterildiği gibi, farklılaşma bozukluğunun geçiren hücreler, floresan analizi için bir anti-FABP4 antikor ile boyandı. Fibroblast-benzeri hücrelerin bir çoğunluğu bu görülmemiştir yuvarlak morfoloji olan hücreler FABP4 proteini ifade etmiştir. Dediferansiyasyon sonra, DFAT hücreleri birkaç geçişleri için standart prosedürler ile yetiştirilebilir. İnsan omental ve deri altına DF...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tavan kültür tekniği ile olgun adipositlerin farksızlaşma yerli yağ dokusunun küçük bir örnek adipoz kök hücreleri elde etmek yeni bir yaklaşımdır. Deneyimlerimize ve diğerleri 2 bu göre, bir gram doku 25 cm2 bir balon plaka ve homojenliği Poloni ve arkadaşları 3 ile gösterilmiştir olan DFAT hücre popülasyonu elde etmek için yeterlidir. Adiposit farksızlaşma bağımsız olarak yaş, cinsiyet ve diğer özellikleri, herhangi bir donörden alınan hücrelerle mümkün görünüyor. DFAT elde çıkan nüfus...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Keşif Bursu (371697-2011, AT) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, bariatrik cerrahlar Dr. S. Biron, FS'nin yardımına teşekkür etmek istiyorlar. IUCPQ Doku Bankası'ndan Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau'nun yanı sıra Christine Racine ve Caroline Gagnon. Video çekimi ve düzenlemesi için IUCPQ'nun görsel-işitsel hizmetlerinden Bay Jacques Cadorette'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sığır serum albüminiSigmaA7906
AdenozinSigmaA4036
Askorbik asitSigmaA0278
NaClHerhangi bir marka kullanılabilir
KClHerhangi bir marka kullanılabilir
CaCl2Herhangi bir marka kullanılabilir
MgCl2Herhangi bir marka kullanılabilir
KH2PO4Herhangi bir marka
HEPESHerhangi bir marka
GlikozHerhangi bir marka kullanılabilir
Tip I kollajenazWorthington Biochemical CorpLS-004196
DMEM / F-12, HEPES, fenol kırmızısı içermezGibco-Life Technologies11039-021Ortama ekleyin: %20 buzağı serumu, gentamisin (50 & mikro; g / ml) ve mantar zonu (2.5 & mikro; g/ml)
Buzağı Serumu, demir takviyeli, formülle beslenen buzağılardanSigmaC8056-500 ml
1/2 Plastik burçtaIberville2704-CPSKU:1000120918 (Ev Deposu)
Sıvı nitrojenLinde
Formalin soluton, nötr tamponlu, %10SIGMAHT501128
Steril cımbız
Steril makas
60 cc şırıngalarBD Şırınga
Plastik boru
Krebs-Ringer-Henseleit stok tamponu (KRH)Stok tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. PH'ı 7.4'e ayarlayın.
Krebs-Ringer-Henseleit-Çalışma Tamponu (KRH-WB)Aşağıdaki bileşenleri taze olarak KRH tamponuna ekleyin:% 4 sığır serum albümini, 5 mM glikoz, 0.1 ve mikro; M adenosin, 560 ve mikro;
Tip I kollajenaz350 U/ml Tip I kollajenaz
T25 havalandırılmamış kapak doku kültürü şişesiekleyin Sarsted veya başka bir marka
6 oyuklu doku kültürü plakasıBD Falcon veya başka bir marka
Mikroskop kapak camı 22x22Fisherbrand12-542-B
Steril beherler
kullanılabilir kullanılabilir ile desteklenmiş M askorbik asit KRH-WB

Kaynaklar

  1. Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
  2. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  3. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  4. Perrini, S., et al. Differences in gene expression and cytokine release profiles highlight the heterogeneity of distinct subsets of adipose tissue-derived stem cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue in humans. PLoS One. 8 (3), e57892(2013).
  5. Kishimoto, N., et al. The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig. , (2013).
  6. Kou, L., et al. The phenotype and tissue-specific nature of multipotent cells derived from human mature adipocytes. Biochem Biophys Res Commun. 444 (4), 543-548 (2014).
  7. Jumabay, M., et al. Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 161-171 (2014).
  8. Sugawara, A., Sato, S. Application of dedifferentiated fat cells for periodontal tissue regeneration. Hum Cell. 27 (1), 12-21 (2014).
  9. Kikuta, S., et al. Osteogenic effects of dedifferentiated fat cell transplantation in rabbit models of bone defect and ovariectomy-induced osteoporosis. Tissue Eng Part A. 19 (15-16), 1792-1802 (2013).
  10. Obinata, D., et al. Transplantation of mature adipocyte-derived dedifferentiated fat (DFAT) cells improves urethral sphincter contractility in a rat model. Int J Urol. 18 (12), 827-834 (2011).
  11. Jumabay, M., et al. Dedifferentiated fat cells convert to cardiomyocyte phenotype and repair infarcted cardiac tissue in rats. J Mol Cell Cardiol. 47 (5), 565-575 (2009).
  12. Ohta, Y., et al. Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant. 17 (8), 877-886 (2008).
  13. Moreno-Navarrete, J. M. F. -r Ch. 2. Adipose Tissue Biology. Symonds, M. E. , Springer. 17-38 (2012).
  14. Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes. Exp Biol Med (Maywood. 235 (10), 1185-1193 (2010).
  15. Casteilla, L., Penicaud, L., Cousin, B., Calise, D. Choosing an adipose tissue depot for sampling: factors in selection and depot specificity). Methods Mol Biol. 456, 23-38 (2008).
  16. Tchernof, A., Despres, J. P. Pathophysiology of human visceral obesity: an update. Physiol Rev. 93 (1), 359-404 (2013).
  17. Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. J Biol Chem. 239, 375-380 (1964).
  18. Watson, J. E., et al. Comparison of Markers and Functional Attributes of Human Adipose-Derived Stem Cells and Dedifferentiated Adipocyte Cells from Subcutaneous Fat of an Obese Diabetic Donor. Adv Wound Care. 3 (3), 219-228 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tavan K lt rKollagenaz SindirimiDoku zolasyonuDediferansiyasyon S reciFABP4 mm nofloresansH cre MorfolojisiDoku M hendisli iH cre Tedavisi

İlgili makaleler