Zebra balığı Keratosit Eksplantlarındaki Deri Yara İyileşmesi Toplu Hücre Göç ve reepithelialization Eğitim için

Özet

Balığı keratositler eksplantlardan hücre tabakaları hareket eder ve epitel yara iyileşmesi bağlamında toplu hücre göçü mekanizmaları üzerinde çalışılması için bir in vitro model sağlar. Bu protokoller detaylı toplu hücre göçü tahlillerde kullanılmak için primer eksplant kültürleri oluşturmak için etkili bir yoldur.

Özet

Dolayı eşsiz hareketli özellikleri, balık keratositler eksplant kültürleri, uzun tek hücre göçü mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır ayrışmış. Motilite hızlı oranları, bir dik aktin kablosu ile geniş aktin-zengin lamel, ve nispeten sabit hız ve: eksplant kurulmuş Ancak, bu hücreler de bireysel göç incelemek için cazip bir model keratositler yapmak birçok özellikleri koruyarak, topluca hareket göç yönü. Erken eksplantlarda, toplu göç edenlerin ayrı ayrı göç hücrelerin hızlı bir ara-geçiş modunu belirlenmesinde hücre-hücre yapışıklıklar rolü çalışma sağlar, ve göç iki mod arasında moleküler bağları vurgulamaktadır. Mezenkimal geçiş bir epitel oluşur ve yara iyileşmesi ve enflamasyon ile ilişkili genlerin farklı ifade olarak daha sonraki eksplantlarda Hücreler hızla ve toplu göç etme yeteneklerini kaybederler. Bu nedenle, keratosit eksplantlar deri yara iyileşmesi sırasında görülen ve gen sentezleme değişikliklerin belirli bir programı kapsamında toplu hücre göçü mekanizmaları incelemek için benzersiz bir sistemi temsil edebilir reepithelialization için bir in vitro model olarak hizmet edebilir. Mutant ve transgenik zebra balığı hatlarının çeşitli mevcuttur eksplantlar, farklı genetik geçmişlerde, balık tesis edilmesi için izin verilmiştir. Bu durum, bu süreçler içinde farklı protein rolü benzersiz tepki verebilir. Burada belirtilen protokoller toplu hücre göçü ile ilgili bir çok analizde kullanım için olan bu eksplant kültürleri oluşturulması için kolay ve etkili bir yöntem tarif eder.

Giriş

Hücre hareketi Çalışmaları geleneksel bireysel göç hücreleri üzerinde odaklanmıştır. Balık ve amfibi Eksplantlardan kültürlü keratositler ^1-6 yaklaşımları deneysel ve matematiksel modelleme hem de kullanılarak hücre hareketi mekanizmaları incelemek için güçlü bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Düzgün bir şekil, hız, yön ve korurken bireysel göç hücreleri üzerinde deneysel çalışmalar, hücrelerin hızlı, pürüzsüz kayma hareketi ile destekli olduğunu. Özellikle embriyojenez, yara iyileşmesi, ve metastaz sırasında, hücre-hücre kavşaklar muhafaza Bununla birlikte, in vivo koşullarında, hücreler sık sık birlikte hareket eder. Böylece, toplu hücre göçü, hücre göçü alanında araştırma büyüyen ve giderek daha belirgin bir alandır. Bu hücrelerin toplu göç son zamanlarda ⁷ tarif edilmiştir ve bunun bir yara iyileşmesi modelinde toplu hücre göçü çalışmak için güçlü bir sistem yapmak birçok benzersiz özelliklere sahiptir.

ove_content "> terazi Anestezi uygulanmış yetişkin bir zebrabalıkları koparılan zaman, bir epitel doku ölçek alt bağlı kalır. hücre kültür ortamı eklenir, bu epitel hücreleri veya keratositler, ölçekli bir toplu birim olarak daha hızlı göç ederler. The, eksplant kültürü hücreleri sağlam bir epitel yeniden kurmak için yatağı bir yaranın geçici matris boyunca olduğu gibi eksplant uzak göç olduğu bir epitel yara iyileşmesi modeli olarak görülebilir. Son veriler göstermektedir bu ex vivo kültür taklit birçok özellikleri olduğunu in vivo yetişkin zebrafish yaranın iyileşmesini. Yara kapatma oranları ⁸ ex vivo sistemde ⁷ gözlenen benzer bir göç hızına çevirmek. Ayrıca, bir in vivo yara iyileşme modeli, warfarin ile tedavi hemostaz oranı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir hidrokortizon tedavisi bağışıklık yanıtı azaltmak için ise şifa, reepithelialization ⁸ gecikme değil sup. Ölçek hayvan çıkarıldığında Zebra balığı kanama değil gibi, hemostaz önemli bir oyuncu değil. Biz eksplantlarda bağışıklık hücrelerini bulduk rağmen, biz onlar kolektif hücre göçü üzerinde olabilir etkileri incelenmiştir değil.

Burada sunulan protokol birçok biyolojik tahlillerde kullanılmak için tutarlılık ve yeniden üretilebilirlik sağlamak zebra balığı keratosit eksplant kültürleri oluşturulması anlatılmaktadır. Bu eksplant kültürler çeşitli nedenlerle toplu hücre göçü için in vitro model özellikle zorlayıcı. İlk olarak, zebra balığı keratositler eksplant kültürleri oluşturulması saat içinde kullanılan primer hücrelerdir. Bu nedenle, bu hücreler, birincil hücrelerin ^9-13 geçişi ile ilişkili morfolojik ve gen ifadesi değişikliklerini geçirmiş değil. İkinci olarak, bu sistem, yaralanma karşısında, mezenkimal tr bir epitel bir parçası olarak, ¹⁴ yaralama yanıt olarak reepithelialization çalışma için bir modeli temsil eder vegen ekspresyonunda değişiklikler ve sitoskeletal yeniden düzenlemeler ^14,15 ile kanıtlandığı gibi ansition (EMT) işlemi başlatılır. Böylece, işlenmemiş hücrelerde meydana gen ifadesi ve hareketlilik arka plan değişiklikleri ile karakterize ve tedavi değişiklikleri yorumlamak için bir bağlam sağlamak edilmiştir. Ayrıca, balık keratosit ve insan keratinosit işlevsel olarak eşdeğer olan; her ikisi de kendi türlerinin birincil epitelyum hücreleri ve epitel yara iyileşmesinde önemli bir rol oynar. Üçüncü olarak, yetişkin zebrabalıkları melanom ve diğer kanserler ^{19-21, 8,14} ve doku rejenerasyonu ^22-24 iyileşme deri yara dahil olmak üzere insan hastalıklarının ^16-18 çeşitli için bir model sistem olarak tanıma kazanıyor.

Bu model, sistemin teknik avantajları eşit zorlayıcı. Mutant ve transgenik hatları giderek artan sayıda kar amacı gütmeyen, merkezi tesisleri mevcuttur. Özellikle, Zebra balığı Mutasyon Projesi (SMN) Wellcome Trust Sanger Enstitüsü Zebra balığı genomunda geni kodlama her protein bir nakavt alel yaratmayı amaçlamaktadır. Şu anda, bu özelliği, 24.088 allel ile, 11892 gen, genomun yaklaşık olarak% 45 mutasyona uğramış. Buna ek olarak, SMN önerilerini kabul ve ücretsiz knock-çıkışları üretecektir. Larva ve ergin zebrabalıkları ^25-28 gen demonte son yöntemler transgenik yaklaşımlar sorunlu ya da pratik olduğu için gelişimsel olarak önemli genlerin fonksiyonunu incelemek için esneklik sağlar.

~ 145 mm / saat motilite onların son derece hızlı oranları nedeniyle kısa bir süre kültürlerin ²⁹ kurulmasından sonra, tahliller (genellikle 24 saat ya da daha az) hızla tamamlanabilir. Deneyler hızla tamamlandı ve kültürler, oda sıcaklığında iyi bir video mikroskobu ile ilgili memeli hücre göçü tahlilleri önlenir ile ilgili teknik engeller birkaç büyümesi gibi. Buna ek olarak, araştırma bütçeleri sıkma çağında, zebrafish kolay ve masrafsız korunur.

eksplant yapısı ve davranışları karmaşık. Ölçek çıkarıldığında balık kanama yok gibi, yüzeysel epidermal katmanlar daha fazla ölçek ile kaldırılır olası değildir. Hücrelerinin büyük bir çoğunluğu, bir anti-E-kaderin antikoru ¹⁴ leke görüldüğünden ölçekler ilk balık kaldırıldığında keratosit eksplant baskın hücre tipi olduğu görülmektedir. Ayrıca, bağışıklık ¹⁴ vimentin boyanma olmaması ile değerlendirildiği gibi, ilk kültür fibroblastların bir kanıt yoktur. Ancak, tekrarlanan ölçekli kaldırılması ile, eksplant sayısız nötrofiller olduğu görülmektedir (Videoyu 1). LPS'ye maruz Biz, büyüklükleri, hızlı bir şekilde hareketliliği ve hücre zarının dışına göçlerine morfolojik gözlemlerine dayanarak nötrofiller gibi bu hücreleri belirledik (veriler gösterilmemiştir). Buna ek olarak, bu hücreler, parlak wit lekenötrofil sitosolik faktörü gibi olan kendi yüzeyi üzerinde bol FcR'yi olduğunu gösterir ikincil IgG antikorları, çeşitli için bir antikor (veriler gösterilmemiştir) h. Çoklu hücre tabakaları eksplant içinde mevcut. Konfokal mikroskopi altında, üstünde, ve hücre keratosit levhalar arasındaki görünür nötrofiller ölçeğin yanında keratositlerin ikiden daha fazla katman için öncü kenarında tek bir tabaka mevcudiyetini ortaya koymaktadır.

Erken zaman noktalarında, ~ 145 mm / saat başlangıç ​​fiyatla eksplantından keratositlerin toplu göç başlatan çok katmanlı eksplant polarize kenarında hücreler. Eksplant tarafından kaplanan alan hızla artar tabaka içinde, gerilim yayılan hücreye giden ve ön kenarın önceden bir azalma oranı. Lider ve takipçi hücreleri arasındaki hızlı dönüşümleri tabaka ⁷ içinde kendiliğinden oluşan deliklerin oluşumu ve kapatılması sırasında önde gelen kenarında görülmektedir. OlarakEksplant ile başlatılan EMT süreç sac parçaları ve keratositler kendi uzmanlık, hızlı hareketliliği kaybetmek, devam ediyor. Gen ifadesi ve EMT ile uyumlu morfolojik değişiklikler, yara iyileşmesi ve inflamatuar yanıtlar eksplant yaklaşık 10 gün ¹⁴ için geçerli kabul ediliyor kültür 7 gün içinde ortaya çıkar.

Protokol

Bu protokol laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için AVMA Hayvan Refahı İlkelerine uygun ve Ortabatı Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

Anestezi, Ekipman, & Medya 1. Hazırlık

1. Ticari deklor ajan (evcil hayvan mağazalarında mevcuttur) veya 24 saat su standı sağlayarak kullanarak musluk suyu yaklaşık 1.5 L Klorsuzlaşmaz. Üç 1 L beher edinin ve su dechlorinated 500 ml her doldurunuz. Herhangi bir prosedür önce balık tutmak için bir ve kurtarma için bir Etiket. Üçüncü bir behere, tricaine metansülfonat, 100 ug / ml eklemek; Bu balık anestezi edilecektir beher olur.
2. Kültür ortamı sıcak buzla sığ kabını (RPMI 1640,% 10 FBS (fetal inek serumu), 50 ug / ml gentamisin, 100 ug / ml kanamisin, 25 mM HEPES), oda sıcaklığına kadar, ve temiz kuyumcu cımbız toplamak. Immer tarafından temiz cımbız% 70 etanol ipuçlarını şarkı ve etanol yakmak için izin, bir Bunsen beki geçer.
3. 10X büyütme, ya da mikroskop (kişisel tercihinize tamamen bağımlı) diseksiyon - prosedür 2 ile ticari, masa üstü ışıklı büyüteç, büyütme olmadan yapılacaktır karar verin.

2. Eksplantasyon Kültürler kurulması

1. Bir tutma beher balık ve yerin istenilen sayıda yakalayın. Anestezi beher tek bir balık aktarın; tek tek balık uyutmak için en iyisidir.
2. Balık yüzme ve solungaç hareketi gözlemleyerek anestezi etkilerini izlemek. Anestezi ilerledikçe, solungaç hareketi yavaşlar ve balık kararsız ve sık sık baş aşağı yüzmek olacak; en kısa sürede solungaç hareketi durur gibi anestezi balık düşünün. Bu balığın ölümüne neden olabilir anestezi banyosunda daha uzun süre balık bırakmayın.
3. Anestezi beher ve transfer balık kaldırbuz, cımbız tutan eli karşı karşıya kuyruk yatay balık yerleştirerek. Tekniği ile ve eğer deneyimli, birden fazla balık, eksplantlar yapmak şu anda anestezi çanak içinde bir sonraki balık yerleştirerek dikkate kullanılacak.
4. Ölçekler kaldırmak için, pozisyon cımbız ölçekte kenarında ucu ile balık paralel. Ölçek balık vücuttan yükseltmesine neden biraz balık yan içine cımbız düz tarafı basın. Doku kültürü çanak cımbız, koparmak, ve (inversiyon olmadan) yer ölçeği kavrayın. Solungaç bölge, yan çizgi, ve yüzgeçleri kaçınarak, (her iki tarafta 6) Büyük bir yetişkin 12 ölçeklerde maksimum kaldırma prosedürü tekrarlayın.
5. Kurtarma beher içine balık yerleştirin ve anestezi etkisinden kurtarır sağlamak için monitör. Şu anda, balık bağımsız bir tanka geri aktarılabilir. Balık tam ölçekli rejenerasyonu için izin en az 21 gün süreyle kurtarmak için izin verin.
6. Bağlı olarakcam alt çanak başına 6 ölçeklerde - deneysel tasarım, plastik 35 mm doku kültürü ile tedavi çanak başına 20 ölçekler ya da 4 kadar koyun. Ölçekler çanak ölçekler ayırmak için değil şekilde yavaşça ortamı eklemeden önce çanak uymak için izin verin.
   NOT: Ortam ilk çanak eklenmeden önce tecrübesi ile, birden fazla balık işlenebilir.
7. Her 35 mm çanak içine tam ortam (yukarıda 1.2) 1.2 ml ekleyin.
8. Tercihen ya da ilave işlem olmadan, istenen zaman süresi için% 5 _CO2 içinde 28 ° C 'de eksplant kültürleri inkübe edin. Alternatif olarak, bir ısıtmalı mikroskop sahnede veya video mikroskopi için canlı hücre kültür odası içinde kültürleri kuluçkaya yatmaktadır.

3. aydınlık ve video mikroskobu

1. Başlangıçta mikroskop sahneye hücre tabakaları içeren ve Pozisyon yemekleri 4X objektif lens kullanarak odak.
   Not: Daha yüksek büyütme deneye bağlı olarak kullanılabilir. Yerini İşaretlemeHer hücre sac ve / veya sahnede çanak yönü yaklaşık aynı yönde levhalar ile zamanla görüntüleri alarak kolaylaştıracaktır.
2. Her deney protokole göre, çeşitli zaman noktalarında kuvöz ve fotoğraftan yemekleri çıkarın ve yalnızca hareketsiz görüntüler deneysel bir zaman dilimi içinde gerekirse kuvöz içine geri yerleştirin.
3. Video mikroskobu yerine getirirken, aşağıdaki dikkat:
   1. Göç hücre sac videonun süresi için görüş alanında kalacak şekilde görüş alanı içinde ölçek / gelişmekte olan hücre tabakasını yerleştirin.
      NOT: Bu hücreler ölçek altında göç nasıl gözlemleyerek biraz tecrübe alabilir. Kısa videolar için, bu uzun videolar için daha endişe azdır.
   2. Kısa zaman dilimlerinde için oda sıcaklığında inkübe edilir. Daha uzun zaman aralıklarında (18 + saat) için, ısıtılmış bir aşama ya da tutulması için bir inkübasyon odası, pH dengesini kullanın ve kültür m buharlaşmasını en aza indirmek içinedium.

İmmünofloresan Mikroskopi için 4. Tespit

1. Hazırlayın ve 28 ° C ön-sıcak tüm çözümler. , Floresan altında keratosit görüntülemek cam alt 35 mm doku kültür kaplarına kullanılarak yukarıda tarif edildiği gibi eksplant kültürleri büyümesi için. Alternatif olarak, cam haznesi slaytlar kullanın.
2. Her bir tabağa 1.1x PBS içinde% 4 paraformaldehid, 0.8 ml ilave edilir. İlk kültür ortamını çıkarmayın. 5 dakika sonra çözeltinin ayrılması için aspire oda sıcaklığında inkübe edin.
3. Her bir tabağa 1.1x PBS içinde% 4 paraformaldehid, 0.8 ml ilave edilir. 5 dakika sonra çözeltinin ayrılması için aspire oda sıcaklığında inkübe edin.
4. 1X PBS içinde 0.5 ml% 0.2 Triton X-100 eklenmesi ile dışındaki ligandları ya da dış epitopu Permeabilize hücreler kullanılarak edilmiştir. 5 dakika sonra çözeltinin ayrılması için aspire oda sıcaklığında inkübe edin.
5. 1x PBS içinde 0.5 mi% 1 BSA ilave edin ve (4 ° C'de) 1 (oda sıcaklığında) saat veya O / N inkübe edin.
   Not: Deneysel koşullara göre, phalloidin bu aşamada eklenebilir.
6. Inkübasyondan sonra, aspirat çözüm kaldırmak ve antikor boyama ile devam edin. 4 ° C 'de 4 hafta - 3 1x PBS içinde% 1 BSA ve 2 ml - Alternatif olarak, en azından 1 eklenerek kültür kaplarına saklayın.

5. İmmünofloresan Protokolü

1. Üreticinin önerilerine göre primer ve sekonder antikor çözümleri hazırlayın.
   Not: üretici önerileri mevcut değilse, (1x PBS içinde% 1 BSA içinde), birincil antikor iyi bir başlangıç ​​dilüsyonu 1: poliklonal 500 ve 1: monoklonal antikorlar için 1000; ikincil antikorlar için iyi bir başlangıç ​​dilüsyonu 1: 1000. Sinyal güçlü ve arka bir sorun olup olmadığını sinyal düşük, zayıfsa yüksek üreticinin elde edilen orijinal stokunun bu dilüsyonlarını ayarlayın.
2. 1x PBS çözeltisi içinde% 1 BSA aspire. Primer antikor solüsyonu, 0.5 ml ilave edilir ve (4 ° C) ya da O / N (oda sıcaklığında) 1 saat süre ile inkübe edilir.
3. Birincil antikor çözeltisini çıkarın yer temiz halinde ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü etiketli ve -20 ° C'de dondurun.
   Not: Gerekirse bu primer antikor yeniden kullanım için sağlar.
4. Kaldırma ve her yıkamadan sonra PBS atarak, 1x PBS ile 5 kez - çanak 3 yıkayın.
5. Ikinci antikor çözeltisi, 0.5 ml ilave edilir. Arzu edildiği takdirde, bu aşama sırasında (bir üreticinin tavsiye edilen konsantrasyon sonrasında) floresan işaretlenmiş falloidinle ekleyin. (4 ° C'de) ya da O / N (oda sıcaklığında) 1 saat süreyle inkübe edin.
   NOT: Kullanımı falloidin floresan etiketli aktin filamentler görselleştirme sağlar; Biz 488-işaretlenmiş falloidinle eden zebra balığı keratositlerde en uygun olduğu bulunmuştur, fakat diğer flüoroforlar kullanılabilir.
6. Çıkarın ve ikincil antikor çözüm atın.
7. Kaldırma ve her yıkamadan sonra PBS atarak, 1x PBS ile 5 kez - çanak 3 yıkayın.
   Not: çanak 4 ° C vie tutulamazsa, ışıktan gelen kapalı saklanabilirhemen a; Emin 1x PBS hücreleri ama sıcak RT kurumasına değil emin olmak için saklamadan önce çanak içine ilave edilir olun (20-30 dk), sonra hemen önce bir sonraki adıma geçmeden için PBS kaldırmak.
8. Çanak içine, deneysel ihtiyaçlarına bağlı olarak, ya da DAPI olmadan, bir montaj orta 3 damla ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin - hazır gözlemlemek için zaman, 2 ekleyin.
   NOT: DAPI ile bir ticari olarak temin edilebilen, gliserol tabanlı bir montaj ortamı, ancak diğer montaj ortam da kullanılabilir. Çanak oturup montaj orta 10 dakika izin çanak altından cam lamel kolayca çıkarılmasına olanak.
9. Inkübasyondan sonra, yavaşça gevşetin ve lamel kaldırmak için çanak tarafta sıkmak. Slayt üzerine, aşağı, hücreler cam slayt üzerine montaj medya ek damla ekleyin ve lamel yerleştirin.
   NOT: - 2 gün slayt daha uzun 1 tutulması gerekiyorsa açık tırnak cilası kullanarak slayt lamel sızdırmazlık düşünün.
10. Bir floresan mikroskop altında slayt gözlemleyin.
    NOT: Bizim görüntülerin çoğu petrol daldırma altında 40X veya 63X objektif lens kullanarak alınmıştır, ancak belirli objektif deneysel protokol bağlıdır kullanılır.

Sonuçlar

Şekil 1 'de gösterildiği gibi, keratositlerin yaprak eksplant kültürünü kurma saat içinde ölçek altında dışarı doğru yer değiştiren gözlenebilir. Bazen, toplu göç levha koptuğunu bir bireysel göç keratosit görülebilir. Eksplant önce koparıp olan bir balık kurulmuştur Buna ek olarak, tabaka içinden göç bol nötrofiller bulunmaktadır. Uzun kültür dönemlerde, hücreler gibi keratosit sac parçaları EMT ¹⁴ uğrarlar.

sac ilerleme başlangıç ​​hızı çok hızlı olduğunu ancak ...

Tartışma

kültür ortamı ilavesinden önce 3 dk - keratosit eksplant kültürünün başarısı için en kritik adım ölçeği yaklaşık 2 için kültür çanak uymak için izin veriyor. Yaklaşık ölçek% 75 yapışır ve (her bir deney için kurulan kültürlerin sayısı buna göre ayarlanması gerekir) yaprak artacak. Keratosit yaprak balık çıkarıldı ve çeşitli nedenlerle kültüre yerleştirilmiştir, her ölçek çevresinde oluşturmazlar. İlk olarak, eksplant DAPI boyama bazı ölçekler birkaç hücre bağlı olduğunu ortaya koymaktadır ve bu nedenle bu ölçekler kerat...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
35 mm Cam Tabanlı Kültür Kapları (Poly-D Lizin Kaplı)	MatTek	P35GC-1.5-14-C	1,5 mm kalınlık lamel çıkarma için en iyisidir. 14 mm çap daha fazla kültür alanı sağlar.
İsviçreli Kuyumcular Tarzı Forseps, Integra, Miltex 17-303	VWR	21909-460	Dar, ince forsepslerin kireç çıkarma için en iyi sonucu verdiğini görüyoruz.