Method Article

Tek iplikli DNA Fayans Complex iki boyutlu şekiller Self-montaj

DOI:

10.3791/52486

⸱

May 8th, 2015

 ,  ,  , 
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 3Department of Systems Biology, Harvard Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA döşeme, programlanabilir nanoyapılar yapmak için etkili bir yaklaşımdır. Tek sarmallı DNA karolarının kendi kendine bir araya getirilmesiyle karmaşık iki boyutlu şekiller oluşturmak için protokolleri açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA nano-mimarisindeki mevcut yöntemler, kendi kendine montaj ilkelerini kullanarak çeşitli 2D ve 3D yapıları başarıyla tasarlamıştır. Bu makalede, moleküler bir tuval üzerinde moleküler pikseller olarak işlev gören, benzersiz bir şekilde adreslenebilir tek sarmallı DNA karolarının kendi kendine montajı yoluyla karmaşık 2B şekillerin nasıl üretileceğine dair ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz. Her tek sarmallı karo (SST), kendi kendine montaj sırasında dört komşuya bağlanan dört birleştirilmiş modüler alandan oluşan 42 nükleotidli bir DNA zinciridir. Moleküler kanvas, SST'lerden kendi kendine monte edilen dikdörtgen bir yapıdır. Öngörülen karmaşık bir 2B şekil, 310 piksellik bir moleküler tuvalden kurucu moleküler piksellerin (SST'ler) seçilmesi ve ardından karşılık gelen ipliklerin tek kap tavlamaya tabi tutulmasıyla oluşturulur. SST yaklaşımının modüler yapısı nedeniyle, bu yöntemin ölçeklenebilirliğini, çok yönlülüğünü ve sağlamlığını gösteriyoruz. Alternatif yöntemlerle karşılaştırıldığında, SST yöntemi, de novo tasarlanmış ve sentezlenmiş kısa DNA zincirlerinin kullanılması yoluyla daha geniş bir bilgi polimeri ve dizisi seçimini mümkün kılar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5,8,10 - - Önceki nükleik asit öz-montaj çalışmaları 1-25 DNA 2 olmak üzere kompleks yapıların, çeşitli başarılı inşaat yol açmıştır 13,17,23 veya RNA 7,22 periyodik 3,4,7, 22 ve algoritmik 5 iki boyutlu kafesler, kurdeleler 10,12 ve tüpler 4,12,13 3D kristaller 17 polyhedra 11 ve sonlu, 2D 7,8 şekillendirir. 16,18 - - 21,25 tek bir iskele şerit karmaşık bir şekle 9,14 oluşturulması için bir çok kısa yardımcı ştapel lifleri ile katlanır ve böylece özellikle etkili bir yöntem olup, bir DNA origami Desteksiz edilir.

Son zamanlarda, tek kollu bir kiremit (SST) kullanılarak önceden belirlenmiş 2B şekilleri ile ayrı ayrı nano yapımı için bir yöntem bildirilmiştir ve DNA origami 26 ile karşılaştırılabilir karmaşıklığı ile yapılar göstermişlerdir. Bu üre bizim daha önceki çalışma 26 bir uyarlama ve hassas reçete boyutları (genişlik ve uzunluklarda) ve morfolojileri ile sofistike sonlu 2B şekiller halinde ayrı ayrı adreslenebilir SSTs düzenlenmesi için protokoller detaylı anlatılmaktadır. SST yöntemin bir önemli avantaj modülerlik olduğunu. Bir yapının her bileşeni SST montaj modüler inşaat birim olarak hizmet vermektedir ve bu SSTs farklı alt grupları farklı şekiller üretirler. Böylece, kısa, sentetik DNA ipliklerini gelen öngörülen boyutları ve şekilleri ile nano inşa etmek genel bir platform kurdu.

SSTs dört alan, her biri 10 ya da 11 nükleotid uzunluğunda (Şekil 1A) içerir. SSTs kendi paralel heliks çapraz bağlantıları tarafından bir arada tutulan bir DNA kafes oluşturacak şekilde, bağlanır. Her geçiş etki 2 ve 3 fosfat Görsel netlik için diyagramlar yapay gerilir arasındaki fosfat olduğunu. geçitler ( Şekil 1B). Kompozit dikdörtgenler helisler ve helisel dönüş sayısını kendi boyutlarına göre adlandırılır. Örneğin, bir dikdörtgen altı helisleri genişliğinde ve sekiz sarmal 8T dikdörtgen × bir 6H olarak başvurulan uzun döner. SSTs, sol dışarı ekledi, veya başka keyfi şekil ve büyüklükte (Şekil 1C) yapılarını oluşturmak için yeniden düzenlenebilir. Örneğin, bir dikdörtgen tasarım arzu edilen bir uzunluğu ve yarıçapına (Şekil 1D) sahip bir tüp içine haddelenebilir.

Alternatif olarak, dikdörtgen SST kafes SST piksel oluşan bir molekül tuval, 7 nm her 3 nm olarak görülebilir. Bu çalışmada, 310 tam uzunlukta, iç SSTs bir molekül tuval kullanarak, Sol ve sağ sınırları oluşturan 24 tam uzunlukta SSTs, ve üst ve alt sınırları oluşturan 28 yarım uzunlukta SSTs. Tuval geçitler ile bağlantılı 24 çift helis vardır ve her bir sarmal 28 helezoni sarımlardan (294 baz) içerir ve bu nedenle olarak adlandırılır28T dikdörtgen tuval × 24H. 28T tuval x 24H, bir M13 faj iskele oluşturulan bir DNA origami yapısının benzer bir molekül ağırlığına sahiptir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. DNA sekansı tasarımı

  1. 28T tuval × bir 24H oluşturmak için çift helisler, her çift sarmal için üst ve alt sarmal uzunluklarının sayısını, ve crossover modelini belirterek SST-sonlu bir yapı tasarımı için UNIQUIMER yazılımını 27. kullanın. Bu parametreleri tanımladıktan sonra, genel mimari (iplikçik kompozisyon ve tamamlayıcılık düzenlemesi) Programın grafiksel gösterilmiştir.
  2. Tamamlayıcılık düzenlemesi ve ek gereklilikleri (eğer varsa) karşılamak için, belirtilen yapı şeritlerinin için dizileri oluşturur. (Yapıların çoğu için) dizi simetri 28 minimize ederek DNA dizileri tasarlayın.
    1. Nükleotidler (A, C, G ve T), tek bir rastgele oluşturur.
    2. T ve tersi A;: o tamamlayıcı Maç nükleotid baz eşleşmesi kuralına aşağıdaki oluşturulan C G ve tersi.
    3. Sekiz ya da dokuz nükleotidler ötesinde tekrarlanan bölümleri kullanmayın. Ne zaman böyle bir temsilcisiyinelenen segment gereksinimi tatmin olana kadar segmentler tasarım sırasında ortaya yeme, en son oluşturulan nükleotidler mutasyona.
    4. Dört birbirini takip eden A, C, G veya T bazları kullanmayın.
    5. Her iki varsa, örneğin (bağlantı noktaları etrafında üsleri sürgülü önlemek için (şeritlerin çoğu için, sırasıyla, yirmi birinci ve yirmi ikinci nükleotidler olarak örnek T ve G) tek şeritli bağlantı noktalarında önceden belirlenmiş nükleotidleri kullanın Yirmi birinci ve yirmi ikinci nükleotidleri yirmi ikinci nükleotid) bağlamak için gereken olduğu yirmi birinci nükleotid, nükleotid bağlanma mümkün olduğu, T idi.
  3. Streptavidin etiketleme, tüpler içine dikdörtgen dönüşüm, farklı dikdörtgenler ve farklı ölçeklerde arasında tüplerin oluşumu için elle DNA dizilerini değiştirin ve SST maruz etki nedeniyle toplanmasını önlemek için.
    1. Poli-T tra moleküler tuval sınırında maruz etki değiştirincts.
    2. Streptavidin ile etiketleme için, bunlar 3 'biyotin modifikasyon ile bir anti-sap iplikçik alabildiği gibi sap bölümlerini (örneğin, bir anti-sap iplikçik olarak tamamlayıcı bir muadili bağlanabilen bileşeni ipliğine ekteki ilave kademeli) tasarımı.
    3. Bir tüp içine bir dikdörtgen dönüşüm için, dikdörtgen üst ve alt satırları kaldırmak ve kimin SSTs üst satırındaki ikinci ve alt satırdaki ikinci karşılık gelen fayans özgü tamamlayıcılık sahip yeni bir satır eklemek.
    4. Farklı şekiller açık bir tek sarmallı bir etki sağlamak için, 10-11 nükleotid uzunluğunda poli-T kesimleri ile yerine ya da maruz kalan bir etki tamamlayıcı olan ve 10-11 nükleotid uzunluğunda poli-T kesimleri ile sona kenar koruma ile kapsar.

Moleküler Tuval 2. Hazırlık

  1. Bir oligonucleoti gelen RNaz içermeyen su içinde eritildi belirtilen dizilerin DNA bileşeni ipliklerini elde edilirStandart tuzsuzlaştırma ile 10 nmol ölçekte sentezlenmiş oligonükleotidler ile V tabanlı 96 yuvalı plakalar içinde de üreticisi. Santrifüj 600 x g'de yaklaşık 10 sn için DNA iplikleri ile 96 oyuklu plakalar.
    1. Pipet 2 ml bir test tüpüne lif başına 100 uM (üretici spesifikasyonu) de 28T dikdörtgen (Şekil 3A) x 24H için DNA bölümleri ile 362 kuyu her birinden 1 ul. Lif başına 200 nM'lik bir konsantrasyonda şerit karışımının bir stok çözelti yapmak için 2 ml test tüpüne distile deiyonize H2O içinde 138 ul ekle.
  2. Şerit karışımı, 10X dupleksleştirme tamponu A (50 mM Tris, pH 7.9, 10 mM EDTA, 250 mM MgCI2) ve damıtılmış iyonu giderilmiş H 40 ul H2O 0.2 ila 10 ul, 200 nM stok çözeltisi 50 ul ekle ml PCR tüpü. Bu 1X tavlama tampon A moleküler tuval 100 ul numune yapan (5 mM Tris, pH 7.9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCI2).
  3. Sampl tavlanması25 ° C, 90 ° C soğutma termal siki üs cihazında 17 saat e. Programı aşağıdaki gibi termal döndürücü: ° C başına 5 dakika bir sabit hızda 61 ° C'ye kadar 90 ° C den aşağı rampa; ° C başına 20 dakikalık sabit bir hızda 25 ° C'ye kadar 60 ° C den aşağı rampa; Örnek termal döngü üzerinden alınacak kadar 4 ° C'de inkübe edilir.
  4. Yerel bir% 2 agaroz jeli hazırlayın.
    1. 600 ml'lik bir cam kaba, agaroz 2.4 g ölçün. Behere 0.5X TBE tamponu (44.5 mM Tris-borat, pH 8.3, 1 mM EDTA) ve damıtılmış iyonu giderilmiş 30 ml su, 120 ml ilave edilir.
    2. 3 dakika (- kaynadıktan sonra 60 saniye daha fazla veya 40) için mikrodalga. % 2 agaroz jelde konsantrasyonunu korumak için yardımcı olan, 30 ml su ilave edilerek, buharlaştırma sırasında kaybedilen su doldurun.
    3. Bir soğuk su banyosu içinde 1 dakika için beher içindekileri döndürün. 1.2 M MgCI2, 1 ml (jel içinde 10 mM MgCI2 konsantrasyonu yapmak için) ekleyin ve jel wit ön lekeSYBR Güvenli boya h 6 ul (1: 20.000).
    4. Kuru bir jel kutu içine jel solüsyonu dökün ve 1,5 mm kalınlığında 12 kuyu jel elektroforezi tarak yerleştirin. Düz bir platform üzerinde 30 dakika - çözelti 15 için katılaşmaya edelim.
    5. Jel çalışan tamponu (44.5 mM Tris-borat, pH 8.3, 1 mM EDTA ve 10 mM MgCI2) jel kutusu içine dökün. Yük 2 - agaroz jeli bir kuyuya 1 kb DNA merdiveni 3 ul. (% 0.25 bromofenol mavisi, 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2 ve% 30 gliserol) 6X bromofenol mavisi 4 ul molekül tuval örneğin 20 ul ile karıştırılır ve bir kuyuya çözüm yük agaroz jel.
  5. Bir buzlu su banyosunda 100 V 2 saat için yerli% 2 agaroz Run (bir göstergesi olarak hizmet verebilir, böylece mavi gösterilen mavi bromofenol, hızlı bileşen tellerine göre daha çalışır 2 saat çalışma süresi uygun ise).
  6. Görüntü SYBR güvenli leke için uygun bir filtre (Şekil 2B ile jel tarayıcı kullanılarak jel ).
  7. Bir mavi ışık transilluminator'de üzerinde keskin bir temiz jilet kullanarak 1 kb DNA merdiveni 1.500 baz çifti bandına benzer hareketlilik ile baskın bant tüketim. Bir spin kolon istenen jel parçası (ler) yerleştirin ve daha sonra bir mikrotüp havaneli kullanarak ince parçalar halinde jel ezmek. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 438 x g'de santrifüjleyin.
  8. 260 nm'de ultraviyole spektrofotometre kullanılarak DNA konsantrasyonu ölçülür.
    1. Makineyi kalibre boş olarak ultra saf DNaz / RNaz Ücretsiz distile su 2 ul kullanın.
    2. DNA konsantrasyonu için tahmini bir değer elde etmek için eğirme kolonundan toplanan numunenin eşdeğer hacim kullanın. 260 nm UV emilimi elde ölçülen konsantrasyon değeri ("a" = ng / ml) AFM ve TEM görüntüleme için seyreltme faktörü belirlemenize yardımcı olacaktır.
    3. "A" (ng / ul) için "B" (nM) aşağıdaki b = a × 10 6 / (330 & ölçülen konsantrasyon dönüştürme# 215; nükleotidlerin sayısı).
      NOT: Bir nükleotid molekül ağırlığı 330 g / mol'dür. hesaplanan molar konsantrasyon değeri AFM ve TEM görüntüleme için seyreltme faktörünü belirler. 60 ng / | il - 28T dikdörtgen × 24H durumunda ise, saflaştırılmış bir numune için ortak ölçü yaklaşık 10'dur. 12 nM - böyle bir yapı için nükleotid sayısı 14.616 Da olduğu için, molar konsantrasyon yaklaşık 2 'dir. nihai konsantrasyon toplama verimi belirlenir - santrifüj ile ilgili (~ 20% 50) ve jel bant hacmi (yüksek hacim, daha saf numunenin seyreltilmesi) üzerinden çıkarılır.

3. Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme

  1. Düz bir yüzey elde ve görüntüleme sahneye numune disk yerleştirmek için seloteyip kullanarak bir örnek metalik diske bağlı mika soyulabilir.
  2. 28T x 24H saflaştırılmış numunenin - (5 nM 2) 5 ul ve ardından 1X tavlama tampon A 40 ul ekleTaze bölünmüş mika yüzeye dikdörtgen. Karışım yaklaşık 2 dakika boyunca yerleşmek için izin verin.
  3. Bir konsol tutucu üzerine AFM silisyum nitrür konsol çipi takın. Görüntüleme için; - (sabit bahar, k = 0.24 Nm -1 75 kHz 0 = 40 f rezonans frekansı) C üçgen ucu kullanın.
  4. Görüntü sıvı dokunarak modunda bir örnek. Tarama için aşağıdaki görüntüleme parametreleri kullanın: 2 um boyutunu, çözünürlüğü 1024 hatları ve 0.5 bir tarama hızı tarama - 1 Hz (Şekil 2C).
  5. Gerekirse, 29 bağlama DNA mika gücünü artırmak için 10 ul ya da daha fazla 10 mM NiCl 2 'nin çözeltisi ilave edilir.

Streptavidin ile etiketleme 4. Numune Hazırlama

  1. El ile belirli yerlerde kolu şeritler da streptavid bağlamak mümkün biyotin modifikasyon ile, anti-sap şeritlerin, tamamlayıcı olarak dahil edilmiştir, öyle ki 28T dikdörtgen x 24H tasarımÖzellikle de.
    1. Alt üst satırda 14 çini ve 14 çini bir aralama olarak iki nükleotid dizisi (TT) oluşan 3 '17 nükleotid segment ve 15 nükleotid kolu (GGAAGGGATGGAGGA) takarak moleküler tuval değiştirin dikdörtgenin (Şekil 3A) satır sınırını etiketlemek için. Bu dizi, bir 3 'biyotin değiştirilmiş bir anti-kolu telin (TCCTCCATCCCTTCC-biyotin) tamamlayıcıdır.
  2. İç etiketleme için 8 iç çini ve dikdörtgen (Şekil 4A) 6 sınır fayans 3 '17 nükleotid segmentini ekleyin.
    1. 200 nM stok solüsyonu yapmak için 28T dikdörtgen (334 ipliklerini) × 24H komponent ipliklerini geri kalanı ile kolları (sınır etiketleme) ile 28 ipliklerini karıştırın. 200 nM'lik stok solüsyonu elde etmek için 28T dikdörtgen (348 ip kolları) x 24H bileşen şeritlerinin geri kalanı ile kolları 14 ipliklerini (içi etiketleme) karıştırın.
  3. Bo için0.2 - undary etiketleme, 100 uM biyotin değiştirilmiş bir anti-sap şeritlerin 6 ul, 10X dupleksleştirme tamponu A 10 ul, damıtılmış iyonu giderilmiş su içinde 34 ul 0.1 ila şeritlerin 200 nM stok çözeltisi 50 ul ml PCR test tüpü. Bileşen telin nihai konsantrasyonu, 100 nM ve anti-sap biyotin modifiye telin nihai konsantrasyon 6000 nM'dir. Anti-kolu biyotin modifiye iplikçik bağlayıcı olumlu hale getirmek için% 100 aşan yani 28 molekülleri 28T dikdörtgen × 24H için biotin değiştirilmiş iplik bağlamak, anti-kolu olduğunu unutmayın.
  4. Içsel etiketlenmesi için, 0.1 ila şeritlerin 200 nM stok çözeltisi 50 ul 100 uM iç anti-kolu biyotin modifiye telin 3 ul 10X dupleksleştirme tamponu A 10 ul, damıtılmış iyonu giderilmiş su 37 ul - 0.2 ml PCR test tüpü. Bileşen telin nihai konsantrasyonu, 100 nM ve anti-sap biyotin modifi nihai konsantrasyonu ed strand 3000 nM. 28T dikdörtgen yani anti-kolu biyotin modifiye telin × 24H anti-kolu biyotin modifiye iplik bağlama 14 molekülleri bağlayan olumlu hale getirmek için% 100 fazla olduğunu unutmayın.
  5. 2.3 açıklanan adımları kullanılarak 17 saat süre ile, bir termal döngü bölgesindeki her iki numunenin yeniden birleşir.
  6. Adım 2.4 de tarif edildiği gibi bir nativ,% 2 agaroz jel hazırlayın.
  7. Adım 2.5 de tarif edildiği gibi, her iki numune saflaştınlır.
  8. Adım 2.6 de tarif edildiği gibi arzu edilen bir DNA yapılarının konsantrasyonları ölçülür.

Streptavidin Etiketleme için 5. Atomik Kuvvet Mikroskobu

  1. Resim 3. adımda (Şekil 3B ve 4B) 'de tarif edildiği gibi, bir AFM kullanılarak her numune.
  2. Görüntüleme 'nin ilk bölümünde, örnek mi 10 mg streptavidin 1 ul / ardından 1X tavlama tampon A 40 ul ekle. Karışım (Şekil 3C ve 4C) Yeniden görüntüleme başlıyor önce yaklaşık 2 dakika boyunca oturmasına izin verin.
BORSASI "> 6. Bir Tüp Into A Dikdörtgen dönüştürme

  1. Dikdörtgen dayalı bir tüp tasarlamak amacıyla, üst ve alt sıralar hariç yerinde bileşen SSTs tüm tutmak. Kimin SSTs tüp konformasyon (Şekil 5A) orijinal dikdörtgen siklize için kendi sütunların üst ve alt yarı fayans birleştirerek tasarlanan yeni bir satır tanıtın.
  2. Üst ve alt sıralar (336 ip kolları), 200 nM'lik stok solüsyonu elde etmek için dışı 28T dikdörtgen x 24H bileşen bölümleri ile şeritlerin yeni bir satır (14 kol) karıştırın.
  3. 2.7 (Şekil 5B) - jel arıtma 2.2 adımları izleyin.

7. İletim Elektron Mikroskobu Görüntüleme

  1. Bir% 2 sulu uranil format leke solüsyonu hazırlamak için damıtılmış su içinde 3 ml uranil format 0.06 g tartılır. Bir şırıngaya bağlanmış bir 0.2 mikron filtre kullanılarak% 2 sulu uranil format leke çözüm filtreleyin.
    1. 5 ul ekleyin5 N NaOH, süzüldü leke çözeltisi 1 ml. Kısaca 20,000 x g'de çözümü ve santrifüj girdap.
  2. 25 mA, 45 s, 0.1 mBar ve negatif High Tension polaritesi: Glow aşağıdaki ayarlarla karbon kaplı ızgaraları (kaplı tarafı yukarı bakacak şekilde) boşaltın.
  3. Kenarından bir kızdırma deşarj tedavi ızgara kapmak için kendi kendine kapanan forseps kullanın.
  4. 4 dakika süreyle ızgara üzerine örnek 3.5 ul pipetle. Taraftan ızgara ile temas halinde filtre kağıdı getirerek numune kapalı fitilleme filtre kağıdı parçası kullanın.
  5. Hemen 1 dakika süreyle ızgara üzerine leke solüsyonu 3.5 ul ekleyin.
  6. 7.4 gibi leke kapalı fitil ve 1 ızgara karşı filtre kağıdı tutun - 2 dakika.
  7. 10 K 80 K (Şekil 5C) arasında değişen büyütme ile 80 kV işletilen bir JEOL JEM-1400 kullanarak bir TEM numune tutucu ve görüntü ızgara aktarın.

8. Molekül kullanma Keyfi Şekiller oluşturmaar Canvas

  1. Bir şekli belirlemek ve moleküler tuval üzerine şekline karşılık ipliklerini seçin. Örneğin bir üçgen şekli için, moleküler tuval için 206 362 üzerinden ipliklerini seçin.
  2. 10 bir poli-T segment (bu üçgenin hipotenüs boyunca olduğu) maruz etki değiştirin - 11 nükleotid uzunluğunda (Şekil 6A tasarım 1), ya da maruz etki tamamlayıcı bir kenar koruyucusu ekleyin ve bunu sonlandırmak Bir 10-11 nükleotid uzunluğunda poli-T segmenti (Şekil 6A tasarım 2) toplanmayı önlemek için.
    NOT: Sadece (koruyucu ipliklerini kullanmadan) üçgenin piksel karşılık SSTs tavlama toplama ve jel üzerinde farklı ürün grubu oluşumuna yol açacaktır. Daha etkin kaynak olarak çeşitli şekiller için kenar koruyucusu tasarımı kullanın; o (Figür değiştirme tasarımında ilave 14 setleri kıyasla şeritlerin (Şekil 6C) sadece dört ek setleri gerektirire 6B).
  3. Çekirdek seti (362 SST tuval), Set 1 * (Bir SST alanına 1 bağlanan kenar koruyucuları) etki alanına 2 bağlanan, Set 2 * (kenar koruyucuları içeren 310 piksel moleküler tuval için bir iplik kitaplığı oluşturma Bir SST) ve bir SST alanına 3 bağlanan 3 * (kenar koruyucuları) ayarlayın ve Set 4 * (a SST alanına 4) bağlanan kenar koruyucuları 1344 kenar koruyucuları toplam vermek.
  4. Yaklaşık 10 s için farklı setleri için, 96 gözlü plakalar santrifüjleyin. Pipet üzerinden belirli bir şekil için bir stok solüsyonu yapmak için plakalardan arzu edilen şeritler.
    1. Kenar koruyucuları, pipet 2 ml santrifüj içine 1 çekirdek kümesinden 206 iplikçikleri ul, 0 seti 1 * dan, 0 set 2 * dan, sette 3 * 0 ve seti 4 * 24 ipliklerini ile bir üçgen şeklinde İçin Tüp. DNA iplikçiklerinin 400 nM'lik stok çözelti yapmak için tüp damıtılmış iyonu giderilmiş su içinde 20 ul ekle.
  5. DNA stra 400 nM stok solüsyonu 50 ul ekleyin NDS, 10X dupleksleştirme tamponu B, 0.2 mi PCR tüpü (50 mM Tris, pH 7.9, 10 mM EDTA, 125 mM MgCI2) stok çözeltisi, 40 ul distile edilmiş deiyonize H2O içinde 10 ul. Bu 1X tavlama tampon B içinde üçgen bir 100 ul numune yapan (5 mM Tris, pH 7.9, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCI2) lif başına yaklaşık 200 nM arasında bir konsantrasyonda bantlar.
  6. Aşama 2.3 de tarif edildiği gibi, 17 saat, bir termal döngü karışımın tavlanması.
  7. Aşama 2.4 de tarif edildiği gibi bir nativ,% 2 agaroz jel hazırlayın.
  8. Aşama 2.5 de tarif edildiği gibi örnek saflaştınlır.
  9. Adım 2.6 açıklandığı gibi DNA konsantrasyonu ölçün.
  10. Resim 3. adımda (Şekil 7C ve 7D) 'de tarif edildiği gibi AFM altındaki numune.
  11. Seçim ve aynı şerit kitaplığı kullanarak farklı şekiller için ipliklerini karıştırın. Farklı çözümler tavlama ve AFM görüntüleme sırasında zaman kazanmak için farklı şekillerde saflaştırılmış örnekleri birleştirir.
> 9 jove_title "İsteğe bağlı. Şekil Tasarım ve Sıvı Karıştırma Of Robot Otomasyon

  1. Karmaşık şekillerin tasarımını yardımcı olmak için özel bir MATLAB programı kullanın.
  2. Robot, sıvı tutucu bir pipetleme sekansı formunda talimatlar vermek için yazılımı kullanın. Seçin ve hedef şekli oluşturan ipliklerini karıştırmak için robot sıvı işleyicisi kullanın.
    NOT: Şekil tasarımı ve iplik karıştırma insan hatasını azaltmak ve inşaat daha az emek yoğun hale getirmek için otomatik edildi.

10. Dikdörtgenler ve Farklı Ölçekler karşısında Tüpler

  1. Sadece paralel helisler (H) ve helezoni sarımlardan (T) sayısına sayısını değiştirerek farklı boyutlu dikdörtgen (Şekil 10) oluşturmak.
  2. Belirli bir boyut dikdörtgen için Adım 3 uygulayın.
  3. Belirli bir boyut tüp Adım 6 izleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSTs (Şekil 1) kendi kendine düzeneği, Şekil 2'de gösterildiği gibi farklı SSTs için DNA sekansları, streptavidin ile etiketleme sağlamak için optimum / değiştirilebilir., 28T dikdörtgen × 24H verim (Şekil 3 ve 4) arasında, transformasyon olacaktır Bir tüp içine dikdörtgen (Şekil 5), tüpler ve farklı boyutlarda dikdörtgenler (Şekil 10) oluşturmak için SSTs programlanabilir kendinden montaj ve moleküler tuval (Şe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapı oluşumu aşamasında, kendi kendine bir araya DNA nano-DNA şerit karışımı içinde (örn., 15 mM), magnezyum katyonları, uygun bir konsantrasyonunu korumak için önemlidir. Benzer şekilde, agaroz jel karakterizasyonu / saflaştırma aşamasında, uygun bir katyon, magnezyum konsantrasyonunu korumak için önemlidir (örneğin., 10 mM) ile jel elektroforez sırasında DNA nano korumak için jel çalıştıran tamponda. 28T dikdörtgen yapıda x 24H sağlamak için, farklı bir Mg ++ konsantrasyonlarda tavlama tes...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden finansal çıkarları beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Naval Research Genç Araştırmacı Programı Ödülü N000141110914, Naval Research Grant N000141010827 Dairesi, NSF KARİYER Ödülü CCF1054898, NIH Müdürü Yenilikçisi Ödülü 1DP2OD007292 Ofisi ve (PY için) Biyolojik ilham Mühendislik Fakültesi Başlangıç ​​Fonu için bir Wyss Enstitüsü tarafından finanse edildi ve Tsinghua-Pekin (BW) Yaşam Bilimleri Başlangıç ​​Fonu Merkezi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DNA İplikçikleri Entegre DNA TeknolojisiBölüm 3.1
SYBR Güvenli DNA jel lekesiInvitrogenS33102Bölüm 3.4.2
Freeze'N Squeeze DNA Jel Ekstraksiyonu Spin SütunlarıBIO-RAD731-6166Bölüm 3.6
Bruker'in Keskin Nitrür Kolu ProblarıBruker AFM ProblarıSNL10Bölüm 4.3
Safe Imager 2.0 Mavi Işık AydınlatıcıInvitrogenG6600Bölüm 3.6
Santrifüj 5430REppendorf5428 000.414Bölüm 3.6
Transmisyon Elektron Mikroskobu JeolJem 1400Bölüm 7.4
Çok Modlu 8VeecoBölüm 4
Typhoon FLA 9000 Lazer TarayıcıGE Heathcare Yaşam Bilimleri28-9558-08Bölüm 3.5
Ultra saf Damıtılmış suInvitrogen10977-023Bölüm 3.7.1
Mika diskSPI Malzemeleri12001-26-2Bölüm 4.1
Çelik montaj diskiTed Pella, Inc.16218TEM
Elektron Mikroskobu Bilimlerikarbon kaplı bakır ızgaraFCF400-CuBölüm 7.2
cımbızDumont0203-N5AC-POBölüm 7.31
kızdırma deşarj sistemiQuorum TechnologiesK100XBölüm 7.2
DNA Motoru Tetrad 2 Peltier Termal DöngüleyiciBIO-RADPTC– 0240GBölüm 3.3
Baykuş Easycast B2 Mini Jel Elektroforez SistemleriThermoScientificB2Bölüm 3.4.3
Seekam LE Agarose 500GLonza50004Bölüm 3.4.1
GeneRuler 1kb Plus DNA Merdiveni, Kullanıma Hazır 75-20000bpThermoScientificSM1333Bölüm 3.4.4
Nanodrop 2000c UV-vis SpektrofotometreThermoScientificBölüm 3.7
0.2 um filtreCorning Inc.431219Bölüm 7.1.2
için Bölüm 4.1

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seeman, N. C. Nucleic acid junctions and lattices. J. Theor. Biol. 99 (2), 237-247 (1982).
  2. Fu, T. J., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  3. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Rothemund, P. W. K., Papadakis, N., Winfree, E. Algorithmic self-assembly of DNA Sierpinski triangles. PLoS Biol. 2 (12), e424(2004).
  6. Shih, W., Quispe, J., Joyce, G. A 1.7-kilobase single-stranded DNA that folds into a nanoscale octahedron. Nature. 427 (6975), 618-621 (2004).
  7. Chworos, A., et al. Building programmable jigsaw puzzles with RNA. Science. 306 (5704), 2068-2072 (2004).
  8. Park, S. H., et al. Finite-size, fully-addressable DNA tile lattices formed by hierarchical assembly procedures. Angew. Chem. Int. Ed. 45 (5), 735-739 (2006).
  9. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  10. Schulman, R., Winfree, E. Synthesis of crystals with a programmable kinetic barrier to nucleation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 104 (39), 15236-15241 (2007).
  11. He, Y., et al. Hierarchical self-assembly of DNA into symmetric supramolecular polyhedra. Nature. 452 (7184), 198-201 (2008).
  12. Yin, P., et al. Programming DNA tube circumferences. Science. 321 (5890), 824-826 (2008).
  13. Sharma, J., et al. Control of self-assembly of DNA tubules through integration of gold nanoparticles. Science. 323 (5910), 112-116 (2009).
  14. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  15. Andersen, E. S., et al. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).
  16. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  17. Zheng, J. P., et al. From molecular to macroscopic via the rational design of self-assembled 3D. DNA crystal. Nature. 461 (7260), 74-77 (2009).
  18. Han, D., et al. DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space. Science. 332 (6024), 342-346 (2011).
  19. Liu, W., Zhong, H., Wang, R., Seeman, N. C. Crystalline two-dimensional DNA origami arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (1), 264-267 (2011).
  20. Zhao, Z., Liu, Y., Yan, H. Organizing DNA origami tiles into larger structures using preformed scaffold frames. Nano Lett. 11 (7), 2997-3002 (2011).
  21. Woo, S., Rothemund, P. Programmable molecular recognition based on the geometry of DNA nanostructures. Nat. Chem. 3 (8), 620-627 (2011).
  22. Delebecque, C. J., Lindner, A. B., Silver, P. A., Aldaye, F. A. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science. 333 (6041), 470-474 (2011).
  23. Lin, C., Liu, Y., Rinker, S., Yan, H. DNA tile based self-assembly: building complex nanoarchitectures. ChemPhysChem. 7 (8), 1641-1647 (2006).
  24. Seeman, N. C. Nanomaterials based on DNA. Annu. Rev. Biochem. 79 (1), 65-87 (2010).
  25. Voigt, N. V., Nangreave, J., Yan, H., Gothelf, K. V. DNA origami: a quantum leap for self-assembly of complex structures. Chem. Soc. Rev. 40 (12), 5636-5646 (2011).
  26. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex Shapes self-assembled from single stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  27. Wei, B., Wang, Z., Mi, Y. Uniquimer: software of de novo DNA sequence generation for DNA self-assembly: an introduction and the related applications in DNA self-assembly. J. Comput. Theor. Nanosci. 4 (1), 133-141 (2007).
  28. Seeman, N. C. De novo design of sequences for nucleic acid structural engineering. J. Biomol. Struct. Dyn. 8 (3), 573-581 (1990).
  29. Hansma, H. G., Laney, D. E. DNA binding to mica correlates with cationic radius: assay by atomic force microscopy. Biophys. J. 70 (4), 1933-1939 (1996).
  30. Seelig, G., Soloveichik, D., Zhang, D. Y., Winfree, E. Enzyme-free nucleic acid logic circuits. Science. 314 (5805), 1585-1588 (2006).
  31. Yin, P., Choi, H. M. T., Calvert, C. R., Pierce, N. A. Programming biomolecular self-assembly pathways. Nature. 451 (7176), 318-322 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single stranded DNA TilesDNA Nanostructure Self assemblyMolecular Canvas AssemblyNative Agarose Gel ElectrophoresisAtomic Force Microscopy ImagingDNA Strand PurificationThermal Cycler AnnealingEdge Protector DesignDomain Substitution MethodDNA Concentration Measurement

Related Articles