Listeria monocytogenes Kullanarak Enfekte Farelerde Kültür ve Kalp Kolonizasyonunda Kardiyak Hücrelerin Bakteriyel İstilasının Değerlendirilmesi

Özet

Listeria monocytogenes gebelerde fetal enfeksiyonlara ve duyarlı popülasyonlarda menenjite neden olur. Bakterilerin subpopulasyonları kalp dokusunu kolonize ederek hastalarda ve laboratuvar hayvanlarında miyokarditlere neden olabilir. Burada L. monocytogenes kardiyak hücre invazyonunun in vitro ve enfekte hayvanlarda kardiyak kolonizasyonun nasıl değerlendirileceğini açıklayan bir protokol sunuyoruz.

Özet

Listeria monocytogenes, immün sistemi baskılanmış hastalarda, yaşlılarda ve hamile kadınlarda ciddi invaziv enfeksiyonlara neden olabilecek gram pozitif bir fakülte içi patojendir. İnsanlarda listeriosis'in en yaygın belirtileri menenjit, ensefalit ve fetal kürtajdır. İnvaziv L. monocytogenes enfeksiyonunun önemli ama çok daha az belgelenmiş bir sekel kalbi içerir. Kardiyak hastalıktan ölüm oranı tedaviye rağmen% 35'e kadar olabilir, ancak L. monocytogenes kardiyak dokunun kolonizasyonu ve bunun sonucunda ortaya çıkan patolojileri hakkında çok az şey bilinmektedir. Ek olarak, son zamanlarda L. monocytogenes'in subpopulasyonlarının kalp dokusu içinde istila etme ve büyüme kapasitesine sahip olduğu ortaya çıktı. Bu protokol, L. monocytogenes izolatlarının kardiyotropizmini değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo yöntemleri ayrıntılı olarak açıklar. Doku kültüründe H9c2 sıçan kardiyak miyoblastların enfeksiyonu ve enfekte farelerin kalplerinin bakteriyel kolonizasyonunun belirlenmesi için yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler sadece enfekte hayvanlarda kardiyak dokuyu kolonize etme potansiyeline sahip suşları tanımlamak için yararlı değildir, aynı zamanda kalp hücresi istilasını artırmaya ve / veya kalp patolojislerindeki değişiklikleri yönlendirmeye yarayan bakteriyel gen ürünlerinin tanımlanmasını da kolaylaştırabilir. Bu yöntemler ayrıca birden fazla L. monocytogenes suşu arasında kardiyotropizmin doğrudan karşılaştırılmasına da neden olabilir.

Giriş

Listeria monocytogenes, yaşlılar, hamile kadınlar, HIV/ AIDS'li kişiler ve kemoterapi alan kişiler de dahil olmak üzere duyarlı popülasyonlarda ağır hastalığa neden olabilecek gram-pozitif hücre içi patojendir^1. Bu popülasyonlardaki enfeksiyon sıklıkla kontamine gıda ürünlerinin yutulması sonucu ortaya çıkan bir şeydir ve çoğu enfeksiyon büyük ölçekli gıda kaynaklı salgınlarla ilişkilidir^2,3. İnsanlarda ve diğer memelilerde, L. monocytogenes ince bağırsağın epitel sınırından geçiş yapabilir ve daha sonra karaciğere taşınabilir^4,5. Hayvan modelleri, yutulan bakterilerin bağırsak villi içinde çoğaldığını ve portal damar....

Protokol

1. L. monocytogenes Suşları için Depolama ve Kültür Koşulları

1. Beyin-kalp infüzyon agarını (BHI) otoklayarak ve erimiş ortamı petri plakalarına dökerek katı ortam hazırlayın. Plakaların oda sıcaklığında gece kurumasını bekleyin, sonra 37 °C'de tekrar geceleme.
2. Steril bir döngü kullanarak, daha önce yapılmış dondurucu stoklarından (BHI sıvı ortamlarında% 20 gliserolde askıya alınan bakteriler, -80 ° C'de depolanan) veya daha önce izolasyon için vurulan kolonileri içeren bir agar plakasından küçük bir L. monocytogenes örneği alın.
3. Aseptik tekniği kullanarak, tek koloni izolasyonu için örneği çizgiye çekin. Fazla taşımayı ön....

Sonuçlar

L. monocytogenes'in seçilmiş izolatları, hücre kültüründe ve enfeksiyonun fare modellerinde kardiyak hücrelerin gelişmiş istilası sergiler. Şekil 1, agar ortamlarındaki süspansiyonların nokta kaplamasının ardından bakteri kolonilerinin nasıl görünebileceğine dair bir örnek göstermektedir. Bu yöntem, çok sayıda agar ortam plakası kullanmadan bir örnek içindeki CFO'ların doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Şekil 2, 10403S zorlanmasının kalp hücrelerini istila etme yetene.......

Tartışma

L. monocytogenes, bir dizi farklı hastalık tezahürüne neden olabilecek yaygın ve iyi karakterize bir insan patojenidir¹⁵. Bakteri daha önce, sırasıyla merkezi sinir sistemine ve gelişmekte olan fetüse ulaşmak ve kolonileştirmek için kan-beyin bariyeri ve plasental-fetal bariyerler gibi bariyerler arasında geçiş yapabilme yeteneği ile tanımlanmıştır. Organizmanın bu dokuları kolonize etme in vivo yeteneği genellikle hedeflenen organları oluşturan kültürdeki temsili hücreleri istila etmek için .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Difco	BHI Et Suyu Tabanı	237200	2 kg Beyin Kalp İnfüzyon tozu (agarsız)
Difco	Agar	214510	2 kg Granül Agar
Difco	BHI Agar	241810	2 kg Beyin Kalp İnfüzyon Tozu in vitrojen içinde %7,5 Agar LB
	Et Suyu Tabanı	12975-084	2 kg Luria Et Suyu Baz Tozu (agarsız)
Fisher	Glass Lameller	12-545-80	12 mm cam lameller
Falcon	24 oyuklu Doku Kültürü Plakası	35-3047	24 kuyulu, Plazma ile işlenmiş Doku Kültürü Plakası
Falcon	14mL Polistiren tüp	352051	14 ml Polistiren tüpler
Falcon	96 oyuklu U-alt plaka	35-3077	Doku kültürü ile tedavi edilmemiş 96 oyuklu plaka
Corning	%0,05 Tripsin, 0,53 mM EDTA (1X)	25-052-CI	Doku kültürü için Tripsin EDTA'nın stok çözeltisi
Corning	DMEM (Yüksek glikoz, yüksek piruvat)	15-013-CU	FBS, glutamin veya antibiyotik içermeyen DMEM ortamı
Corning	Pen / Strep / Glut Çözeltisi	30-009-CI	Doku kültürü için penisilin, streptomisin ve L-glutamin stok karışımı
Corning	Gentamisin	30-005-CR	Doku kültürü için 50 mg / ml Gentamisin stok çözeltisi
Cellgro (Corning)	L-Glutamin	25005197	Stok Antibiyotiksiz L-glutamin çözeltisi
Denville	75cm^2 Şişe	T1225	75 cm2 doku kültürü ile muamele edilmiş şişe
Denville	1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri	2013004	1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri
ATCC	H9c2 Kardiyak Miyoblastlar	CRL-1446	Sıçan kardiyak miyoblastları
Hyclone	Fetal Sığır Serumu	SH30070.63	Fetal Sığır Serumu